Les chaperonines sont des chaperonnes moléculaires indispensables pour le repliement de certaines protéines dans les cellules. La taille et la complexité de ces machineries biologiques rendent complexes l'étude de leurs propriétés structurales et fonctionnelles. La spectroscopie RMN permet de suivre des changements structuraux et dynamiques en temps réel avec une résolution atomique. Cependant, l'étude par RMN de protéines ou de complexes de haut poids moléculaires a été un challenge pendant de nombreuses années. Dans la première partie de cette thèse, il a été montré que la combinaison de marquage spécifique des groupements méthyles, d'expériences RMN optimisées et de microscopie électronique peut être utilisée pour suivre différents états du cycle fonctionnel d'une chaperonine de 1 MDa. Pour étudier ce mécanisme, la chaperonine native a été reconstituée avec un marquage des groupements méthyles des méthionines et valines. Les résidus méthionines ont pu être utilisés comme des sondes pour identifier les spectres RMN correspondant aux états intermédiaires et aux espèces actives du cycle fonctionnel. Grâce à ces sondes il a été possible de suivre en temps réel les réarrangements structuraux correspondant aux différentes conformations de la chaperonine durant son cycle fonctionnel. La seconde partie traite de la caractérisation de l'interaction de la chaperonine avec une protéine cliente dépliée. L'observation de la stabilisation de l'état déplié de la protéine par la chaperonine a permis de mettre en évidence une activité de "holdase" de la chaperonine. En utilisant une combinaison astucieuse de différents marquages de groupements méthyles et d'expériences RMN optimisés pour des assemblages de haut poids moléculaire, il a été possible d'observer le repliement de cette protéine par la chaperonine et les effets de la présence d'une protéine dépliée sur le cycle fonctionnel de la chaperonine en action. / Chaperonins are essential molecular chaperons for the refolding of proteins in the cells. Size and complexity of these biological machineries make complex the study of their structural and functional properties. NMR spectroscopy offers an unique ability to monitor structural and dynamic changes in real-time and at atomic resolution. However, the NMR studies of large proteins and complexes has been a real challenge for a long time. In the first part of this thesis, it has been shown that the combination of methyl specific labeling, optimized NMR spectroscopy for large assemblies and electron microscopy can be used to monitor the different states of the functional cycle of a 1 MDa chaperonin. To study this mechanism, the native chaperonin was reconstituted with a labeling of the methionines and valines methyl groups. Methionines residues have been used as probes to identify the NMR spectra corresponding to intermediates states and active species of the functional cycle. Thanks to theses probes, it has been possible to follow in real time the structural rearrangements corresponding to the different conformations of the chaperonin during its functional cycle. The second part deals with the characterization of the interaction between the chaperonin and an unfolded protein. Observation of the stabilization of the unfolded protein by the chaperonin allowed to identify the holdase activity of the chaperonin. Using a clever combination of a differential methyl labeling and optimized NMR spectroscopy for large assemblies, it has been possible to follow the refolding of the unfolded protein by the chaperonin and the effects of the unfolded protein on the functional cycle of the chaperonin in action.

Ce travail de thèse porte sur le développement de méthodes en spectrométrie de masse (MS) et mobilité ionique (IM-MS) supramoléculaires pour la caractérisation fine de complexes protéine-ligand et d’assemblages protéiques hétérogènes de hauts poids moléculaires. L’optimisation instrumentale apportée à l’étude de ces systèmes, permet d’étendre le potentiel de ces deux approches en biologie structurale. Le criblage de complexes protéine-ligand permet ici une détermination de leurs propriétés d’interaction et la mise en évidence de subtils changements de conformation induits, pouvant être suivis au cours du temps. L’application de ce couplage à l’analyse de complexes multi-protéiques, réfractaires aux techniques conventionnelles, donne accès à la topologie de ces assemblages, facilitant la proposition de modèles structuraux. Enfin, l’apport récent de la haute résolution en MS native est ici illustré à travers l’étude de protéines complexes et hétérogènes : les anticorps thérapeutiques et leurs conjugués. Ces développements permettent de repousser certaines limites en MS native et IM-MS native, élargissant leurs perspectives d’application dans la recherche et l’industrie pharmaceutique. / This PhD thesis aims at developing methods in native mass spectrometry (MS) combined with ion mobility (IM-MS) to characterize protein-ligand complexes and large protein assemblies. Fine-tuning of instrumental settings allowed expanding the scope of these approaches in structural biology. Real-time monitoring of protein-ligand complexes by native MS and IM-MS enabled to screen their binding properties while depicting subtle conformational changes induced upon binding. Applying these methods to refractory multi-protein complexes provided insights about their topology, making structural modeling easier. Finally, benefits from high-resolution native MS were highlighted through the characterization of heterogeneous systems, including monoclonal antibodies and their drug conjugates. Here, these developments enable to push some technical limits one step forward, increasing the potential of native MS and IM-MS both in academic research and pharmaceutical industry.