Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-06T17:36:07Z No. of bitstreams: 1 DissertaçãoNayaraFINALmaio2013.pdf: 3684656 bytes, checksum: 44cf55a7da171d43dbf42153f6237225 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T17:36:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissertaçãoNayaraFINALmaio2013.pdf: 3684656 bytes, checksum: 44cf55a7da171d43dbf42153f6237225 (MD5) Previous issue date: 2013 / Em nosso estudo caracterizamos a enzima ferro superóxido dismutase-A (FeSOD-A)e a proteína de membrana dos kinetoplastídeos-11 (KMP-11) em linhagens de Leishmania spp. do Novo Mundo selvagens e resistentes aos antimoniais. Ambas proteínas apresentam grande relevância no metabolismo do parasito, visto que a enzima FeSOD-A está envolvida na defesa antioxidante e KMP-11, presente na superfície da membrana dos kinetoplastídeos, pode estar relacionada ao fenótipo de resistência do parasito ao antimonial. Análise de Southern blot mostrou a presença de polimorfismos na sequência do gene FeSOD-A entre as linhagens de Leishmania avaliadas. A expressão de FeSOD-A foi analisada utilizando anticorpo policlonal (TcFeSOD) que reconheceu um polipeptídio de 26 kDa em todas as linhagens estudadas. Quantificação por qPCR mostrou que o mRNA do gene é 3,6X menos expresso na linhagem L. guyanensis resistente LgSbR, por outro lado a proteína está 2,0X mais expressa nessa linhagem. A FeSOD-A está 3,0X menos expressa em L. amazonensis resistente LaSbR, mas o nível de mRNA foi o mesmo entre as linhagens LaWTS e LaSbR. Ensaios de atividade enzimática mostraram que FESOD-A possui maior atividade nas linhagens resistentes de L. braziliensis e L. infantum chagasi (LbSbR e LcSbR) comparado com as linhagens selvagens. A análise funcional foi realizada para determinar se a superexpressão do gene FeSOD-A nas linhagens LbWTS/LbSbR e LcWTS/LcSbR iria alterar o fenótipo de resistência dos parasitos transfectados. Ensaios de Western blot e de atividade enzimática mostraram que o nível de expressão da proteína e atividade da FeSOD-A foram maiores nos parasitos transfectados em comparação com os não-transfectados. Análise IC50 do SbIII mostrou que a superexpressão FeSOD-A nas linhagens de LbWTS e LcWTS aumentou 1,7X e 1,6X o fenótipo de resistência ao antimônio, respectivamente. A superexpressão da enzima FeSOD-A na linhagem LbSbR reduziu o fenótipo resistência, enquanto que na linhagem LcSbR não houve alteração no fenótipo. Resultados de tolerância ao estresse oxidativo induzido por paraquat mostrou que o clone superexpressor de LbWTS apresentou maior proteção ao estresse comparado à linhagem não-transfectada. Concluindo, nossos resultados sugerem que a enzima FeSOD-A está envolvida no fenótipo de resistência de L. braziliensis e L. chagasi ao antimonial. Para o gene KMP-11 análise por Southern blot mostrou semelhante perfil de hibridização entre as diferentes espécies analisadas, com exceção da linhagem LgWTS que apresentou perfil de fragmentos diferentes. Análise de Northern blot revelou a presença de dois transcritos, 1,0 Kb e 3,0 Kb, em todas as linhagens de Leishmania spp., com exceção da linhagem LgWTS que apresentou apenas um transcrito de 1,0 Kb. Quantificação por qPCR mostrou que mRNA do gene KMP-11 está 2,9X menos expresso na linhagem de LbSbR e 1,5X mais expresso na linhagem LcSbR comparado com os respectivos pares selvagens. A expressão de KMP-11 utilizando anticorpo policlonal anti-KMP-11, mostrou que ele reconheceu um polipeptídio de 11 kDa em todas as linhagens de Leishmania spp. estudadas. Análises de densitometria mostraram que KMP-11 está 1,5X mais expressa em LcSbR comparado com o par selvagem LcWTS e 2,0X menos expressa em LbSbR comparado ao par LbWTS. Ensaios de transfecção do gene KMP-11 foram realizados nas linhagens LbWTS e LbSbR. Análise de Western blot mostrou maior expressão da proteína KMP-11 nos parasitos resistentes transfectados. Avaliação da susceptibilidade ao SbIII mostrou que a superexpressão de KMP-11 na linhagem selvagem de LbWTS não alterou o fenótipo. Por outro lado, a superexpressão dessa proteína na linhagem resistente (LbSbR) reduziu o fenótipo resistência. Ensaios in vitro e in vivo com as linhagens LbWTS não-transfectadas e os clones transfectados com KMP-11 não mostraram diferenças quanto à infectividade dos parasitos em células THP-1 e em camundongos nocaute para interferon-γ. Apenas o clone 6 apresentou menor infectividade em camundongos. Estudos adicionais são necessários para investigar melhor a possível participação da proteína KMP-11 no fenótipo de resistência ao antimonial e na infectividade dos parasitos. / In this study, we characterize the iron superoxide dismutase-A (FeSOD-A) enzyme and kinetoplastid membrane protein-11 (KMP-11) in New World Leishmania spp. lines wild and resistant to antimonials. Both proteins are very important in metabolism of the parasite, since that FeSOD-A is involved in antioxidant defense and KMP-11, present on the surface of kinetoplastids membrane, may be related to antimony-resistance phenotype. Southern blot analysis showed the presence of polymorphisms in the FeSOD-A gene sequence between the Leishmania lines evaluated. The expression level of FeSOD-A was analyzed using polyclonal antibody (anti-TcFeSOD) that recognized a polypeptide of 26 kDa in all lines studied. Quantification by qPCR showed that the FeSOD-A mRNA is 3.6-fold less expressed in SbIII-resistant L. guyanensis line (LgSbR), on the other hand the protein is 2.0-fold more expressed in this line. FeSOD-A is 3.0-fold less expressed in L. amazonensis resistant line (LaSbR), but the level of mRNA was the same between LaWTS and LaSbR lines. Enzymatic activity assays showed that SbIII-resistant L. braziliensis and L. infantum chagasi lines (LbSbR and LcSbR) present a higher FeSOD-A activity than their susceptible pairs. Functional analysis was performed to determine whether overexpression of the FeSOD-A gene in LbWTS/LbrSbR and LcWTS/LcSbR lines should alter the SbIII-resistance phenotype of transfected parasites. Western blot and enzymatic activity assays showed that the protein expression level and activity of FeSOD-A were higher in the transfected parasites compared to non-transfected ones. Analysis of IC50 for SbIII showed that the overexpression of FeSOD-A in the LbWTS and LcWTS lines increased 1.7- and 1.6-fold the SbIII-resistance phenotype, respectively. Overexpression of FeSOD-A enzyme in the LbSbR line reduced the SbIII-resistance phenotype, whereas in the LcSbR line no change in phenotype was observed. Results about the tolerance of parasites to oxidative stress induced by paraquat showed that the clone from LbWTS overexpressor of FeSOD-A presented higher protection to stress compared to non-transfected lines. In conclusion, our results suggest that the FeSOD-A enzyme may be involved to antimony-resistance phenotype in L. braziliensis and L. chagasi lines. Concerning KMP-11 gene, Southern blot analysis showed similar hybridization profile between different Leishmania lines analyzed, with exception of LgWTS line that presented different profile. Northern blot analysis revealed the presence of two transcripts, 1.0 kb and 3.0 kb in all lines of Leishmania analyzed, except for LgWTS line that showed only a transcript of 1.0 kb. Quantification by qPCR showed that mRNA KMP-11 is 2.9-fold less expressed in LbSbR line and 1.5-fold more expressed in LcSbR line compared with their wild pairs. The expression of KMP-11 using anti-KMP11 polyclonal antibody, showed that it recognized a polypeptide of 11 kDa in all Leishmania lines analyzed. Densitometry analysis showed that KMP-11 is 1.5-fold more expressed in the LcSbR line compared with its wild pair and 2.0-fold less expressed in the LbSbR line compared whit its resistant pair. Transfection assays of KMP-11 gene in the LbWTS and LbSbR lines were carried out. Western blot analysis revealed expression increased of KMP-11 protein in transfected resistant parasites. Evaluation of SbIII usceptibility showed that transfection of KMP-11 in the wild LbWTS line did not alter the phenotype. On the other hand, overexpression of this protein in the resistant LbrSbR line reduced the SbIII-resistance phenotype. In vitro and in vivo assays using LbWTS lines and non-transfected clones overexpressors of KMP-11 showed no difference in infectivity of the parasite in THP-1 cells and in interferon-γ knockout mice. Only the clone 6 showed lower infectivity in mice. Additional studies are needed to further investigate a possible involvement of KMP-11 protein in SbIII-resistance phenotype and in infectivity of parasites.