Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5193_1.pdf: 1879033 bytes, checksum: 2762c28cb18ad70b739746ca9e0272ea (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / O setor industrial de produção de álcool combustível, como uma atividade biotecnológica, ainda não experimentou o uso das novas tecnologias de modificação genética nas células da levedura Saccharomyces cerevisiae, a qual poderia contribuir para o aumento do rendimento de etanol e/ou utilização de fontes alternativas de carbono para o processo fermentativo. Neste trabalho, linhagens industriais de S. cerevisiae previamente selecionadas pela capacidade de permanência no processo industrial foram utilizadas como hospedeiras em experimentos de manipulação genética com intuito de modificar o metabolismo redox de forma a aumentar o rendimento a etanol. Entretanto, a constituição genética das linhagens industriais requereu que uma série de adaptações aos procedimentos convencionais de manipulação genética em linhagens de laboratório fossem otimizadas. O primeiro tipo de atividade consistiu no desenho experimental e no aprimoramento dos procedimentos de deleção gênica baseados na recombinação de seqüências homólogas em cassetes de integração. Para este fim, o gene GDH1, codificador da enzima glutamato desidrogenase, foi parcial ou completamente removido do genoma da linhagem industrial com o uso de fragmentos de PCR que continham seqüências com mais de 300 bp de homologia com as regiões 5 e 3´ do gene alvo. Este gene codifica a principal enzima da via de assimilação de amônia e sua remoção deve causar a substituição dos cofatores NADPH por NADH nesta via. Tanto a extensão das seqüências de homologia quanto os tipos de primers de verificação da integração e da deleção foram otimizados. A segunda estratégia consistiu na inserção genômica por integração homóloga do gene bacteriano GAPN codificador da enzima gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase. Ao contrário da enzima da levedura, esta enzima bacteriana utiliza NADPH como cofator, ao invés de NADH, e não promove a síntese de ATP. O gene bacteriano foi clonado em um plasmídeo que apresenta seqüências das regiões 5 e 3 do gene HO de S. cerevisiae e o cassete de integração foi utilizado para inserção no lócus HO do genoma da levedura. Para esta atividade, os tipos de primers de verificação da integração também foram otimizados. O conjunto de procedimentos experimentais descritos neste trabalho abre oportunidades para futuras manipulações genéticas que possam produzir células recombinantes úteis para os processos industriais. Além disso, faz-se necessária a construção de vetores de integração que permitam a posterior remoção da marcas de resistência a antibióticos, mantendo-se a capacidade de adaptação aos ambientes industriais