Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' disease, is a water born pathogenic bacteria commonly found in natural and manmade water systems such as rivers, lakes, wet soil, hot and cold water storage systems (being able to survive at temperatures between 6-63 °C, and proliferating between 20-45 °C), showerheads, cooling towers and spa pools. The main pathway of exposure to Legionella is by inhaling the aerosols containing the microorganism. Legionnaires' disease can be fatal if not diagnosed and treated at the right time. Practical Legionella control starts with a risk assessment of the water system and followed by the regular monitoring and water sampling. UK Health and Safety Executive (HSE) have implemented strict legislations to protect the public from Legionnaires' disease. This research highlights and addresses three major data gaps identified in Legionella control and management strategy employed in the UK and worldwide; namely, (i) the underestimation of microbiological threat in current cold water storage sampling strategy, (ii) the inability of current qPCR diagnostic methods to detect live Legionella in water samples, and (iii) the lack of predictive 'risk management system' for Legionella control in domestic water systems. During my PhD, 15 relevant cold water storage tanks (selected from more than 6000 tanks surveyed at different sites located in different London Boroughs) were used to investigate the risk factors that contribute towards Legionella proliferation, and revealed serious shortcomings in the appropriateness of the water sample taken for regulatory testing. Secondly, molecular biology research was carried out to develop an accurate, reliable and rapid testing method for the detection and quantification of live Legionella using qPCR techniques. This was successfully achieved by extracting RNA from a Legionella lenticule, converting the RNA into cDNA and amplifying the cDNA using qPCR techniques. Finally, regular monitoring data from 120 London buildings (60 known to be Legionella positive and 60 known to be Legionella negative) was used to identify the possible risk factors contributing towards Legionella outbreaks. Data for these factors was then used to develop a predictive risk model for Legionella contamination using Principal Component Analysis (PCA). The model was validated with 66 new London buildings and 9 out of London buildings. The model showed 100% accuracy in predicting the risk of Legionella by distinguishing infected and non-infected sites in London as well as for the sites in out of London.

Introdução: O diagnóstico microbiológico da infecção por Legionella é complexo, pois a bactéria não é visualizada à coloração de Gram no escarro, e sua cultura não é realizada na maioria dos laboratórios clínicos. A imunofluorescência direta nas secreções respiratórias tem baixa sensibilidade, em torno de 40% e a técnica da “PCR” não é ainda recomendada para o diagnóstico clínico (CDC, 1997). A detecção de anticorpos no soro é a técnica mais utilizada, e o critério definitivo é a soroconversão para no mínimo 1:128, cuja sensibilidade é de 70 a 80% (Edelstein, 1993). Como critérios diagnósticos de possível pneumonia por Legionella, eram utilizados: título único de anticorpos a L pneumophila positivo na diluição 1:256, em paciente com quadro clínico compatível (CDC, 1990) e o achado de antígeno a Legionella na urina (WHO, 1990). Nos últimos anos, porém, com o uso crescente do teste de antigenúria, foram detectados casos de pneumonia por Legionella, que não eram diagnosticados por cultura ou sorologia, tornando-o método diagnóstico de certeza para o diagnóstico de pneumonia por Legionella (CDC, 1997). Por sua fácil execução, resultado imediato, e alta sensibilidade - de 86% a 98% (Kashuba & Ballow, 1986; Harrison & Doshi, 2001), tem sido recomendado para o diagnóstico das PAC que necessitam internação hospitalar (Mulazimoglu & Yu, 2001; Gupta et al., 2001; Marrie, 2001), especialmente em UTI (ATS, 2001). Vários estudos documentaram baixo valor preditivo positivo do título único positivo de 1:256, tornando-o sem valor para o diagnóstico da pneumonia por Legionella, exceto, talvez, em surtos (Plouffe et al., 1995). Outros detectaram alta prevalência de anticorpos positivos na diluição 1:256 na população, em pessoas normais (Wilkinson et al., 1983; Nichol et al., 1991). A partir de 1996, o CDC de Atlanta recomendou que não seja mais utilizado o critério de caso provável de infecção por Legionella pneumophila por título único de fase convalescente ≥1:256, por falta de especificidade(CDC, 1997). A pneumonia por Legionella é raramente diagnosticada, e sua incidência é subestimada. Em estudos de PAC, a incidência da pneumonia por Legionella nos EUA, Europa, Israel e Austrália, foi estimada entre 1% a 16% (Muder & Yu, 2000). Nos EUA, foi estimado que cerca de 8 000 a 23 000 casos de PAC por Legionella ocorrem anualmente, em pacientes que requerem hospitalização (Marston et al., 1994 e 1977). No Brasil, a incidência de PAC causadas por Legionella em pacientes hospitalizados é tema de investigação pertinente, ainda não relatado na literatura. Objetivo: detectar a incidência de pneumonias causadas por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, em pacientes que internaram no Hospital de Clínicas de Porto Alegre por PAC, por um ano. Material e Métodos: o delineamento escolhido foi um estudo de coorte (de incidência), constituída por casos consecutivos de pneumonia adquirida na comunidade que internaram no HCPA de 19 de julho de 2000 a 18 de julho de 2001. Para a identificação dos casos, foram examinados diariamente o registro computadorizado das internações hospitalares, exceto as internações da pediatria e da obstetrícia, sendo selecionados todos os pacientes internados com o diagnóstico de pneumonia e de insuficiência respiratória aguda. Foram excluídos aqueles com menos de 18 anos ou mais de 80 anos; os procedentes de instituições, HIV-positivos, gestantes, pacientes restritos ao leito; e portadores de doença estrutural pulmonar ou traqueostomias. Foram excluídos os pacientes que tivessem tido alta hospitalar nos últimos 15 dias, e aqueles já incluídos no decorrer do estudo. Os pacientes selecionados foram examinados por um pesquisador, e incluídos para estudo se apresentassem infiltrado ao RX de tórax compatível com pneumonia, associado a pelo menos um dos sintomas respiratórios maiores (temperatura axilar > 37,8ºC, tosse ou escarro; ou dois sintomas menores (pleurisia, dispnéia, alteração do estado mental, sinais de consolidação à ausculta pulmonar, mais de 12 000 leucócitos/mm3). O estudo foi previamente aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa do HCPA. Os pacientes eram entrevistados por um pesquisador, dando seu consentimento por escrito, e então seus dados clínicos e laboratoriais eram registrados em protocolo individual. Não houve interferência do pesquisador, durante a internação, exceto pela coleta de urina e de sangue para exame laboratoriais específicos da pesquisa. Os pacientes eram agendados, no ambulatório de pesquisa, num prazo de 4 a 12 semanas após sua inclusão no estudo, quando realizavam nova coleta de sangue, RX de tórax de controle, e outros exames que se fizessem necessários para esclarecimento diagnóstico.Todos os pacientes foram acompanhados por 1 ano, após sua inclusão no estudo.Foram utilizadas a técnica de imunofluorescência indireta para detecção de anticorpos das classes IgG, IgM e IgA a Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6 no soro, em duas amostras, colhidas, respectivamente, na 1ª semana de internação e depois de 4 a 12 semanas; e a técnica imunológica por teste ELISA para a detecção do antígeno de Legionella pneumophila sorogrupo 1 na urina, colhida na primeira semana de internação. As urinas eram armazenadas, imediatamente após sua coleta, em freezer a –70ºC, e depois descongeladas e processadas em grupos de cerca de 20 amostras. A imunofluorescência foi feita no laboratório de doenças Infecciosas da Universidade de Louisville (KY, EUA), em amostras de soro da fase aguda e convalescente, a partir da diluição 1:8; e a detecção do antígeno de Legionella pneumophila sorogrupo 1, nas amostras de urina, foi realizada no laboratório de pesquisa do HCPA, pelos investigadores, utilizando um kit comercial de teste ELISA fabricado por Binax (Binax Legionella Urinary Enzyme Assay, Raritan, EUA). As urinas positivas eram recongeladas novamente, para serem enviadas para confirmação no mesmo laboratório americano, ao fim do estudo. Foram adotados como critérios definitivos de infecção por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, a soroconversão (elevação de 4 vezes no título de anticorpos séricos entre o soro da fase aguda e da fase convalescente para no mínimo 1:128); ou o achado de antígeno de L pneumophila sorogrupo 1 na urina não concentrada, numa razão superior a 3, conforme instruções do fabricante e da literatura.Os pacientes foram classificados, de acordo com suas características clínicas, em 1º) portadores de doenças crônicas (doenças pulmonares, cardíacas, diabete mellitus, hepatopatias e insuficiência renal); 2º) portadores de doenças subjacentes com imunossupressão; 3º) pacientes hígidos ou com outras doenças que não determinassem insuficiência orgânica. Imunossupressão foi definida como esplenectomia, ser portador de neoplasia hematológica, portador de doença auto-imune, ou de transplante; ou uso de medicação imunossupressora nas 4 semanas anteriores ao diagnóstico (Yu et al., 2002b); ou uso de prednisolona 10 mg/dia ou equivalente nos últimos 3 meses (Lim et al., 2001). As características clínicas e laboratoriais dos pacientes que evoluíram ao óbito por pneumonia foram comparados àquelas dos pacientes que obtiveram cura. Para a análise das variáveis categóricas, utilizou-se o teste qui-quadrado de Pearson ou teste exato de Fisher. Para as variáveis numéricas contínuas, utilizou-se o teste “t“ de Student. Um valor de p< 0,05 foi considerado como resultado estatisticamente significativo (programas SPSS, versão 10). Foi calculada a freqüência de mortes por pneumonia na população estudada, adotando-se a alta hospitalar como critério de cura. Foi calculada a incidência cumulativa para pneumonia por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, em um hospital geral, no período de 1 ano. Resultados: durante um ano de estudo foram examinados 645 registros de internação, nos quais constavam, como motivo de baixa hospitalar, o diagnóstico de pneumonia ou de insuficiência respiratória aguda; a maioria desses diagnósticos iniciais não foram confirmados. Desses 645 pacientes, foram incluídos no estudo 82 pacientes, nos quais os critérios clínicos ou radiológicos de pneumonia foram confirmados pelos pesquisadores. Durante o acompanhamento desses pacientes, porém, foram excluídos 23 pacientes por apresentarem outras patologias que mimetizavam pneumonia: DPOC agudizado (5), insuficiência cardíaca (3), tuberculose pulmonar (2), colagenose (1), fibrose pulmonar idiopática (1), edema pulmonar em paciente com cirrose (1), somente infecçâo respiratória em paciente com sequelas pulmonares (4); ou por apresentarem critérios de exclusão: bronquiectasias (4), HIV positivo (1), pneumatocele prévia (1). Ao final, foram estudados 59 pacientes com pneumonia adquirida na comunidade, sendo 20 do sexo feminino e 39 do sexo masculino, com idade entre 24 e 80 anos (média de 57,6 anos e desvio padrão de ±10,6). Tivemos 36 pacientes com doenças subjacentes classificadas como “doenças crônicas”, dos quais 18 pacientes apresentavam mais de uma co-morbidade, por ordem de prevalência: doenças pulmonares, cardíacas, diabete mellitus, hepatopatias e insuficiência renal; neoplasias ocorreram em 9 pacientes, sendo sólidas em 7 pacientes e hematológicas em 2. Dos 59 pacientes, 61% eram tabagistas e 16,9%, alcoolistas. Do total, 10 pacientes apresentavam imunossupressão. Dos demais 13 pacientes, somente um era previamente hígido, enquanto os outros apresentavam tabagismo, sinusite, anemia, HAS, gota, ou arterite de Takayasu. A apresentação radiológica inicial foi broncopneumonia em 59,3% dos casos; pneumonia alveolar ocorreu em 23,7% dos casos, enquanto ambos padrões ocorreram em 15,2% dos pacientes. Pneumonia intersticial ocorreu em somente um caso, enquanto broncopneumonia obstrutiva ocorreu em 5 pacientes (8,5%). Derrame pleural ocorreu em 22% dos casos, e em 21 pacientes (35%) houve comprometimento de mais de um lobo ao RX de tórax. Foram usados beta-lactâmicos para o tratamento da maioria dos pacientes (72,9%9). A segunda classe de antibióticos mais usados foi a das fluoroquinolonas respiratórias, que foram receitadas para 23 pacientes (39,0%), e em 3º lugar, os macrolídeos, usados por 11 pacientes (18,6%). Apenas 16 pacientes não usaram beta-lactâmicos, em sua maioria recebendo quinolonas ou macrolídeos. Dos 43 pacientes que usaram beta-lactâmicos, 25 não usaram nem macrolídeos, nem quinolonas. Em 13 pacientes as fluoroquinolonas respiratórias foram as únicas drogas usadas para o tratamento da pneumonia. Do total, 8 pacientes foram a óbito por pneumonia; em outros 3 pacientes, o óbito foi atribuído a neoplasia em estágio avançado. Dos 48 pacientes que obtiveram cura, 33 (68,7%) estavam vivos após 12 meses. Os resultados da comparação realizada evidenciaram tendência a maior mortalidade no sexo masculino e em pacientes com imunossupressão, porém essa associação não alcançou significância estatística. Os pacientes que usaram somente beta-lactâmicos não apresentaram maior mortalidade do que os pacientes que usaram beta-lactâmicos associados a outras classes de antibióticos ou somente outras classes de antibióticos. Examinando-se os pacientes que utiizaram macrolídeos ou quinolonas em seu regime de tratamento, isoladamente ou combinados a outros antibióticos, observou-se que também não houve diferença dos outros pacientes, quanto à mortalidade. Os pacientes com padrão radiológico de pneumonia alveolar tiveram maior mortalidade, e essa diferença apresentou uma significância limítrofe (p= 0,05). Nossa mortalidade (11,9%) foi similar à de Fang et al. (1990), em estudo clássico de 1991 (13,7%); foi também similar à média de mortalidade das PAC internadas não em UTI (12%), relatada pela ATS, no seu último consenso para o tratamento empírico das PAC (ATS, 2001). Foram detectados 3 pacientes com pneumonia por Legionella pneumophila sorogrupo 1 na população estudada: 2 foram diagnosticados por soroconversão e por antigenúria positiva, e o 3º foi diagnosticado somente pelo critério de antigenúria positiva, tendo sorologia negativa, como alguns autores (McWhinney et al., 2000). Dois pacientes com PAC por Legionella não responderam ao tratamento inicial com beta-lactâmicos, obtendo cura com levofloxacina; o 3º paciente foi tratado somente com betalactâmicos, obtendo cura. Conclusões: A incidência anual de PAC por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, no HCPA, foi de 5,1%, que representa a incidência anual de PAC por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6 em um hospital geral universitário. Comentários e Perspectivas: Há necessidade de se empregar métodos diagnósticos específicos para o diagnóstico das pneumonias por Legionella em nosso meio, como a cultura, a sorologia com detecção de todas as classes de anticorpos, e a detecção do antígeno urinário, pois somente com o uso simultâneo de técnicas complementares pode-se detectar a incidência real de pneumonias causadas tanto por Legionella pneumophila, como por outras espécies. A detecção do antígeno de Legionella na urina é o teste diagnóstico de maior rendimento, sendo recomendado seu uso em todas as PAC que necessitarem internação hospitalar (Mulazimoglu & Yu, 2001; Gupta et al., 2001); em todos os pacientes com PAC que apresentarem fatores de risco potenciais para legionelose (Marrie, 2001); e para o diagnóstico etiológico das pneumonias graves (ATS, 2001). Seu uso é indicado, com unanimidade na literatura, para a pesquisa de legionelose nosocomial e de surtos de legionelose na comunidade. / Introduction: Legionella infections are difficult to diagnose, because the bacteria is not seen at Gram stain and the sputum culture is not performed at most laboratories. Besides that, the direct fluorescent fluorescent antibody test of respiratory secretion has low sensitivity (40%) and detection by PCR techiques is still not recommended for clinical diagnosis (CDC, 1997). The most used test is antibody detection by immunofluorescence technique or by ELISA, with a demonstration of fourfold or greater rise in the reciprocal immunofluorescente antibody (IFA) titer to greater than or equal to 1:128 against Legionella pneumophila serogroup 1 between paired acute-and convalescent-phase serum specimens, which sensitivity ranges between 70 - 80% (Edelstein, 1993).Case definitions for Legionnaires´disease agreed that patients with pneumonia who have positive results in urinary antigen assays or positive results in the direct fluorescent antibody (DFA) staining of respiratory secretions, had “probable” or presumptive” disease (WHO; 1990), as well as those who have single antibody titers of ≥1:256 (CDC, 1990). The Legionella urinary antigen test have been increasingly used in the last years, showing patients with positive results despite of negative culture tests or non-diagnostic serologies. Since then, the urinary antigen test has became a valuable tool in the prompt diagnosis of Legionnaires´disease, and also a definitive criterion for the diagnosis of Legionella pneumonias (CDC, 1997). Due to its high sensitivity, in the range of 86% to 98% (Kashubba & Ballow, 1986; Harrison & Doshi, 2001), it has been recommended to the diagnosis of community-acquired pneumonia which requires hospitalization (Mulazimoglu & Yu, 2001; Gupta et al, 2001), mainly in the ICU (ATS, 2001). Concerning to the “presumptive” criterion of single antibody title of 1:256, in the absence of seroconversion, it was concluded that it shall not be used except in the outbreak setting, since it has been reported to have low predictive value (Plouffe et al, 1995); and has also low specificity (CDC, 1997), since it has been reported high prevalence of positive antibodies at 1:256 in healthy populations (Wilkinson et al, 1983; Nichol et al, 1991). Legionnaires´disease is markedly undiagnosed, either its incidence underestimated. In several studies of CAP conducted in the USA, Europe, Israel and Australia the proportion of pneumonias caused by Legionella has ranged from 1% to 16% (Muder & Yu, 2000). In USA, the incidence of Legionella CAP in patients requiring hospitalization is estimated between 8000 to 23 000 cases per year (Marston et al, 1994 ; Marston et al, 1997). Such incidence in Brazil has not yet been estimated, being an important issue to study Objective : our goal is to detect the incidence of Legionella CAP in patients requiring hospitalization for a year, at the HCPA. Material and Methods: a cohort study ( an incidence study) of adult patients with CAP who were hospitalized for one year ( from 2000-2001) at HCPA. All patients with age 18≥80 were screened for study entry except: residents in institutions, those disabled to walk, those who had been discharged from hospital in the last 15 days; either pregnant women, HIV-positives, or patients with estructural lung diseases (bronchiectasis, cistic fibrosis) or tracheostomized. Admission logs were screened daily from Monday trough Friday (including the ones who had been hospitalized in the week-end) by the researchers. Patients with an admission diagnosis either of pneumonia or acute respiratory failure were evaluated daily by the researchers, and enrolled if they had a Chest X-Ray taken within 48 hours of admission revealing a new infiltrate consistent with pneumonia and at least 1 of the following “ major criteria” : fever (axillary temperature ≥37,8ºC), cough, or sputum; or 2 of the following “minor criteria”: dyspnea, abnormal mental status, signs of consolidation by examination, pleuritic chest pain or abnormal white blood cell count (> 12.000/cm3 or band forms > 4 % ). Information about risk factors, symptoms and outcome was collected through interview and medical chart review. Urine and serum samples were collected from consenting individuals during the acute fase at the hospital. After discharge, they came to the research ambulatory to consultation 4 to 12 weeks after patient enrollment, when the research doctor asked a new Chest X-Ray and serum sample of the convalescent phase to antibody test, along with other necessary exams. All the survivors were followed for a whole year after their inclusion in the study. Acute and convalescent sera were stored at – 70ºC and sent in dry ice (in a “batch”) to the Infectious Diseases laboratory of University of Louisville ( KY, USA), where they were tested by indirect immunofluorescent assay to IgG, IgM, and IgA antibodies to L pneumophila serogroups1-6, starting at dilution of 1:8. It was used a kit test manufactured by Zeus Scientific, Inc (Raritan, NJ, USA). All the urine samples collected were immediately frozen at –70ºC to be further tested in batches, at the Research lab of HCPA, by the investigators, with a commercial EIA kit test manufactured by Binax (BINAX Legionella Urinary Enzyme Assay). The positive ones were refrozen and further sent in a “batch” to the American laboratory, to be retested by the same kit test. Patients were diagnosed as having definite infection by L pneumophila serogroups 1-6 either if they had a 4-fold rise in antibody titer to at least 1:128 or greater dilution; or if they had positive urinary antigen, performed at our lab as recommended by the manfacturer and by the literature. A comparison was made between the patients who died and the survivors, regarding his clinical and laboratory features. Testing procedures to detect significant differences between groups included the Pearson chi-squared test or Fisher exact tests for categorical variables and Student´s t-test for continuous variables. Associations were considered statistically significant if the p value was < 0,05, using a 2-tailed test (SPSS program, version 10). Death by pneumonia was definite as the patient who died primarily due to the worsening of his lung sickness; thus, was calculated the frequency of deaths in our population. Patients who improved and were discharged, were classified as “cured”. Finally, we calculated the cumulative incidence of CAP caused by Legionella pneumophila serogroups 1-6 in a general hospital, for a year. Results: during a whole year, from 645 hospital admission logs with the diagnosis of pneumonia or acute respiratory failure screened, only 82 cases of CAP were obtained. During the follow up in the hospital or ambulatory, 23 patients were excluded either because Chest X-Ray failed to show a new pulmonary infiltrate (5 patients), alternative diagnosis were made (COPD, 5 patients; heart failure, 3; tuberculosis, 2; colagenosis, 1; idiopathic pulmonary fibrosis, 1). Aditional 6 patients revealed exclusion criteria as being HIV positive (1 patient), to have bronchiectasis (4) or pneumatocele (1). Thus, 59 patients constituted the final study group, being each patient enrolled only once. The mean age was 57,6 years (ranging from 24 to 80), being 20 women and 39 men. Most of them ( 36 patients, 61%) had chronic underlying diseases; half of them had more than one disease, being more prevalent: lung diseases, heart diseases, diabete mellitus, liver diseases and renal failure. Regular cigarette smokers represented 61% of the total, and alcohhol intake, 16,9%. Cancer ocurred in 9 patients, being solid organ malignancy in 7 and haematologic malignancy in 2. From our 59 patients, 10 were classified as immunossupressed, defined as splenectomy, haematological malignancy, autoimmune disease, transplant recipient, cancer chemotherapy within 4 weeks (Yu et al, 2002), or prednisolone use ≥10 mg/day (or equivalent), for at least 3 months before admission (LIM et al, 2001). In the remaining 13 patients, only one was previously healthy, while the others had sinusitis, anemia, hypertension, or other mild diseases. At admission, Chest X-Ray showed intersticial pneumonia in only one patient; bronchopneumonia in 59,3% and airspace pneumonia in 23,7%, while both patterns ocurred concomitantly in 15,2%. Obstructive pneumonia (Fang et al, 1990) ocurred in 5 patients with lung cancer. Pleural effusion ocurred in 22%, and in 21 patients (35%) the presentation was multilobar.The antibiotic class most used were beta-lactams, in 72,9% of the patients. The remaining received at most respiratory quinolones and macrolides. From the group that used beta-lactams, 25 patients did not use either quinolones or macrolides.There were not statistic differences in mortality regarding age, sex, or treatment between the groups who received beta-lactams alone versus the group that received macrolides or respiratory quinolones. The only significant association ocurred between radiographic pattern of airspace pneumonia and greater mortality (p= 0,05). In this study 3 patients had pneumonia caused by Legionella pneumophila serogroup 1: 2 patients had seroconversion and positive antigen urinary test; the third patient had a positive urinary antigen with negative serologies, like some authors (McWHINNEY et al, 2000). The former two patients worsened with beta-lactams, prescribed before the etiological diagnosis, getting resolution of their pneumonia with levofloxacin; the third one used only beta-lactams, getting cure. There were 7 deaths for pneumonia, and 4 deaths for cancer. From 48 survivors, 33 patients (68,7%) were alive after 12 months. Our mortality rate (13,5%) is similar to the one reported in the literature (ATS, 2001). Conclusions: the incidence of hospitalized CAP by Legionella pneumophila serogroups 1-6 in our hospital in the year 2000-2001 was 5,1%, which represents the annual incidence of Legionnaires´ disease in a general hospital of South Brazil. Comments and perspectives: complementary diagnostic methods like culture, serologies to detection of all classes of immunoglobulins and urinary antigen tests shall be used to detect infections by Legionella in our country to detect the real incidence of pneumonias caused by Legionella species. At the moment, the Legionella antigen test has the greatest yeld among the available tests. It is recommended to all hospitalized PAC patients (Mulazimoglu &Yu, 2001; Gupta et al, 2001); and also to all patients who have potential risk factors for legionellosis (Marrie, 2001), as well as to the etiological diagnosis of severe pneumonias (ATS, 2001). Its use is recommended, with unanimity, to the diagnosis of community and nosocomial outbreaks.

Introdução: O diagnóstico microbiológico da infecção por Legionella é complexo, pois a bactéria não é visualizada à coloração de Gram no escarro, e sua cultura não é realizada na maioria dos laboratórios clínicos. A imunofluorescência direta nas secreções respiratórias tem baixa sensibilidade, em torno de 40% e a técnica da “PCR” não é ainda recomendada para o diagnóstico clínico (CDC, 1997). A detecção de anticorpos no soro é a técnica mais utilizada, e o critério definitivo é a soroconversão para no mínimo 1:128, cuja sensibilidade é de 70 a 80% (Edelstein, 1993). Como critérios diagnósticos de possível pneumonia por Legionella, eram utilizados: título único de anticorpos a L pneumophila positivo na diluição 1:256, em paciente com quadro clínico compatível (CDC, 1990) e o achado de antígeno a Legionella na urina (WHO, 1990). Nos últimos anos, porém, com o uso crescente do teste de antigenúria, foram detectados casos de pneumonia por Legionella, que não eram diagnosticados por cultura ou sorologia, tornando-o método diagnóstico de certeza para o diagnóstico de pneumonia por Legionella (CDC, 1997). Por sua fácil execução, resultado imediato, e alta sensibilidade - de 86% a 98% (Kashuba & Ballow, 1986; Harrison & Doshi, 2001), tem sido recomendado para o diagnóstico das PAC que necessitam internação hospitalar (Mulazimoglu & Yu, 2001; Gupta et al., 2001; Marrie, 2001), especialmente em UTI (ATS, 2001). Vários estudos documentaram baixo valor preditivo positivo do título único positivo de 1:256, tornando-o sem valor para o diagnóstico da pneumonia por Legionella, exceto, talvez, em surtos (Plouffe et al., 1995). Outros detectaram alta prevalência de anticorpos positivos na diluição 1:256 na população, em pessoas normais (Wilkinson et al., 1983; Nichol et al., 1991). A partir de 1996, o CDC de Atlanta recomendou que não seja mais utilizado o critério de caso provável de infecção por Legionella pneumophila por título único de fase convalescente ≥1:256, por falta de especificidade(CDC, 1997). A pneumonia por Legionella é raramente diagnosticada, e sua incidência é subestimada. Em estudos de PAC, a incidência da pneumonia por Legionella nos EUA, Europa, Israel e Austrália, foi estimada entre 1% a 16% (Muder & Yu, 2000). Nos EUA, foi estimado que cerca de 8 000 a 23 000 casos de PAC por Legionella ocorrem anualmente, em pacientes que requerem hospitalização (Marston et al., 1994 e 1977). No Brasil, a incidência de PAC causadas por Legionella em pacientes hospitalizados é tema de investigação pertinente, ainda não relatado na literatura. Objetivo: detectar a incidência de pneumonias causadas por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, em pacientes que internaram no Hospital de Clínicas de Porto Alegre por PAC, por um ano. Material e Métodos: o delineamento escolhido foi um estudo de coorte (de incidência), constituída por casos consecutivos de pneumonia adquirida na comunidade que internaram no HCPA de 19 de julho de 2000 a 18 de julho de 2001. Para a identificação dos casos, foram examinados diariamente o registro computadorizado das internações hospitalares, exceto as internações da pediatria e da obstetrícia, sendo selecionados todos os pacientes internados com o diagnóstico de pneumonia e de insuficiência respiratória aguda. Foram excluídos aqueles com menos de 18 anos ou mais de 80 anos; os procedentes de instituições, HIV-positivos, gestantes, pacientes restritos ao leito; e portadores de doença estrutural pulmonar ou traqueostomias. Foram excluídos os pacientes que tivessem tido alta hospitalar nos últimos 15 dias, e aqueles já incluídos no decorrer do estudo. Os pacientes selecionados foram examinados por um pesquisador, e incluídos para estudo se apresentassem infiltrado ao RX de tórax compatível com pneumonia, associado a pelo menos um dos sintomas respiratórios maiores (temperatura axilar > 37,8ºC, tosse ou escarro; ou dois sintomas menores (pleurisia, dispnéia, alteração do estado mental, sinais de consolidação à ausculta pulmonar, mais de 12 000 leucócitos/mm3). O estudo foi previamente aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa do HCPA. Os pacientes eram entrevistados por um pesquisador, dando seu consentimento por escrito, e então seus dados clínicos e laboratoriais eram registrados em protocolo individual. Não houve interferência do pesquisador, durante a internação, exceto pela coleta de urina e de sangue para exame laboratoriais específicos da pesquisa. Os pacientes eram agendados, no ambulatório de pesquisa, num prazo de 4 a 12 semanas após sua inclusão no estudo, quando realizavam nova coleta de sangue, RX de tórax de controle, e outros exames que se fizessem necessários para esclarecimento diagnóstico.Todos os pacientes foram acompanhados por 1 ano, após sua inclusão no estudo.Foram utilizadas a técnica de imunofluorescência indireta para detecção de anticorpos das classes IgG, IgM e IgA a Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6 no soro, em duas amostras, colhidas, respectivamente, na 1ª semana de internação e depois de 4 a 12 semanas; e a técnica imunológica por teste ELISA para a detecção do antígeno de Legionella pneumophila sorogrupo 1 na urina, colhida na primeira semana de internação. As urinas eram armazenadas, imediatamente após sua coleta, em freezer a –70ºC, e depois descongeladas e processadas em grupos de cerca de 20 amostras. A imunofluorescência foi feita no laboratório de doenças Infecciosas da Universidade de Louisville (KY, EUA), em amostras de soro da fase aguda e convalescente, a partir da diluição 1:8; e a detecção do antígeno de Legionella pneumophila sorogrupo 1, nas amostras de urina, foi realizada no laboratório de pesquisa do HCPA, pelos investigadores, utilizando um kit comercial de teste ELISA fabricado por Binax (Binax Legionella Urinary Enzyme Assay, Raritan, EUA). As urinas positivas eram recongeladas novamente, para serem enviadas para confirmação no mesmo laboratório americano, ao fim do estudo. Foram adotados como critérios definitivos de infecção por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, a soroconversão (elevação de 4 vezes no título de anticorpos séricos entre o soro da fase aguda e da fase convalescente para no mínimo 1:128); ou o achado de antígeno de L pneumophila sorogrupo 1 na urina não concentrada, numa razão superior a 3, conforme instruções do fabricante e da literatura.Os pacientes foram classificados, de acordo com suas características clínicas, em 1º) portadores de doenças crônicas (doenças pulmonares, cardíacas, diabete mellitus, hepatopatias e insuficiência renal); 2º) portadores de doenças subjacentes com imunossupressão; 3º) pacientes hígidos ou com outras doenças que não determinassem insuficiência orgânica. Imunossupressão foi definida como esplenectomia, ser portador de neoplasia hematológica, portador de doença auto-imune, ou de transplante; ou uso de medicação imunossupressora nas 4 semanas anteriores ao diagnóstico (Yu et al., 2002b); ou uso de prednisolona 10 mg/dia ou equivalente nos últimos 3 meses (Lim et al., 2001). As características clínicas e laboratoriais dos pacientes que evoluíram ao óbito por pneumonia foram comparados àquelas dos pacientes que obtiveram cura. Para a análise das variáveis categóricas, utilizou-se o teste qui-quadrado de Pearson ou teste exato de Fisher. Para as variáveis numéricas contínuas, utilizou-se o teste “t“ de Student. Um valor de p< 0,05 foi considerado como resultado estatisticamente significativo (programas SPSS, versão 10). Foi calculada a freqüência de mortes por pneumonia na população estudada, adotando-se a alta hospitalar como critério de cura. Foi calculada a incidência cumulativa para pneumonia por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, em um hospital geral, no período de 1 ano. Resultados: durante um ano de estudo foram examinados 645 registros de internação, nos quais constavam, como motivo de baixa hospitalar, o diagnóstico de pneumonia ou de insuficiência respiratória aguda; a maioria desses diagnósticos iniciais não foram confirmados. Desses 645 pacientes, foram incluídos no estudo 82 pacientes, nos quais os critérios clínicos ou radiológicos de pneumonia foram confirmados pelos pesquisadores. Durante o acompanhamento desses pacientes, porém, foram excluídos 23 pacientes por apresentarem outras patologias que mimetizavam pneumonia: DPOC agudizado (5), insuficiência cardíaca (3), tuberculose pulmonar (2), colagenose (1), fibrose pulmonar idiopática (1), edema pulmonar em paciente com cirrose (1), somente infecçâo respiratória em paciente com sequelas pulmonares (4); ou por apresentarem critérios de exclusão: bronquiectasias (4), HIV positivo (1), pneumatocele prévia (1). Ao final, foram estudados 59 pacientes com pneumonia adquirida na comunidade, sendo 20 do sexo feminino e 39 do sexo masculino, com idade entre 24 e 80 anos (média de 57,6 anos e desvio padrão de ±10,6). Tivemos 36 pacientes com doenças subjacentes classificadas como “doenças crônicas”, dos quais 18 pacientes apresentavam mais de uma co-morbidade, por ordem de prevalência: doenças pulmonares, cardíacas, diabete mellitus, hepatopatias e insuficiência renal; neoplasias ocorreram em 9 pacientes, sendo sólidas em 7 pacientes e hematológicas em 2. Dos 59 pacientes, 61% eram tabagistas e 16,9%, alcoolistas. Do total, 10 pacientes apresentavam imunossupressão. Dos demais 13 pacientes, somente um era previamente hígido, enquanto os outros apresentavam tabagismo, sinusite, anemia, HAS, gota, ou arterite de Takayasu. A apresentação radiológica inicial foi broncopneumonia em 59,3% dos casos; pneumonia alveolar ocorreu em 23,7% dos casos, enquanto ambos padrões ocorreram em 15,2% dos pacientes. Pneumonia intersticial ocorreu em somente um caso, enquanto broncopneumonia obstrutiva ocorreu em 5 pacientes (8,5%). Derrame pleural ocorreu em 22% dos casos, e em 21 pacientes (35%) houve comprometimento de mais de um lobo ao RX de tórax. Foram usados beta-lactâmicos para o tratamento da maioria dos pacientes (72,9%9). A segunda classe de antibióticos mais usados foi a das fluoroquinolonas respiratórias, que foram receitadas para 23 pacientes (39,0%), e em 3º lugar, os macrolídeos, usados por 11 pacientes (18,6%). Apenas 16 pacientes não usaram beta-lactâmicos, em sua maioria recebendo quinolonas ou macrolídeos. Dos 43 pacientes que usaram beta-lactâmicos, 25 não usaram nem macrolídeos, nem quinolonas. Em 13 pacientes as fluoroquinolonas respiratórias foram as únicas drogas usadas para o tratamento da pneumonia. Do total, 8 pacientes foram a óbito por pneumonia; em outros 3 pacientes, o óbito foi atribuído a neoplasia em estágio avançado. Dos 48 pacientes que obtiveram cura, 33 (68,7%) estavam vivos após 12 meses. Os resultados da comparação realizada evidenciaram tendência a maior mortalidade no sexo masculino e em pacientes com imunossupressão, porém essa associação não alcançou significância estatística. Os pacientes que usaram somente beta-lactâmicos não apresentaram maior mortalidade do que os pacientes que usaram beta-lactâmicos associados a outras classes de antibióticos ou somente outras classes de antibióticos. Examinando-se os pacientes que utiizaram macrolídeos ou quinolonas em seu regime de tratamento, isoladamente ou combinados a outros antibióticos, observou-se que também não houve diferença dos outros pacientes, quanto à mortalidade. Os pacientes com padrão radiológico de pneumonia alveolar tiveram maior mortalidade, e essa diferença apresentou uma significância limítrofe (p= 0,05). Nossa mortalidade (11,9%) foi similar à de Fang et al. (1990), em estudo clássico de 1991 (13,7%); foi também similar à média de mortalidade das PAC internadas não em UTI (12%), relatada pela ATS, no seu último consenso para o tratamento empírico das PAC (ATS, 2001). Foram detectados 3 pacientes com pneumonia por Legionella pneumophila sorogrupo 1 na população estudada: 2 foram diagnosticados por soroconversão e por antigenúria positiva, e o 3º foi diagnosticado somente pelo critério de antigenúria positiva, tendo sorologia negativa, como alguns autores (McWhinney et al., 2000). Dois pacientes com PAC por Legionella não responderam ao tratamento inicial com beta-lactâmicos, obtendo cura com levofloxacina; o 3º paciente foi tratado somente com betalactâmicos, obtendo cura. Conclusões: A incidência anual de PAC por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, no HCPA, foi de 5,1%, que representa a incidência anual de PAC por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6 em um hospital geral universitário. Comentários e Perspectivas: Há necessidade de se empregar métodos diagnósticos específicos para o diagnóstico das pneumonias por Legionella em nosso meio, como a cultura, a sorologia com detecção de todas as classes de anticorpos, e a detecção do antígeno urinário, pois somente com o uso simultâneo de técnicas complementares pode-se detectar a incidência real de pneumonias causadas tanto por Legionella pneumophila, como por outras espécies. A detecção do antígeno de Legionella na urina é o teste diagnóstico de maior rendimento, sendo recomendado seu uso em todas as PAC que necessitarem internação hospitalar (Mulazimoglu & Yu, 2001; Gupta et al., 2001); em todos os pacientes com PAC que apresentarem fatores de risco potenciais para legionelose (Marrie, 2001); e para o diagnóstico etiológico das pneumonias graves (ATS, 2001). Seu uso é indicado, com unanimidade na literatura, para a pesquisa de legionelose nosocomial e de surtos de legionelose na comunidade. / Introduction: Legionella infections are difficult to diagnose, because the bacteria is not seen at Gram stain and the sputum culture is not performed at most laboratories. Besides that, the direct fluorescent fluorescent antibody test of respiratory secretion has low sensitivity (40%) and detection by PCR techiques is still not recommended for clinical diagnosis (CDC, 1997). The most used test is antibody detection by immunofluorescence technique or by ELISA, with a demonstration of fourfold or greater rise in the reciprocal immunofluorescente antibody (IFA) titer to greater than or equal to 1:128 against Legionella pneumophila serogroup 1 between paired acute-and convalescent-phase serum specimens, which sensitivity ranges between 70 - 80% (Edelstein, 1993).Case definitions for Legionnaires´disease agreed that patients with pneumonia who have positive results in urinary antigen assays or positive results in the direct fluorescent antibody (DFA) staining of respiratory secretions, had “probable” or presumptive” disease (WHO; 1990), as well as those who have single antibody titers of ≥1:256 (CDC, 1990). The Legionella urinary antigen test have been increasingly used in the last years, showing patients with positive results despite of negative culture tests or non-diagnostic serologies. Since then, the urinary antigen test has became a valuable tool in the prompt diagnosis of Legionnaires´disease, and also a definitive criterion for the diagnosis of Legionella pneumonias (CDC, 1997). Due to its high sensitivity, in the range of 86% to 98% (Kashubba & Ballow, 1986; Harrison & Doshi, 2001), it has been recommended to the diagnosis of community-acquired pneumonia which requires hospitalization (Mulazimoglu & Yu, 2001; Gupta et al, 2001), mainly in the ICU (ATS, 2001). Concerning to the “presumptive” criterion of single antibody title of 1:256, in the absence of seroconversion, it was concluded that it shall not be used except in the outbreak setting, since it has been reported to have low predictive value (Plouffe et al, 1995); and has also low specificity (CDC, 1997), since it has been reported high prevalence of positive antibodies at 1:256 in healthy populations (Wilkinson et al, 1983; Nichol et al, 1991). Legionnaires´disease is markedly undiagnosed, either its incidence underestimated. In several studies of CAP conducted in the USA, Europe, Israel and Australia the proportion of pneumonias caused by Legionella has ranged from 1% to 16% (Muder & Yu, 2000). In USA, the incidence of Legionella CAP in patients requiring hospitalization is estimated between 8000 to 23 000 cases per year (Marston et al, 1994 ; Marston et al, 1997). Such incidence in Brazil has not yet been estimated, being an important issue to study Objective : our goal is to detect the incidence of Legionella CAP in patients requiring hospitalization for a year, at the HCPA. Material and Methods: a cohort study ( an incidence study) of adult patients with CAP who were hospitalized for one year ( from 2000-2001) at HCPA. All patients with age 18≥80 were screened for study entry except: residents in institutions, those disabled to walk, those who had been discharged from hospital in the last 15 days; either pregnant women, HIV-positives, or patients with estructural lung diseases (bronchiectasis, cistic fibrosis) or tracheostomized. Admission logs were screened daily from Monday trough Friday (including the ones who had been hospitalized in the week-end) by the researchers. Patients with an admission diagnosis either of pneumonia or acute respiratory failure were evaluated daily by the researchers, and enrolled if they had a Chest X-Ray taken within 48 hours of admission revealing a new infiltrate consistent with pneumonia and at least 1 of the following “ major criteria” : fever (axillary temperature ≥37,8ºC), cough, or sputum; or 2 of the following “minor criteria”: dyspnea, abnormal mental status, signs of consolidation by examination, pleuritic chest pain or abnormal white blood cell count (> 12.000/cm3 or band forms > 4 % ). Information about risk factors, symptoms and outcome was collected through interview and medical chart review. Urine and serum samples were collected from consenting individuals during the acute fase at the hospital. After discharge, they came to the research ambulatory to consultation 4 to 12 weeks after patient enrollment, when the research doctor asked a new Chest X-Ray and serum sample of the convalescent phase to antibody test, along with other necessary exams. All the survivors were followed for a whole year after their inclusion in the study. Acute and convalescent sera were stored at – 70ºC and sent in dry ice (in a “batch”) to the Infectious Diseases laboratory of University of Louisville ( KY, USA), where they were tested by indirect immunofluorescent assay to IgG, IgM, and IgA antibodies to L pneumophila serogroups1-6, starting at dilution of 1:8. It was used a kit test manufactured by Zeus Scientific, Inc (Raritan, NJ, USA). All the urine samples collected were immediately frozen at –70ºC to be further tested in batches, at the Research lab of HCPA, by the investigators, with a commercial EIA kit test manufactured by Binax (BINAX Legionella Urinary Enzyme Assay). The positive ones were refrozen and further sent in a “batch” to the American laboratory, to be retested by the same kit test. Patients were diagnosed as having definite infection by L pneumophila serogroups 1-6 either if they had a 4-fold rise in antibody titer to at least 1:128 or greater dilution; or if they had positive urinary antigen, performed at our lab as recommended by the manfacturer and by the literature. A comparison was made between the patients who died and the survivors, regarding his clinical and laboratory features. Testing procedures to detect significant differences between groups included the Pearson chi-squared test or Fisher exact tests for categorical variables and Student´s t-test for continuous variables. Associations were considered statistically significant if the p value was < 0,05, using a 2-tailed test (SPSS program, version 10). Death by pneumonia was definite as the patient who died primarily due to the worsening of his lung sickness; thus, was calculated the frequency of deaths in our population. Patients who improved and were discharged, were classified as “cured”. Finally, we calculated the cumulative incidence of CAP caused by Legionella pneumophila serogroups 1-6 in a general hospital, for a year. Results: during a whole year, from 645 hospital admission logs with the diagnosis of pneumonia or acute respiratory failure screened, only 82 cases of CAP were obtained. During the follow up in the hospital or ambulatory, 23 patients were excluded either because Chest X-Ray failed to show a new pulmonary infiltrate (5 patients), alternative diagnosis were made (COPD, 5 patients; heart failure, 3; tuberculosis, 2; colagenosis, 1; idiopathic pulmonary fibrosis, 1). Aditional 6 patients revealed exclusion criteria as being HIV positive (1 patient), to have bronchiectasis (4) or pneumatocele (1). Thus, 59 patients constituted the final study group, being each patient enrolled only once. The mean age was 57,6 years (ranging from 24 to 80), being 20 women and 39 men. Most of them ( 36 patients, 61%) had chronic underlying diseases; half of them had more than one disease, being more prevalent: lung diseases, heart diseases, diabete mellitus, liver diseases and renal failure. Regular cigarette smokers represented 61% of the total, and alcohhol intake, 16,9%. Cancer ocurred in 9 patients, being solid organ malignancy in 7 and haematologic malignancy in 2. From our 59 patients, 10 were classified as immunossupressed, defined as splenectomy, haematological malignancy, autoimmune disease, transplant recipient, cancer chemotherapy within 4 weeks (Yu et al, 2002), or prednisolone use ≥10 mg/day (or equivalent), for at least 3 months before admission (LIM et al, 2001). In the remaining 13 patients, only one was previously healthy, while the others had sinusitis, anemia, hypertension, or other mild diseases. At admission, Chest X-Ray showed intersticial pneumonia in only one patient; bronchopneumonia in 59,3% and airspace pneumonia in 23,7%, while both patterns ocurred concomitantly in 15,2%. Obstructive pneumonia (Fang et al, 1990) ocurred in 5 patients with lung cancer. Pleural effusion ocurred in 22%, and in 21 patients (35%) the presentation was multilobar.The antibiotic class most used were beta-lactams, in 72,9% of the patients. The remaining received at most respiratory quinolones and macrolides. From the group that used beta-lactams, 25 patients did not use either quinolones or macrolides.There were not statistic differences in mortality regarding age, sex, or treatment between the groups who received beta-lactams alone versus the group that received macrolides or respiratory quinolones. The only significant association ocurred between radiographic pattern of airspace pneumonia and greater mortality (p= 0,05). In this study 3 patients had pneumonia caused by Legionella pneumophila serogroup 1: 2 patients had seroconversion and positive antigen urinary test; the third patient had a positive urinary antigen with negative serologies, like some authors (McWHINNEY et al, 2000). The former two patients worsened with beta-lactams, prescribed before the etiological diagnosis, getting resolution of their pneumonia with levofloxacin; the third one used only beta-lactams, getting cure. There were 7 deaths for pneumonia, and 4 deaths for cancer. From 48 survivors, 33 patients (68,7%) were alive after 12 months. Our mortality rate (13,5%) is similar to the one reported in the literature (ATS, 2001). Conclusions: the incidence of hospitalized CAP by Legionella pneumophila serogroups 1-6 in our hospital in the year 2000-2001 was 5,1%, which represents the annual incidence of Legionnaires´ disease in a general hospital of South Brazil. Comments and perspectives: complementary diagnostic methods like culture, serologies to detection of all classes of immunoglobulins and urinary antigen tests shall be used to detect infections by Legionella in our country to detect the real incidence of pneumonias caused by Legionella species. At the moment, the Legionella antigen test has the greatest yeld among the available tests. It is recommended to all hospitalized PAC patients (Mulazimoglu &Yu, 2001; Gupta et al, 2001); and also to all patients who have potential risk factors for legionellosis (Marrie, 2001), as well as to the etiological diagnosis of severe pneumonias (ATS, 2001). Its use is recommended, with unanimity, to the diagnosis of community and nosocomial outbreaks.

Introdução: O diagnóstico microbiológico da infecção por Legionella é complexo, pois a bactéria não é visualizada à coloração de Gram no escarro, e sua cultura não é realizada na maioria dos laboratórios clínicos. A imunofluorescência direta nas secreções respiratórias tem baixa sensibilidade, em torno de 40% e a técnica da “PCR” não é ainda recomendada para o diagnóstico clínico (CDC, 1997). A detecção de anticorpos no soro é a técnica mais utilizada, e o critério definitivo é a soroconversão para no mínimo 1:128, cuja sensibilidade é de 70 a 80% (Edelstein, 1993). Como critérios diagnósticos de possível pneumonia por Legionella, eram utilizados: título único de anticorpos a L pneumophila positivo na diluição 1:256, em paciente com quadro clínico compatível (CDC, 1990) e o achado de antígeno a Legionella na urina (WHO, 1990). Nos últimos anos, porém, com o uso crescente do teste de antigenúria, foram detectados casos de pneumonia por Legionella, que não eram diagnosticados por cultura ou sorologia, tornando-o método diagnóstico de certeza para o diagnóstico de pneumonia por Legionella (CDC, 1997). Por sua fácil execução, resultado imediato, e alta sensibilidade - de 86% a 98% (Kashuba & Ballow, 1986; Harrison & Doshi, 2001), tem sido recomendado para o diagnóstico das PAC que necessitam internação hospitalar (Mulazimoglu & Yu, 2001; Gupta et al., 2001; Marrie, 2001), especialmente em UTI (ATS, 2001). Vários estudos documentaram baixo valor preditivo positivo do título único positivo de 1:256, tornando-o sem valor para o diagnóstico da pneumonia por Legionella, exceto, talvez, em surtos (Plouffe et al., 1995). Outros detectaram alta prevalência de anticorpos positivos na diluição 1:256 na população, em pessoas normais (Wilkinson et al., 1983; Nichol et al., 1991). A partir de 1996, o CDC de Atlanta recomendou que não seja mais utilizado o critério de caso provável de infecção por Legionella pneumophila por título único de fase convalescente ≥1:256, por falta de especificidade(CDC, 1997). A pneumonia por Legionella é raramente diagnosticada, e sua incidência é subestimada. Em estudos de PAC, a incidência da pneumonia por Legionella nos EUA, Europa, Israel e Austrália, foi estimada entre 1% a 16% (Muder & Yu, 2000). Nos EUA, foi estimado que cerca de 8 000 a 23 000 casos de PAC por Legionella ocorrem anualmente, em pacientes que requerem hospitalização (Marston et al., 1994 e 1977). No Brasil, a incidência de PAC causadas por Legionella em pacientes hospitalizados é tema de investigação pertinente, ainda não relatado na literatura. Objetivo: detectar a incidência de pneumonias causadas por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, em pacientes que internaram no Hospital de Clínicas de Porto Alegre por PAC, por um ano. Material e Métodos: o delineamento escolhido foi um estudo de coorte (de incidência), constituída por casos consecutivos de pneumonia adquirida na comunidade que internaram no HCPA de 19 de julho de 2000 a 18 de julho de 2001. Para a identificação dos casos, foram examinados diariamente o registro computadorizado das internações hospitalares, exceto as internações da pediatria e da obstetrícia, sendo selecionados todos os pacientes internados com o diagnóstico de pneumonia e de insuficiência respiratória aguda. Foram excluídos aqueles com menos de 18 anos ou mais de 80 anos; os procedentes de instituições, HIV-positivos, gestantes, pacientes restritos ao leito; e portadores de doença estrutural pulmonar ou traqueostomias. Foram excluídos os pacientes que tivessem tido alta hospitalar nos últimos 15 dias, e aqueles já incluídos no decorrer do estudo. Os pacientes selecionados foram examinados por um pesquisador, e incluídos para estudo se apresentassem infiltrado ao RX de tórax compatível com pneumonia, associado a pelo menos um dos sintomas respiratórios maiores (temperatura axilar > 37,8ºC, tosse ou escarro; ou dois sintomas menores (pleurisia, dispnéia, alteração do estado mental, sinais de consolidação à ausculta pulmonar, mais de 12 000 leucócitos/mm3). O estudo foi previamente aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa do HCPA. Os pacientes eram entrevistados por um pesquisador, dando seu consentimento por escrito, e então seus dados clínicos e laboratoriais eram registrados em protocolo individual. Não houve interferência do pesquisador, durante a internação, exceto pela coleta de urina e de sangue para exame laboratoriais específicos da pesquisa. Os pacientes eram agendados, no ambulatório de pesquisa, num prazo de 4 a 12 semanas após sua inclusão no estudo, quando realizavam nova coleta de sangue, RX de tórax de controle, e outros exames que se fizessem necessários para esclarecimento diagnóstico.Todos os pacientes foram acompanhados por 1 ano, após sua inclusão no estudo.Foram utilizadas a técnica de imunofluorescência indireta para detecção de anticorpos das classes IgG, IgM e IgA a Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6 no soro, em duas amostras, colhidas, respectivamente, na 1ª semana de internação e depois de 4 a 12 semanas; e a técnica imunológica por teste ELISA para a detecção do antígeno de Legionella pneumophila sorogrupo 1 na urina, colhida na primeira semana de internação. As urinas eram armazenadas, imediatamente após sua coleta, em freezer a –70ºC, e depois descongeladas e processadas em grupos de cerca de 20 amostras. A imunofluorescência foi feita no laboratório de doenças Infecciosas da Universidade de Louisville (KY, EUA), em amostras de soro da fase aguda e convalescente, a partir da diluição 1:8; e a detecção do antígeno de Legionella pneumophila sorogrupo 1, nas amostras de urina, foi realizada no laboratório de pesquisa do HCPA, pelos investigadores, utilizando um kit comercial de teste ELISA fabricado por Binax (Binax Legionella Urinary Enzyme Assay, Raritan, EUA). As urinas positivas eram recongeladas novamente, para serem enviadas para confirmação no mesmo laboratório americano, ao fim do estudo. Foram adotados como critérios definitivos de infecção por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, a soroconversão (elevação de 4 vezes no título de anticorpos séricos entre o soro da fase aguda e da fase convalescente para no mínimo 1:128); ou o achado de antígeno de L pneumophila sorogrupo 1 na urina não concentrada, numa razão superior a 3, conforme instruções do fabricante e da literatura.Os pacientes foram classificados, de acordo com suas características clínicas, em 1º) portadores de doenças crônicas (doenças pulmonares, cardíacas, diabete mellitus, hepatopatias e insuficiência renal); 2º) portadores de doenças subjacentes com imunossupressão; 3º) pacientes hígidos ou com outras doenças que não determinassem insuficiência orgânica. Imunossupressão foi definida como esplenectomia, ser portador de neoplasia hematológica, portador de doença auto-imune, ou de transplante; ou uso de medicação imunossupressora nas 4 semanas anteriores ao diagnóstico (Yu et al., 2002b); ou uso de prednisolona 10 mg/dia ou equivalente nos últimos 3 meses (Lim et al., 2001). As características clínicas e laboratoriais dos pacientes que evoluíram ao óbito por pneumonia foram comparados àquelas dos pacientes que obtiveram cura. Para a análise das variáveis categóricas, utilizou-se o teste qui-quadrado de Pearson ou teste exato de Fisher. Para as variáveis numéricas contínuas, utilizou-se o teste “t“ de Student. Um valor de p< 0,05 foi considerado como resultado estatisticamente significativo (programas SPSS, versão 10). Foi calculada a freqüência de mortes por pneumonia na população estudada, adotando-se a alta hospitalar como critério de cura. Foi calculada a incidência cumulativa para pneumonia por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, em um hospital geral, no período de 1 ano. Resultados: durante um ano de estudo foram examinados 645 registros de internação, nos quais constavam, como motivo de baixa hospitalar, o diagnóstico de pneumonia ou de insuficiência respiratória aguda; a maioria desses diagnósticos iniciais não foram confirmados. Desses 645 pacientes, foram incluídos no estudo 82 pacientes, nos quais os critérios clínicos ou radiológicos de pneumonia foram confirmados pelos pesquisadores. Durante o acompanhamento desses pacientes, porém, foram excluídos 23 pacientes por apresentarem outras patologias que mimetizavam pneumonia: DPOC agudizado (5), insuficiência cardíaca (3), tuberculose pulmonar (2), colagenose (1), fibrose pulmonar idiopática (1), edema pulmonar em paciente com cirrose (1), somente infecçâo respiratória em paciente com sequelas pulmonares (4); ou por apresentarem critérios de exclusão: bronquiectasias (4), HIV positivo (1), pneumatocele prévia (1). Ao final, foram estudados 59 pacientes com pneumonia adquirida na comunidade, sendo 20 do sexo feminino e 39 do sexo masculino, com idade entre 24 e 80 anos (média de 57,6 anos e desvio padrão de ±10,6). Tivemos 36 pacientes com doenças subjacentes classificadas como “doenças crônicas”, dos quais 18 pacientes apresentavam mais de uma co-morbidade, por ordem de prevalência: doenças pulmonares, cardíacas, diabete mellitus, hepatopatias e insuficiência renal; neoplasias ocorreram em 9 pacientes, sendo sólidas em 7 pacientes e hematológicas em 2. Dos 59 pacientes, 61% eram tabagistas e 16,9%, alcoolistas. Do total, 10 pacientes apresentavam imunossupressão. Dos demais 13 pacientes, somente um era previamente hígido, enquanto os outros apresentavam tabagismo, sinusite, anemia, HAS, gota, ou arterite de Takayasu. A apresentação radiológica inicial foi broncopneumonia em 59,3% dos casos; pneumonia alveolar ocorreu em 23,7% dos casos, enquanto ambos padrões ocorreram em 15,2% dos pacientes. Pneumonia intersticial ocorreu em somente um caso, enquanto broncopneumonia obstrutiva ocorreu em 5 pacientes (8,5%). Derrame pleural ocorreu em 22% dos casos, e em 21 pacientes (35%) houve comprometimento de mais de um lobo ao RX de tórax. Foram usados beta-lactâmicos para o tratamento da maioria dos pacientes (72,9%9). A segunda classe de antibióticos mais usados foi a das fluoroquinolonas respiratórias, que foram receitadas para 23 pacientes (39,0%), e em 3º lugar, os macrolídeos, usados por 11 pacientes (18,6%). Apenas 16 pacientes não usaram beta-lactâmicos, em sua maioria recebendo quinolonas ou macrolídeos. Dos 43 pacientes que usaram beta-lactâmicos, 25 não usaram nem macrolídeos, nem quinolonas. Em 13 pacientes as fluoroquinolonas respiratórias foram as únicas drogas usadas para o tratamento da pneumonia. Do total, 8 pacientes foram a óbito por pneumonia; em outros 3 pacientes, o óbito foi atribuído a neoplasia em estágio avançado. Dos 48 pacientes que obtiveram cura, 33 (68,7%) estavam vivos após 12 meses. Os resultados da comparação realizada evidenciaram tendência a maior mortalidade no sexo masculino e em pacientes com imunossupressão, porém essa associação não alcançou significância estatística. Os pacientes que usaram somente beta-lactâmicos não apresentaram maior mortalidade do que os pacientes que usaram beta-lactâmicos associados a outras classes de antibióticos ou somente outras classes de antibióticos. Examinando-se os pacientes que utiizaram macrolídeos ou quinolonas em seu regime de tratamento, isoladamente ou combinados a outros antibióticos, observou-se que também não houve diferença dos outros pacientes, quanto à mortalidade. Os pacientes com padrão radiológico de pneumonia alveolar tiveram maior mortalidade, e essa diferença apresentou uma significância limítrofe (p= 0,05). Nossa mortalidade (11,9%) foi similar à de Fang et al. (1990), em estudo clássico de 1991 (13,7%); foi também similar à média de mortalidade das PAC internadas não em UTI (12%), relatada pela ATS, no seu último consenso para o tratamento empírico das PAC (ATS, 2001). Foram detectados 3 pacientes com pneumonia por Legionella pneumophila sorogrupo 1 na população estudada: 2 foram diagnosticados por soroconversão e por antigenúria positiva, e o 3º foi diagnosticado somente pelo critério de antigenúria positiva, tendo sorologia negativa, como alguns autores (McWhinney et al., 2000). Dois pacientes com PAC por Legionella não responderam ao tratamento inicial com beta-lactâmicos, obtendo cura com levofloxacina; o 3º paciente foi tratado somente com betalactâmicos, obtendo cura. Conclusões: A incidência anual de PAC por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6, no HCPA, foi de 5,1%, que representa a incidência anual de PAC por Legionella pneumophila sorogrupos 1 a 6 em um hospital geral universitário. Comentários e Perspectivas: Há necessidade de se empregar métodos diagnósticos específicos para o diagnóstico das pneumonias por Legionella em nosso meio, como a cultura, a sorologia com detecção de todas as classes de anticorpos, e a detecção do antígeno urinário, pois somente com o uso simultâneo de técnicas complementares pode-se detectar a incidência real de pneumonias causadas tanto por Legionella pneumophila, como por outras espécies. A detecção do antígeno de Legionella na urina é o teste diagnóstico de maior rendimento, sendo recomendado seu uso em todas as PAC que necessitarem internação hospitalar (Mulazimoglu & Yu, 2001; Gupta et al., 2001); em todos os pacientes com PAC que apresentarem fatores de risco potenciais para legionelose (Marrie, 2001); e para o diagnóstico etiológico das pneumonias graves (ATS, 2001). Seu uso é indicado, com unanimidade na literatura, para a pesquisa de legionelose nosocomial e de surtos de legionelose na comunidade. / Introduction: Legionella infections are difficult to diagnose, because the bacteria is not seen at Gram stain and the sputum culture is not performed at most laboratories. Besides that, the direct fluorescent fluorescent antibody test of respiratory secretion has low sensitivity (40%) and detection by PCR techiques is still not recommended for clinical diagnosis (CDC, 1997). The most used test is antibody detection by immunofluorescence technique or by ELISA, with a demonstration of fourfold or greater rise in the reciprocal immunofluorescente antibody (IFA) titer to greater than or equal to 1:128 against Legionella pneumophila serogroup 1 between paired acute-and convalescent-phase serum specimens, which sensitivity ranges between 70 - 80% (Edelstein, 1993).Case definitions for Legionnaires´disease agreed that patients with pneumonia who have positive results in urinary antigen assays or positive results in the direct fluorescent antibody (DFA) staining of respiratory secretions, had “probable” or presumptive” disease (WHO; 1990), as well as those who have single antibody titers of ≥1:256 (CDC, 1990). The Legionella urinary antigen test have been increasingly used in the last years, showing patients with positive results despite of negative culture tests or non-diagnostic serologies. Since then, the urinary antigen test has became a valuable tool in the prompt diagnosis of Legionnaires´disease, and also a definitive criterion for the diagnosis of Legionella pneumonias (CDC, 1997). Due to its high sensitivity, in the range of 86% to 98% (Kashubba & Ballow, 1986; Harrison & Doshi, 2001), it has been recommended to the diagnosis of community-acquired pneumonia which requires hospitalization (Mulazimoglu & Yu, 2001; Gupta et al, 2001), mainly in the ICU (ATS, 2001). Concerning to the “presumptive” criterion of single antibody title of 1:256, in the absence of seroconversion, it was concluded that it shall not be used except in the outbreak setting, since it has been reported to have low predictive value (Plouffe et al, 1995); and has also low specificity (CDC, 1997), since it has been reported high prevalence of positive antibodies at 1:256 in healthy populations (Wilkinson et al, 1983; Nichol et al, 1991). Legionnaires´disease is markedly undiagnosed, either its incidence underestimated. In several studies of CAP conducted in the USA, Europe, Israel and Australia the proportion of pneumonias caused by Legionella has ranged from 1% to 16% (Muder & Yu, 2000). In USA, the incidence of Legionella CAP in patients requiring hospitalization is estimated between 8000 to 23 000 cases per year (Marston et al, 1994 ; Marston et al, 1997). Such incidence in Brazil has not yet been estimated, being an important issue to study Objective : our goal is to detect the incidence of Legionella CAP in patients requiring hospitalization for a year, at the HCPA. Material and Methods: a cohort study ( an incidence study) of adult patients with CAP who were hospitalized for one year ( from 2000-2001) at HCPA. All patients with age 18≥80 were screened for study entry except: residents in institutions, those disabled to walk, those who had been discharged from hospital in the last 15 days; either pregnant women, HIV-positives, or patients with estructural lung diseases (bronchiectasis, cistic fibrosis) or tracheostomized. Admission logs were screened daily from Monday trough Friday (including the ones who had been hospitalized in the week-end) by the researchers. Patients with an admission diagnosis either of pneumonia or acute respiratory failure were evaluated daily by the researchers, and enrolled if they had a Chest X-Ray taken within 48 hours of admission revealing a new infiltrate consistent with pneumonia and at least 1 of the following “ major criteria” : fever (axillary temperature ≥37,8ºC), cough, or sputum; or 2 of the following “minor criteria”: dyspnea, abnormal mental status, signs of consolidation by examination, pleuritic chest pain or abnormal white blood cell count (> 12.000/cm3 or band forms > 4 % ). Information about risk factors, symptoms and outcome was collected through interview and medical chart review. Urine and serum samples were collected from consenting individuals during the acute fase at the hospital. After discharge, they came to the research ambulatory to consultation 4 to 12 weeks after patient enrollment, when the research doctor asked a new Chest X-Ray and serum sample of the convalescent phase to antibody test, along with other necessary exams. All the survivors were followed for a whole year after their inclusion in the study. Acute and convalescent sera were stored at – 70ºC and sent in dry ice (in a “batch”) to the Infectious Diseases laboratory of University of Louisville ( KY, USA), where they were tested by indirect immunofluorescent assay to IgG, IgM, and IgA antibodies to L pneumophila serogroups1-6, starting at dilution of 1:8. It was used a kit test manufactured by Zeus Scientific, Inc (Raritan, NJ, USA). All the urine samples collected were immediately frozen at –70ºC to be further tested in batches, at the Research lab of HCPA, by the investigators, with a commercial EIA kit test manufactured by Binax (BINAX Legionella Urinary Enzyme Assay). The positive ones were refrozen and further sent in a “batch” to the American laboratory, to be retested by the same kit test. Patients were diagnosed as having definite infection by L pneumophila serogroups 1-6 either if they had a 4-fold rise in antibody titer to at least 1:128 or greater dilution; or if they had positive urinary antigen, performed at our lab as recommended by the manfacturer and by the literature. A comparison was made between the patients who died and the survivors, regarding his clinical and laboratory features. Testing procedures to detect significant differences between groups included the Pearson chi-squared test or Fisher exact tests for categorical variables and Student´s t-test for continuous variables. Associations were considered statistically significant if the p value was < 0,05, using a 2-tailed test (SPSS program, version 10). Death by pneumonia was definite as the patient who died primarily due to the worsening of his lung sickness; thus, was calculated the frequency of deaths in our population. Patients who improved and were discharged, were classified as “cured”. Finally, we calculated the cumulative incidence of CAP caused by Legionella pneumophila serogroups 1-6 in a general hospital, for a year. Results: during a whole year, from 645 hospital admission logs with the diagnosis of pneumonia or acute respiratory failure screened, only 82 cases of CAP were obtained. During the follow up in the hospital or ambulatory, 23 patients were excluded either because Chest X-Ray failed to show a new pulmonary infiltrate (5 patients), alternative diagnosis were made (COPD, 5 patients; heart failure, 3; tuberculosis, 2; colagenosis, 1; idiopathic pulmonary fibrosis, 1). Aditional 6 patients revealed exclusion criteria as being HIV positive (1 patient), to have bronchiectasis (4) or pneumatocele (1). Thus, 59 patients constituted the final study group, being each patient enrolled only once. The mean age was 57,6 years (ranging from 24 to 80), being 20 women and 39 men. Most of them ( 36 patients, 61%) had chronic underlying diseases; half of them had more than one disease, being more prevalent: lung diseases, heart diseases, diabete mellitus, liver diseases and renal failure. Regular cigarette smokers represented 61% of the total, and alcohhol intake, 16,9%. Cancer ocurred in 9 patients, being solid organ malignancy in 7 and haematologic malignancy in 2. From our 59 patients, 10 were classified as immunossupressed, defined as splenectomy, haematological malignancy, autoimmune disease, transplant recipient, cancer chemotherapy within 4 weeks (Yu et al, 2002), or prednisolone use ≥10 mg/day (or equivalent), for at least 3 months before admission (LIM et al, 2001). In the remaining 13 patients, only one was previously healthy, while the others had sinusitis, anemia, hypertension, or other mild diseases. At admission, Chest X-Ray showed intersticial pneumonia in only one patient; bronchopneumonia in 59,3% and airspace pneumonia in 23,7%, while both patterns ocurred concomitantly in 15,2%. Obstructive pneumonia (Fang et al, 1990) ocurred in 5 patients with lung cancer. Pleural effusion ocurred in 22%, and in 21 patients (35%) the presentation was multilobar.The antibiotic class most used were beta-lactams, in 72,9% of the patients. The remaining received at most respiratory quinolones and macrolides. From the group that used beta-lactams, 25 patients did not use either quinolones or macrolides.There were not statistic differences in mortality regarding age, sex, or treatment between the groups who received beta-lactams alone versus the group that received macrolides or respiratory quinolones. The only significant association ocurred between radiographic pattern of airspace pneumonia and greater mortality (p= 0,05). In this study 3 patients had pneumonia caused by Legionella pneumophila serogroup 1: 2 patients had seroconversion and positive antigen urinary test; the third patient had a positive urinary antigen with negative serologies, like some authors (McWHINNEY et al, 2000). The former two patients worsened with beta-lactams, prescribed before the etiological diagnosis, getting resolution of their pneumonia with levofloxacin; the third one used only beta-lactams, getting cure. There were 7 deaths for pneumonia, and 4 deaths for cancer. From 48 survivors, 33 patients (68,7%) were alive after 12 months. Our mortality rate (13,5%) is similar to the one reported in the literature (ATS, 2001). Conclusions: the incidence of hospitalized CAP by Legionella pneumophila serogroups 1-6 in our hospital in the year 2000-2001 was 5,1%, which represents the annual incidence of Legionnaires´ disease in a general hospital of South Brazil. Comments and perspectives: complementary diagnostic methods like culture, serologies to detection of all classes of immunoglobulins and urinary antigen tests shall be used to detect infections by Legionella in our country to detect the real incidence of pneumonias caused by Legionella species. At the moment, the Legionella antigen test has the greatest yeld among the available tests. It is recommended to all hospitalized PAC patients (Mulazimoglu &Yu, 2001; Gupta et al, 2001); and also to all patients who have potential risk factors for legionellosis (Marrie, 2001), as well as to the etiological diagnosis of severe pneumonias (ATS, 2001). Its use is recommended, with unanimity, to the diagnosis of community and nosocomial outbreaks.