Les levures du genre Brettanomyces sont considérées depuis longtemps comme des contaminants par les industries vinicoles et brassicoles dû aux composés phénoliques indésirables qu’elles produisent. Cependant, l’utilisation des espèces B. bruxellensis et B. anomalus en brasserie est maintenant plus répandue grâce à leur capacité à diversifier les composés aromatiques produits par la traditionnelle levure Saccharomyces cerevisiae. Malgré cette émergence dans le domaine brassicole, peu d’informations sont disponibles en ce qui concerne la diversité génétique des souches et leur potentiel en fermentation. À notre connaissance, aucune méthode permettant de caractériser, d’identifier rapidement les souches de Brettanomyces spp. et pouvant facilement être mise en place dans un contexte industriel est présentement disponible. L’objectif de l’étude était donc de développer une nouvelle méthode rapide et fiable pour le typage moléculaire des levures Brettanomyces spp. dans l’optique de différencier les espèces et les souches, ainsi que de prédire leur potentiel brassicole. À cet effet, la méthode de typage génétique Random Amplification of Microsatellites (RAM)-PCR utilisant l’amorce (CGA)₅ a été développée et validée avec la méthode Restriction Endonuclease Analysis-Pulsed-Field Gel Electrophoresis (REA-PFGE) sur vingt-deux (22) souches de Brettanomyces spp., une (1) souche de Pichia kluyveri, une (1) souche de Candida parapsilosis, une (1) souche de Schizosaccharomyces pombe et une (1) souche de Saccharomyces cerevisiae, toutes isolées de bières, ferments commerciaux, vin rouge, levain et kombucha. Des essais de fermentation primaire ont révélé que les souches ayant un bon potentiel brassicole se trouvent dans les mêmes groupes phylogénétiques générés avec la méthode RAM-PCR et l’amorce (CGA)₅. Le projet a donc permis de fournir un outil efficace pour les brasseurs et les fournisseurs de levures pour l’identification rapide des espèces, des souches et du potentiel brassicole de levures Brettanomyces spp. provenant de différents substrats, sans avoir à faire appel aux techniques de séquençage et d’essais de fermentation qui sont plus coûteux ou qui demandent plus de temps à réaliser. / The yeasts of the genus Brettanomyces are often considered as a major contaminant in the wine and beer industries because of their production of phenolic off-flavors. Recently, few species of this genus, especially B. bruxellensis and B. anomalus, have been used in beers to enlarge the pool of aromatic compounds produced by the traditional Saccharomyces cerevisiae starter used for decades in breweries. The characterization of Brettanomyces species is therefore crucial to identify the strains showing interesting technological traits. However, to our knowledge, no fast method is currently available to evaluate the genetic diversity of the genus Brettanomyces which can be easily adapted in an industrial context. The aim of this study was to develop and optimize a new, fast and reliable typing method used for the species and strains differentiation of Brettanomyces spp. isolates and for the prediction of their brewing potential. Twenty-two (22) strains of Brettanomyces, one (1) Pichia kluyveri, one (1) Candida parapsilosis, one (1) Schizosaccharomyces pombe and one (1) Saccharomyces cerevisiae were isolated from beer, red wine, kombucha, sourdough, chicha and commercial starters and used for the development of a method based on the Random Amplification of Microsatellites (RAM)-PCR technique with (CGA)₅. This method was validated with the already existent and reliable Restriction Endonuclease Analysis coupled with Pulsed-Field Gel Electrophoresis (REA-PFGE) method. Further fermentation assays revealed that potential brewing isolates were clustered in the same phylogenetic group generated with RAM-PCR electrophoretic profiles. The study allowed the development of a useful tool for brewers and yeast suppliers for the identification at the species and strains levels and the brewing potential of various Brettanomyces spp. isolates, without the need for sequencing and laborious fermentation assays.