Précédemment, il a été démontré au laboratoire qu’une vaccination des souris avec des lipopolyplexes (LPR) contenant l’ARNm de l’antigène de mélanome MART1 permet d’induire la formation de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques et de retarder le développement de mélanomes B16F10 et de métastases pulmonaires. Les LPR sont des complexes ternaires constitués d’ARNm, d’un polymère cationique histidylé et de liposomes cationiques histidylés. L’objectif de ma thèse était d’améliorer cette vaccination antitumorale en développant de nouveaux liposomes capables de cibler les cellules dendritiques (DC). Le ciblage a été réalisé en incorporant un glycolipide mannosylé aux liposomes afin de favoriser leur reconnaissance par le récepteur mannose. A partir de ces liposomes, des formulations de complexes ternaires à base d’ADN (LPD mannosylés ou Man11-LPD100) ou à base d’ARN (LPR mannosylés ou Man11- LPR100) ont été mis au point. Les résultats montrent que : in vitro les formulations Man11-LPD100 sont mieux internalisés et transfectent plus efficacement les DC que les LPD100 non mannosylés. Les formulations Man11-LPR100 transfectent avec une plus grande efficacité les DC par rapport aux Man11- LPD100. Par ailleurs, une forte réduction de la toxicité des formulations a été obtenue en dialysant les liposomes. Il est également possible de conserver les formulations sous forme déshydratée. Une imagerie par scintigraphie effectuée chez la souris a permis de constater que 9% des LPD sont captés dans la rate après une injection IV. Nous avons mis en évidence après un isolement de DC spléniques que les formulations Man11-LPR100 transfectent 4 fois plus de DC que les LPR non manosylés. Enfin, l’immunisation des souris avec Man11-LPR100 contenant l’ARNm MART1 permet une vaccination plus efficace contre la tumeur B16F10 et une meilleure survie. En conclusion, les LPR Man11-LPD100 sont de bons vecteurs pour cibler et transfecter les DC spléniques avec l’ARNm d’un antigène tumoral et pour induire la réponse immune contre les cellules tumorales. / Previously, it has been demonstrated that mice vaccination with lipopolyplexes (LPR) containing melanoma antigen MART1 mRNA can induce the generation of specific cytotoxic T cells and delay B16F10 melanoma growth and lung metastases. LPR are ternary complexes consisting of mRNA, a histidylated cationic polymer and histidylated cationic liposomes. The objective of my thesis was to enhance this antitumor vaccination through the development of new liposomes that can target specifically dendritic cells (DC). The targeting of DC was achieved by incorporating a mannosylated glycolipid within liposomes to enhance their recognition by the mannose receptor. From these liposomes, formulations based ternary complexes of DNA (mannosylated-LPD or Man11-LPD100) or formulations based on mRNA (mannosylated LPR or Man11 LPR100) were developed. The results show that formulations made with Man11-LPD100 are better internalized and transfect efficiently DC than LPD100. Man11 LPR100 transfect with greater efficiency DC compared to DNA based formulation (Man11-LPD100). Furthermore, a strong reduction of the toxicity of LPD was obtained by liposomes dialysis. It is also possible to preserve their activity by freeze-drying. Mice scintigraphy revealed that 9% of LPD are captured in the spleen following IV injection. We demonstrated after isolation of splenic DC that Man11-LPR100 transfect DC 4 times more than LPR100. Finally, immunization of mice with Man11-LPR100 containing mRNA MART1 allows a more effective vaccination against B16F10 tumor and a better mice survival than non-mannosylated ones. In conclusion, Man11-LPR100 are promising vectors to target and transfect splenic DC with a tumor antigen mRNA aiming to an induction of an immune response against tumor cells.

Au cours de cette thèse, j’ai utilisé des complexes composés d’acides nucléiques, d’un polymère cationique et de liposomes cationiques appelés Lipopolyplexes pour formuler des siRNA (LPRi) et un leurre ADN (LPD) afin inhiber la croissance des cellules 4T1, un modèle murin de carcinome mammaire. Dans une première étude, des injections systémique ou endotrachéale de LPRi avec des siRNA anti-luciférase n’ont pas permis d’inhiber l’expression de la luciférase dans des métastases pulmonaires induites par des cellules 4T1-luciférase. A partir de ces résultats, les LPRi ont été améliorés en ciblant les cellules 4T1 avec le peptide uPA et/ou RGDc ou l’acide folique incorporés aux liposomes selon diverses approches. Les formulations obtenues ont été caractérisées, leur endocytose et l’effet siRNA mesurés in vitro. Cette deuxième partie a permis d’établir que les LPRi décorés avec du folate étaient la meilleure formulation ciblée. Dans une troisième partie, l’inhibition de la prolifération des cellules 4T1 a été recherchée en ciblant le facteur de transcription STAT3. Des LPRi anti-STAT3 ont montré une très bonne efficacité pour inhiber STAT3, mais sans effet antiprolifératif significatif. Des LPD anti-STAT3 ont montré un très bon effet antiprolifératif, celui-ci étant renforcé lorsqu’une co-délivrance siRNA/leurre ADN (LPRiD) a été réalisée. In vivo, un délai de la croissance des tumeurs 4T1 a été observé après co-délivrance siRNA/leurre ADN. Cette thèse a permis de montrer l’efficacité des lipopolyplexes pour la délivrance combinée de siRNA et de leurre ADN dans les cellules tumorales 4T1. Ils indiquent que des études sont cependant nécessaires pour augmenter leur délivrance in vivo dans la tumeur. / During this thesis, I used complexes made with nucleic acids, cationic polymer and cationic liposomes called Lipopolyplexes to formulate siRNA (LPRi) and DNA molecular decoy (LPD) in order to inhibit the growth of 4T1 cells, a murine model of mammary carcinoma. In a first study, systemic or endotracheal injections of LPRi comprising anti-luciferase siRNA did not allow luciferase inhibition in pulmonary metastases induced by 4T1-Luc cells. From these results, LPRi were improved by targeting 4T1 cells using incorporation, by different means, of uPA and/or RGDc peptide or folic acid in liposomes. Resulted formulations were characterized, their internalization and siRNA transfection efficiency were measured in vitro. This second part showed that folate targeting of LPRi was the best formulation. In a third part, proliferation inhibition of 4T1 cells was investigated by targeting the STAT3 transcription factor. Anti-STAT3 siRNA LPRi showed very good efficacy in inhibiting STAT3, but without significant antiproliferative effect. Anti-STAT3 decoy LPD showed a very good antiproliferative effect, the latter being reinforced when co-delivery siRNA/DNA decoy (LPRiD) was performed. In vivo, a growth retardation of 4T1 tumors was observed after co-delivery siRNA/DNA decoy. This thesis demonstrated the effectiveness of lipopolyplexes for combined delivery of siRNA and DNA decoy in the 4T1 tumor cells. Some studies are however required to increase their in vivo delivery into the tumor.

Précédemment, il a été démontré au laboratoire qu'une vaccination des souris avec des lipopolyplexes (LPR) contenant l'ARNm de l'antigène de mélanome MART1 permet d'induire la formation de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques et de retarder le développement de mélanomes B16F10 et de métastases pulmonaires. Les LPR sont des complexes ternaires constitués d'ARNm, d'un polymère cationique histidylé et de liposomes cationiques histidylés. L'objectif de ma thèse était d'améliorer cette vaccination antitumorale en développant de nouveaux liposomes capables de cibler les cellules dendritiques (DC). Le ciblage a été réalisé en incorporant un glycolipide mannosylé aux liposomes afin de favoriser leur reconnaissance par le récepteur mannose. A partir de ces liposomes, des formulations de complexes ternaires à base d'ADN (LPD mannosylés ou Man11-LPD100) ou à base d'ARN (LPR mannosylés ou Man11- LPR100) ont été mis au point. Les résultats montrent que : in vitro les formulations Man11-LPD100 sont mieux internalisés et transfectent plus efficacement les DC que les LPD100 non mannosylés. Les formulations Man11-LPR100 transfectent avec une plus grande efficacité les DC par rapport aux Man11- LPD100. Par ailleurs, une forte réduction de la toxicité des formulations a été obtenue en dialysant les liposomes. Il est également possible de conserver les formulations sous forme déshydratée. Une imagerie par scintigraphie effectuée chez la souris a permis de constater que 9% des LPD sont captés dans la rate après une injection IV. Nous avons mis en évidence après un isolement de DC spléniques que les formulations Man11-LPR100 transfectent 4 fois plus de DC que les LPR non manosylés. Enfin, l'immunisation des souris avec Man11-LPR100 contenant l'ARNm MART1 permet une vaccination plus efficace contre la tumeur B16F10 et une meilleure survie. En conclusion, les LPR Man11-LPD100 sont de bons vecteurs pour cibler et transfecter les DC spléniques avec l'ARNm d'un antigène tumoral et pour induire la réponse immune contre les cellules tumorales.