The conversion of the native monomeric cellular prion protein (PrPC) into an aggregated pathological β-oligomeric (PrPβ) and an infectious form (PrPSc) is the central element in the development of prion diseases. The structure of the aggregates and the molecular mechanisms of the conformational change involved in this conversion are still unknown. My research hypothesis was that a specific structural rearrangement of normal PrPC monomers leads to the formation of new inter-subunit interaction interfaces in the prion aggregates, leading to aggregation. My approach was to use constraints obtained by structural proteomic methods to create a 3D model of urea-acid induced recombinant prion oligomers (PrPβ). My hypothesis was that this model would explain the mechanism of the conformational change involved in the conversion, the early formation of the β-structure nucleation site, and would describe the mode of assembly of the subunits within the oligomer. I applied a combination of limited proteolysis, surface modification, chemical crosslinking and hydrogen/deuterium exchange (HDX) with mass spectrometry for the differential characterization of the native and the urea-acid converted prion β-oligomer structures to get an insight into the mechanism of the conversion and aggregation. Using HDX, I detected a region of the protein in which backbone amides become more protected from exchange in PrPβ compared to PrPC. In order to obtain the inter-residue distance constraints to guide the assembly of the oligomer model, I then applied zero-length and short-range crosslinking to an equimolar mixture of 14N/15N-metabolically labeled β-oligomer thereby enabling the classification of the crosslinks as either intra-protein or inter-protein. Working with the Dokholyan group at the University of North Carolina at Chapel Hill, I was able to assemble a structure of the β-oligomer based on the combination of constraints obtained from all methods. By comparing the structures before and after the conversion, I was able to deduce the conformational change, that occurs during the conversion as the rearrangement and disassembly of the beta sheet 1– helix 1 – beta sheet 2 (β1-H1-β2) region from the helix 2 – helix 3 (H2-H3) core, forming new β-sheet nucleation site and resulting in the exposure of hydrophobic residues patches leading to formation of inter-protein contacts within aggregates. / Graduate / 2018-06-14

No description available.

Abstract The β1-adrenergic receptor (β1AR) belongs to the large family of G protein-coupled receptors. It is activated by epinephrine and norepinephrine and thus has a central role in mediating the effects of the sympathetic nervous system. β1AR is the predominant adrenergic receptor in the heart, where it mediates positive inotropy and chronotropy. Thus, it is the most important target receptor for β-adrenergic antagonists, which are widely used in the treatment of cardiovascular diseases. Furthermore, β1AR is also expressed in the brain, where it has a crucial role in regulating memory formation and synaptic plasticity. Human β1AR (hβ1AR) has two polymorphisms, one at each terminus. The carboxyl-terminal (C-terminal) Arg389Gly8.56 polymorphism has previously been shown to have functional significance. Despite the clinical importance of hβ1AR, its biosynthetic profile and post-translational processing have not been well characterized to date. The aims of the present study were to shed light on these events, focusing on the limited proteolysis of hβ1AR and the impact of β-adrenergic ligands on receptor processing. In addition, the C-terminal polymorphism and its associations with certain parameters were investigated in a population consisting of survivors of acute myocardial infarction (AMI). By using a heterologous expression system, hβ1AR biosynthesis was revealed to be efficient and rapid. The N-terminus of the mature receptor was modified with O-glycans and one N-glycan, but despite these modifications it was subject to cleavage at the cell surface that resulted in two C-terminal fragments. The cleavage was mediated by a metalloproteinase, and importantly, it also occurred in vivo. Moreover, receptor activation enhanced the cleavage, which suggests that it represents a novel regulatory mechanism of hβ1AR. Interestingly, those ligands that enhanced the cleavage stabilized intracellular hβ1AR precursors, possibly via a pharmacological chaperone activity. Thus, the present study demonstrates that β-adrenergic ligands can have different regulatory effects on distinct hβ1AR forms. Among the AMI survivors, the Arg3898.56 homozygotes had significantly increased left ventricular mass indexes, when compared to the Gly3898.56 carriers, which suggests an association between Arg3898.56 and left ventricular hypertrophy (LVH). When euglycemic and diabetic patients were analyzed separately, the association existed among the euglycemic patients but was not present in diabetic patients. Diabetes is one of several risk factors that have previously been shown to influence the progression of LVH. Here, diabetes was shown to have a stronger effect on the development of LVH, when compared with the Arg3898.56 variant of hβ1AR. / Tiivistelmä β1-adrenerginen reseptori (β1AR) kuuluu laajaan G-proteiineihin kytkettyjen reseptorien perheeseen. β1AR on tärkeässä asemassa sympaattisen hermoston toiminnassa. Sydämessä β1AR on vallitseva adrenerginen reseptori, ja sydänlihaksen supistusvireys sekä -taajuus voimistuvat β1AR:n aktivaation kautta. Siten se edustaa sydän- ja verisuonisairauksissa käytettävien β-salpaajien tärkeintä kohdereseptoria. β1AR:n luontaisia agonisteja ovat lisämunuaisytimestä ja hermopäätteistä vapautuvat adrenaliini ja noradrenaliini. Sydänlihaksen lisäksi β1AR:a ilmennetään myös aivoissa, jossa reseptorilla on keskeinen asema muistin ja synaptisen muovautuvuuden kannalta. Ihmisen β1AR (hβ1AR) sisältää kaksi polymorfismia, joista toinen (Arg389Gly8.56) sijaitsee reseptorin karboksyyli- (C-) terminaalissa solulimassa. Tällä polymorfismilla on havaittu olevan toiminnallista merkitystä. Vaikka hβ1AR:n kliininen merkitys on huomattava, sen biosynteesistä ja translaationjälkeisestä muokkauksesta ei ole tähän mennessä ollut juurikaan tutkimustietoa. Tämän väitöskirjatyön tavoite oli kuvata näitä tapahtumia ja erityisesti keskittyä hβ1AR:n solunulkoisen amino- (N-) terminaalin rajoitettuun proteolyysiin. Lisäksi haluttiin tutkia, onko β-adrenergisillä ligandeilla vaikutusta reseptorin prosessointiin. Tutkimuksen kliinisessä osiossa kartoitettiin C-terminaalisen polymorfian yhteyttä valikoituihin muuttujiin aineistossa, joka koostui akuutin sydäninfarktin (AMI) sairastaneista potilaista. hβ1AR:n biosynteesin havaittiin olevan tehokas ja nopea heterologisessa systeemissä. Kypsän reseptorin N-terminaalissa havaittiin useita O-kytkennäisiä ja yksi N-kytkennäinen glykaani. Glykosyloinnista huolimatta N-terminaali pilkkoutui solun pinnalla, mikä tuotti kaksi solukalvolla sijaitsevaa, C-terminaalista reseptoripalasta. Pilkkoutumista, joka havaittiin myös in vivo, katalysoi metalloproteinaasi. Reseptorin aktivaatio kiihdytti pilkkoutumista, joka siten todennäköisesti edustaa uudenlaista hβ1AR:n säätelymekanismia. Ligandit, jotka kiihdyttivät pilkkoutumista, toisaalta stabiloivat solunsisäisiä hβ1AR:n epäkypsiä muotoja toimien luultavasti ns. farmakologisina kaperoneina. Näin ollen väitöskirjatyö osoittaa, että β-adrenergisillä ligandeilla voi olla erilaisia säätelyvaikutuksia eri hβ1AR-muotoihin. Kliinisessä tutkimuksessa Arg3898.56-homotsygooteilla potilailla havaittiin merkittävästi suurentunut vasemman kammion massaindeksi Gly3898.56-kantajiin verrattuina, mikä puoltaa Arg3898.56-polymorfismin ja vasemman kammion hypertrofian (LVH) välistä yhteyttä. Kun euglykeemisiä potilaita ja diabeetikkoja tutkittiin erikseen, yhteys ilmeni vain euglykeemisessä ryhmässä. Diabetes on riskitekijä, joka vaikuttaa LVH:n kehittymiseen. Tässä tutkimuksessa diabeteksellä havaittiin olevan voimakkaampi vaikutus LVH:n kehittymiseen Arg3898.56 -polymorfismiin verrattuna.