NOGUEIRA, Vanessa Lúcia Rodrigues. Papel de proteínas na tinta liberada pela lesma-do-mar Aplysia dactylomela Rang 1828 os mecanismos de defesa do animal. 2005. 90 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Marinhas Tropicais) - Instituto de Ciências do Mar, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2005. / Submitted by Debora Oliveira (deby_borboletinha@hotmail.com) on 2011-12-22T15:10:49Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_vlrnogueira.pdf: 12654022 bytes, checksum: 35936f35caac0bc23dbf25e1b2ffcafc (MD5) / Approved for entry into archive by Nadsa Cid(nadsa@ufc.br) on 2012-01-23T17:07:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_vlrnogueira.pdf: 12654022 bytes, checksum: 35936f35caac0bc23dbf25e1b2ffcafc (MD5) / Made available in DSpace on 2012-01-23T17:07:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_vlrnogueira.pdf: 12654022 bytes, checksum: 35936f35caac0bc23dbf25e1b2ffcafc (MD5) Previous issue date: 2005 / The sea hare Aplysia dactylomela is known by discharging a purple ink when disturbed. As it doesn't show any external structure of protection, it is believed that this secretion, rich in bioactive substances, participates in the chemical defense against pathogens and/or predators. The ink is constituted mainly by pigments, proteins and low molecular mass substances. The pigments are originated from red algae, nevertheless, there is lack of information about the origin, processing, storage and function of the ink proteins. This work describes the protein composition of the ink and present some physiochemical and biological characteristics of the dactylomelin-P, an antibacterial protein from the ink besides information concerning the location of this protein in the purple gland. The ink was obtained from specimens collected at Fleixeiras beach, Ce. The protein composition of the ink was studied by bi-dimensional electrophoresis. The purification of dactylomelin-P consisted basically in ion exchange and hydrophobic interaction chromatography. Dactylomelina-P was analyzed as to molecular mass, isoeletric point, amino acid composition, carbohydrates, heat stability, pH and proteinase resistance. Several biological activities were tested with the ink and with dactylomelina-P, including antimicrobial, enzymatic, haemagglutinating, anticoagulant, hemolytic, cytotoxic and toxic activities. The immunolocalization assays of dactylomelina-P were carried out in different sea hare tissues by western blot and immunohistochemistry and the interaction with Staphylococcus aureus was investigated by immunocytochemistry. The ink of A. dactylomela contains more than 40 proteins/peptides, with molecular masses below 70 kDa and acid pIs. The most abundant protein in the ink is the dactylomelin-P, a monomeric protein with 59,8 kDa, pI 5,0, high methionin content, and less than 1% carbohydrates. It is denatured at 60 ºC for 10 minutes and it resists to pH range of 3-12. Dactylomelin-P shows a wide antibacterial action spectrum, but no antifungal, unlike the ink that possesses some factor with this activity. It is particularly efficient against sea bacteria, can be bactericidal (4,0μg/ml) or bacteriostatic (0,2μg/ml), depending on the concentration. Dactylomelin-P agglutinated rabbit, mice and rat erythrocytes, but it did not show anticoagulating, hemolytic and cytotoxic activities. The LD50 for mice was 60-100 mg/Kg, being considered moderately toxic. Dactylomelin-P was only found in the ink gland, being located preferentially in the cells of the producing vesicles. The electronic transmission microscopy revealed that the dactylomelina-P crosses the cell wall of S. aureus and interacts mainly with the plasmatic membrane, probably interfering in the metabolism of the bacterium, instead of causing mechanic damage to the cell. / O gastrópode marinho Aplysia dactylomela é conhecido por liberar uma tinta púrpura sempre que é importunado. Como não possui nenhuma estrutura externa de proteção, acredita-se que essa secreção, rica em substâncias biologicamente ativas, participe da defesa química do animal. A tinta é composta de pigmentos, proteínas e substâncias de baixa massa molecular. Os pigmentos da tinta são originados de algas vermelhas, mas quanto às proteínas, pouco é conhecido sobre a sua origem, processamento, local de armazenamento e função no animal. Este trabalho descreve pela primeira vez a composição protéica da tinta e apresenta algumas características físico-químicas e biológicas da dactylomelina-P, uma proteína antibacteriana presente na tinta dessa lesma, além de trazer informações acerca da localização desta proteína na glândula de tinta. A tinta foi obtida a partir de espécimes encontrados na praia de Fleixeiras, Ce. A composição de proteínas da tinta foi determinada por eletroforese bidimensional e a purificação da dactylomelina-P foi feita através de cromatografias de troca iônica e interação hidrofóbica. Dactylomelina-P foi analisada quanto à massa molecular, ponto isoelétrico, composição de aminoácidos, presença de carboidratos, estabilidade térmica, resistência ao pH e a proteases. Várias atividades biológicas foram testadas com a tinta e com a dactylomelina-P, incluindo atividades antimicrobianas, enzimáticas, hemaglutinante, anticoagulante, hemolítica, citotóxica e tóxica. Os ensaios de localização da proteína foram realizados em diferentes tecidos da lesma por western blot, na glândula de tinta por imunohistoquímica e a interação com a bactéria Staphylococcus aureus foi feita por imunocitoquímica. A tinta de A. dactylomela contém mais de 40 proteínas/ peptídeos, com massas abaixo de 70 kDa e pIs na faixa ácida. A proteína mais abundante na tinta é a dactylomelina-P, que é uma molécula monomérica, de 59,8 kDa, pI 5,0, que possui alto teor de metionina e menos de 1% de carboidratos, é desnaturada a 60 ºC por 10 minutos e resiste a pHs entre 3-12. Dactylomelina-P mostra um amplo espectro de ação antibacteriano, mas não antifúngico, ao contrário da tinta que possui um fator com esta atividade. É particularmente eficiente contra bactérias marinhas, podendo ser bactericida (4,0μg/ml) ou bacteriostática (0,2μg/ml), dependendo da concentração. Dactylomelina-P aglutinou eritrócitos de coelho, ratos e camundongos, não apresentou atividade anticoagulante, hemolítica e nem citotóxica. A DL50 para camundongos ficou entre 60-100 mg/Kg, sendo considerada moderadamente tóxica. Dactylomelina-P só foi encontrada na glândula de tinta, localizando-se preferencialmente nas células das vesículas produtoras. Ensaios de microscopia eletrônica de transmissão revelaram que a dactylomelina atravessa a parede celular da bactéria S. aureus e, interage principalmente com a membrana citoplasmática, provavelmente interferindo no metabolismo, ao invés de causar danos à célula.