La surveillance de la listériose en France s’est construite par étapes depuis les années 1980 sur deux piliers, la microbiologie et l’épidémiologie. Grâce à la création du Centre National de Référence des Listeria et à la mise au point de techniques de typage performantes, l’Institut Pasteur assure une surveillance microbiologique depuis 1987. Une surveillance épidémiologique initiée entre 1984 et 1992 par le Laboratoire National de la Santé, a été développée par le Réseau National de Santé Publique de 1993 à 1999, puis amplifiée par l’Institut de Veille Sanitaire à partir de 2000. Le premier objectif de cette thèse est de décrire les différentes phases de la construction de cette surveillance afin d’analyser leurs contributions respectives au cours de ces 30 dernières années. Cette construction s’est faite en 4 phases : 1. L’étape fondatrice de 1982 à 1992 a été la reconnaissance et la prise en compte du rôle des aliments dans la transmission de la maladie et dans la survenue d’épidémies. 2. La deuxième phase de 1993 à 2000 a été l’édification d’un système de surveillance opérationnel pour détecter et investiguer les épidémies en France. 3. La troisième phase de 2000 à 2005 a permis de consolider le système de surveillance et de le perfectionner en ajoutant un volet complémentaire avec des prélèvements alimentaires.4. Depuis 2005, nous sommes dans la quatrième phase avec comme objectif l’optimisation du système. Cette optimisation repose sur l’adaptation des outils de surveillance et d’alerte aux connaissances. Ainsi, après avoir montré que la durée d’incubation de la maladie varie selon la forme clinique de la maladie, nous avons proposé d’intégrer cette variation pour déterminer la période d’évaluation des expositions alimentaires à risque. L’analyse des performances du système a permis à deux reprises de proposer de nouveaux seuils de signalement plus spécifiques afin d’optimiser cette surveillance tout en réduisant son coût. Le deuxième objectif de cette thèse est de montrer la contribution des données de surveillance à une politique de santé publique. Un premier travail a consisté à mettre en perspective les variations temporelles d’incidence observées avec les différentes sources de données disponibles afin d’en analyser les déterminants. La phase de décroissance de 1987 à 1997 a été concomitante des mesures de contrôles prises par l’industrie agro-alimentaire et de la réduction de la contamination des aliments. La phase d’augmentation en 2006-2007 semble multifactorielle. L’augmentation de la prescription de traitements de réduction de l’acidité gastrique par des inhibiteurs de la pompe à protons pourrait être l’un des déterminants majeurs de cette augmentation.Dans une deuxième analyse, nous avons hiérarchisé les groupes à risque de listériose sur la base de l’estimation du taux d’incidence de listériose et de sa mortalité dans ces groupes. Cela a permis d’identifier les groupes les plus vulnérables : hémopathies, certains cancers (digestifs, cérébral et pulmonaire), maladie de Horton, cirrhose hépatique, les dialysés rénaux, les greffés, et les femmes enceintes. Une analyse épidémiologique des listérioses materno-néonatales (MN) a montré une association entre les régions avec une incidence plus faible de listérioses materno-néonatales et les régions où la séroprévalence toxoplasmique des femmes enceintes est la plus faible, ce qui suggère un effet positif des recommandations contre la toxoplasmose pour la prévention de la listériose MN. / Listeriosis surveillance was built up stage by stage in France since the 1980s on a twofold basis: microbiology and epidemiology. Thanks to the creation of the Listeria National Reference Centre (Centre National de Référence des Listeria), the Pasteur Institute has been doing microbiological surveillance since 1987. Epidemiological surveillance was initiated by the National Health Laboratory, then conducted by the National Health Network and further developed by the National Institute of Health Surveillance. This thesis aims first of all to describe the different stages in the setting up of this surveillance system in order to analyze their respective inputs during these last thirty years. The four stages are:1. From 1982 to 1992: awareness and recognition of the role of food in the transmission of listeriosis and as the source of outbreaks. 2. From 1993 to 2000: building a reliable surveillance system in order to detect and investigate outbreaks in France. 3. From 2000 to 2005: strengthening and perfecting the surveillance system by taking additional measures, such as food sampling.4. Since 2005, we have reached the fourth stage, designed to optimize the surveillance system. This optimization involves adapting surveillance and early warning tools to new knowledge and information. For instance, having established that listeriosis incubation periods vary according to the clinical form of the illness, we suggested the integration of the variation of exposure period factor when interviewing patients with the food questionnaire. On two separate occasions, analysis of the surveillance system performance results made it possible to modify the criteria for early warning so as to optimize surveillance by increasing its specificity whilst reducing costs.The second aim of this thesis is to illustrate how surveillance data can contribute to public health policies. A first study analyzed temporal trends, using all available data in order to give some explanation as to major trends. The first trend was a reduction of incidence from 1987 to 1997 that was concomitant with control measures by the food industry and a drop in food contamination. The increased trend observed in 2006-2007 appears to be due to several factors. The increased rate of sales of proton pump inhibitors medication could be the major factor in this increase. In a second study, we ranked groups at risk of acquiring listeriosis based on the incidence of listeriosis and its lethality in each group. This enabled us to identify the most vulnerable groups : hematological malignancy, some cancers (digestive, lung, and brain cancer), dialysis, cirrhosis, organ transplantation and pregnancy. Epidemiological analysis of listeriosis cases associated with pregnancy indicated an association between regions with low rate listeriosis associated with pregnancy and regions where toxoplasmosis prevalence of pregnant women is low. This suggests that recommendations for avoiding toxoplasmosis have a positive effect on preventing listeriosis during pregnancy.

La surveillance de la listériose en France s'est construite par étapes depuis les années 1980 sur deux piliers, la microbiologie et l'épidémiologie. Grâce à la création du Centre National de Référence des Listeria et à la mise au point de techniques de typage performantes, l'Institut Pasteur assure une surveillance microbiologique depuis 1987. Une surveillance épidémiologique initiée entre 1984 et 1992 par le Laboratoire National de la Santé, a été développée par le Réseau National de Santé Publique de 1993 à 1999, puis amplifiée par l'Institut de Veille Sanitaire à partir de 2000. Le premier objectif de cette thèse est de décrire les différentes phases de la construction de cette surveillance afin d'analyser leurs contributions respectives au cours de ces 30 dernières années. Cette construction s'est faite en 4 phases : 1. L'étape fondatrice de 1982 à 1992 a été la reconnaissance et la prise en compte du rôle des aliments dans la transmission de la maladie et dans la survenue d'épidémies. 2. La deuxième phase de 1993 à 2000 a été l'édification d'un système de surveillance opérationnel pour détecter et investiguer les épidémies en France. 3. La troisième phase de 2000 à 2005 a permis de consolider le système de surveillance et de le perfectionner en ajoutant un volet complémentaire avec des prélèvements alimentaires.4. Depuis 2005, nous sommes dans la quatrième phase avec comme objectif l'optimisation du système. Cette optimisation repose sur l'adaptation des outils de surveillance et d'alerte aux connaissances. Ainsi, après avoir montré que la durée d'incubation de la maladie varie selon la forme clinique de la maladie, nous avons proposé d'intégrer cette variation pour déterminer la période d'évaluation des expositions alimentaires à risque. L'analyse des performances du système a permis à deux reprises de proposer de nouveaux seuils de signalement plus spécifiques afin d'optimiser cette surveillance tout en réduisant son coût. Le deuxième objectif de cette thèse est de montrer la contribution des données de surveillance à une politique de santé publique. Un premier travail a consisté à mettre en perspective les variations temporelles d'incidence observées avec les différentes sources de données disponibles afin d'en analyser les déterminants. La phase de décroissance de 1987 à 1997 a été concomitante des mesures de contrôles prises par l'industrie agro-alimentaire et de la réduction de la contamination des aliments. La phase d'augmentation en 2006-2007 semble multifactorielle. L'augmentation de la prescription de traitements de réduction de l'acidité gastrique par des inhibiteurs de la pompe à protons pourrait être l'un des déterminants majeurs de cette augmentation.Dans une deuxième analyse, nous avons hiérarchisé les groupes à risque de listériose sur la base de l'estimation du taux d'incidence de listériose et de sa mortalité dans ces groupes. Cela a permis d'identifier les groupes les plus vulnérables : hémopathies, certains cancers (digestifs, cérébral et pulmonaire), maladie de Horton, cirrhose hépatique, les dialysés rénaux, les greffés, et les femmes enceintes. Une analyse épidémiologique des listérioses materno-néonatales (MN) a montré une association entre les régions avec une incidence plus faible de listérioses materno-néonatales et les régions où la séroprévalence toxoplasmique des femmes enceintes est la plus faible, ce qui suggère un effet positif des recommandations contre la toxoplasmose pour la prévention de la listériose MN.

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène intracellulaire facultative responsable d’une pathologie grave, la listériose. Si de très nombreux travaux ont permis de caractériser les mécanismes de virulence de cette bactérie, il existe peu de données sur les mécanismes conduisant au portage asymptomatique de L. monocytogenes dans les hôtes mammifères. L’un de ces mécanismes pourrait être une phase de persistance intracellulaire. Lors d’infections prolongées de cellules épithéliales humaines en culture, comme des hépatocytes et des cellules de trophoblastes, L. monocytogenes change de mode de vie intracellulaire. Après la phase active de dissémination de cellule en cellule, les bactéries arrêtent de polymériser l’actine et se retrouvent piégées dans des vacuoles à simple membrane marquées par la protéine endosomale LAMP1. L’objectif de ma thèse était de caractériser ces « Listeria-Containing Vacuoles » (LisCVs). Nous avons montré que les LisCVs sont des compartiments acides, partiellement-dégradatifs, marquées par la protéase lysosomale cathépsine D. Leur formation coïncide avec la disparition du facteur de polymérisation d’actine ActA de la surface bactérienne et la capture des bactéries cytosoliques dépourvues d’actine par des membranes cellulaires. Dans ces compartiments, les bactéries entrent en croissance ralentie ; une sous-population résiste aux stress et peut survivre au-delà de trois jours d’infection. L’utilisation de la gentamicine lors du protocole d’infection n’est pas responsable de la formation des LisCVs. Cependant, cet antibiotique permet la sélection des bactéries vacuolaires, en inhibant spécifiquement la croissance des bactéries cytosoliques. La formation des LisCVs n’est pas spécifique des souches de laboratoire. Toutefois l’efficacité du phénomène pourrait diverger selon les séquençotypes des souches de L. monocytogenes. Les bactéries vacuolaires ont la capacité de sortir des vacuoles et de retourner vers un état motile et réplicatif, après le passage des cellules infectées. Lorsque l’expression du gène actA reste inactive, comme dans les mutants ∆actA, des formes de Listeria vacuolaires persistent dans les cellules hôtes dans un état viable mais non cultivable (VBNC). Ces formes VBNC peuvent être transmises au cours des divisions des cellules hôtes. L’ensemble de ces résultats révèle une nouvelle phase de persistance dans le processus infectieux intracellulaire de L. monocytogenes lors des infections prolongées de certaines cellules épithéliales. Cette propriété pourrait contribuer au portage asymptomatique de ce pathogène dans les tissus épithéliaux, allonger la période d'incubation de la listériose, et rendre les bactéries tolérantes à l’antibiothérapie. / Listeria monocytogenes is a facultative intracellular pathogenic bacterium responsible for a serious disease, listeriosis. Although much work has been done to characterize the virulence mechanisms of this bacterium, there is little data on the mechanisms leading to the asymptomatic carriage of L. monocytogenes in mammalian hosts. One of these mechanisms could be a phase of intracellular persistence. During prolonged infections of human epithelial cells in culture, such as hepatocytes and trophoblast cells, L. monocytogenes changes its intracellular lifestyle. After the active phase of cell-to-cell spread, the bacteria stop polymerizing actin and become trapped in single-membrane vacuoles labeled with the endosomal protein LAMP1.The aim of my thesis was to characterize these "Listeria-Containing Vacuoles" (LisCVs). We have shown that LisCVs are acidic, partially degradative compartments, labeled by the lysosomal protease cathepsin D. Their formation coincides with the disappearance of actin polymerization factor ActA from the bacterial surface and the capture of actin-free cytosolic bacteria by cell membranes. In these compartments, bacterial growth is slowed; a subpopulation is resistant to stress and can survive beyond three days of infection. The use of gentamicin during the infection protocol is not responsible for the formation of LisCVs. However, this antibiotic allows selection of vacuolar bacteria, by specifically inhibiting the growth of cytosolic bacteria. The formation of LisCVs is not specific to laboratory strains. However, the efficacy of the phenomenon could diverge according to the sequence types of L. monocytogenes strains. Vacuolar bacteria have the ability to exit the vacuoles and return to a motile and replicative state during the subculture of infected cells. When expression of the actA gene remains inactive, as in ΔactA mutants, vacuolar Listeria forms persist in host cells in a viable but non-culturable (VBNC) state. These VBNC forms can be transmitted during host cell divisions. All these results reveal a new phase of persistence in the intracellular infectious process of L. monocytogenes during prolonged infections of a subset of epithelial cells. This property could contribute to asymptomatic carriage of this pathogen in epithelial tissues, extend the incubation period of listeriosis, and make bacteria tolerant to antibiotic therapy.

Le but de ce projet consistait à développer des produits antimicrobiens naturels à base de bactériocines de bactéries lactiques et d'évaluer leur potentiel pour la biopréservation des produits marins prêts à consommer. Dans un premier temps, une nouvelle bactériocine de classe lia, la divergicine M35 produite par Carnobacterium divergens isolée de moules fumées, a été purifiée et caractérisée sur le plan biochimique et moléculaire. La divergicine M35 possède une séquence de 43 acides aminés et une masse moléculaire de 4518.75 Da. Elle possède un pouvoir anti-Listeria marqué contre de nombreuses souches de Listeria monocytogenes. À l'inverse, elle demeure inactive contre des souches de Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Bifldobacterium et Escherichia. Par la suite, les paramètres de production de la divergicine ont été déterminés dans un milieu de grade alimentaire à base d'hépatopancréas de crabe des neiges, un sous-produit de l'industrie halieutique. D'une part, les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence le potentiel du milieu hépatopancréas de crabe à permettre la croissance de G divergens M35 aux températures de réfrigération. D'autre part, une production de divergicine M35 satisfaisante et comparable au milieu MRS7m a été obtenue dans les mêmes conditions expérimentales. En dernier lieu, différentes stratégies d'addition de la divergicine M35 (culture productrice, divergicine M35 pure ou sous forme de bio-ingrédient actif issu du surnageant de culture concentré du milieu hépatopancréas de crabe) ont été comparées afin de valider l'activité anti-Listeria de la divergicine M35 dans le saumon fumé à froid entreposé à 4°C durant 21 jours. Un effet antimicrobien supérieur sur L. monocytogenes a été obtenu dans les filets contenant G divergens M35 après 10 jours d'entreposage, comparativement à ceux traités avec la divergicine pure ou le bio-ingrédient. G divergens M35 n'a causé aucune altération des caractéristiques organoleptiques et sensorielles des filets de saumon par rapport aux filets témoins non-inoculés. Aussi, les niveaux de bases azotées volatiles totales et d'aminés biogènes étaient inférieurs à la norme permise en fin de période de conservation. Ainsi, ce projet de recherche a démontré le potentiel d'application de la divergicine M35 pour la bio-préservation des produits marins prêts à consommer envers L. monocytogenes . / The aim of this research was to develop natural food-grade bacteriocins as antimicrobial ingredients and to evaluate their bio-preservative potential against Listeria monocytogenes in ready-to-eat seafood. Carnobacterium divergens M35 was isolated from a commercial sample of frozen smoked mussels and was shown to produce a new class Ha bacteriocin named divergicin M35. The purification procedure allowed the recovery of 10% of the bacteriocin present in the culture supernatant with purity higher than 99%. Divergicin M35 had a molecular mass of 4518.75 Da and an amino acid sequence of 43 amino acids. It showed powerful anti-listerial activity, especially against numerous isolates of L. monocytogenes but not against strains of Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacteria and Escherichia. The optimal parameters for the growth of C. divergens M35 and the production of divergicin M35 were then determined in various synthetic media and in snow crab hepatopancreas-based medium, a natural food grade by-product of crustacean processing. Snow crab hepatopancreas-based medium allowed growth of C. divergens M35 and divergicin M35 production, especially at refrigerated temperatures.The obtained results suggest that snow crab hepatopancreas-based medium could replace the more expensive MRS successfully for the production of food-grade bacteriocins, especially those produced by fish-acclimatized bacteria. Afterwards, purifïed divergicin M35, divergicin M35 bio-ingredient or C. divergens M35-producing divergicin strain were applied on cold-smoked wild salmon fillets to evaluate and compare their potential to inhibit the growth of L. monocytogenes during 21 days at 4°C. An increased reduction in L. monocytogenes viable count was obtained with C. divergens M35 treated samples till 10 days of storage as compared to purifïed divergicin M35 or divergicin bio-ingredient. Compared with un-inoculated samples, the addition of C. divergens M35 did not affect color and texture of salmon fillets throughout the storage period. Total volatile base nitrogen and levels of biogenic amines remained below the maximum acceptable in fish appreciation. Overall, the results of this study showed clearly the potential application of C. divergens M35 culture as well as divergicin M35 bio-ingredient for the inactivation of L. monocytogenes in ready-to-eat seafood.

Listeria monocytogenes est un pathogène alimentaire capable de coloniser le tube digestif de l'humain et causer des infections graves chez les personnes dont le système immunitaire est diminué (femmes enceintes, nouveaux-nés, greffés, personnes âgées, etc.). Son incidence dans les pays industrialisés est faible, mais son taux de mortalité est très élevé (20 à 30%). Le but de cette recherche est d'étudier la capacité des souches de bifidobactéries productrices de bacteriocines à prévenir une infection entérique à L. monocytogenes. Ce projet de recherche fait suite à des travaux antérieurs au cours des quels de nouvelles souches de bifidobactéries d'origine humaine productrices de bacteriocines actives contre L. monocytogenes ont été isolées à partir de fèces de nouveaux-nés. Les bacteriocines produites par les souches Bifidobacterium RBL 67 et RBL 70 ont été extraites des surnageants de culture et appliquées sur des cultures de L. monocytogenes. Ces deux bacteriocines ont montré une activité comparable à celle de la nisine A et la nisine Z. Trois souches bactériocinogènes (RBL 67, RBL68 et RBL70) ont été utilisées pour évaluer la capacité de chacune d'elles à bloquer l'adhésion et la l'invasion de L. monocytogenes sur des cellules Caco-2 et HT-29. La souche RBL 70 s'est montrée la plus efficace avec une diminution de 38% à 90% de l'invasion. De plus, lorsque les bifidobactéries sont ajoutées une heure avant L. monocytogenes, l'efficacité des trois souches augmente pour atteindre pour la plupart 99% d'inhibition. Suite à ces essais in vitro, un modèle animal d'infection à L. monocytogenes a été développé et la souche Bifidobacterium RBL 67 a été utilisée afin de diminuer l'infection chez la souris. Les animaux infectés ayant reçu le probiotique présentent une perte de poids moindre comparé au témoin d'infection. De plus, les comptes de L. monocytogenes dans les organes cibles (contenu intestinal, foie, rate) sont plus faibles chez le groupe probiotique que chez le groupe témoin. L'activité de ces nouvelles souches de bifidobactéries contre Listeria monocytogenes montre leur capacité à lutter contre les infections intestinales et soutient leur éventuelle utilisation comme probiotique chez l'humain.