Four strains of Listeria monocytogenes (LCDC 81-861, ATCC 19115, M1 and M2) examined in pure culture behaved similarly when exposed to a concentration of 0.5% CharSol C-10 liquid smoke by reducing Listeria numbers to an undetectable level within 4 hours post treatment. However, at the lower concentration of 0.25% liquid smoke, differences in resistance to the antimicrobial properties of smoke components become evident among these strains indicating that a level of 0.5% liquid smoke is more effective in controlling this organism. CharSol C-10 liquid smoke was used as a full strength dip treatment for beef franks surface inoculated with six strains of L. monocytogenes (LCDC 81-861, ATCC 19115, M1, M2, M5, and C6) then vacuum packaged and stored at 4 ± 1°C for 72 hours. Beef franks dipped in CharSol C-10 liquid smoke exhibited a significant (P < 0.001) reduction in L. monocytogenes numbers after 72 hours of storage at both inoculum levels of 1 x 10³ cells/ml and 1 x 10⁵ cells/ml.

Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2003. / ENGLISH ABSTRACT: The possible use of the bacterially produced antimicrobial peptides, and in particular class IIa bacteriocins as food preservatives is a motivating factor in studies on resistance to them by food-borne pathogens like Listeria monocytogenes. The high frequencies of resistance to class Ha bacteriocins have however sparked concern regarding their adequacy as potential biopreservatives. Activity of these cationic peptides was reported to occur by membrane permeabilisation due to pore formation, which results in the leakage of the intracellular contents followed by cell death. The cell envelope (cell wall and cell membrane) is therefore envisaged as a key site of modification in suscepti bility of bacteria to class Ha bacteriocins. Mutants of the L. monocytogenes 873 isolate, resistant to the class IIa bacteriocin, leucocin A, were generated at the start of the study to complement the existing array of L. monocytagenes wild-type and resistant isolates obtained from other sources. The fifty percent inhibitory concentrations using a highly sensitive and reproducible bioassay were determined. This allowed categorisation of the mutants into intermediate and highly resistant phenotypes. Analysis of the growth patterns of all these strains showed decreased growth rates and higher growth yields for all the resistant strains in general. This provided evidence for possible effects of membrane adaptation and metabolic changes in the resistant strains and prompted further investigation. The major focus of the study on the class Ha resistant mutants were: (1) analysis of membrane compositional changes and factors influencing cell surface charge; (2) assessment of physical changes in the membrane and bacteriocin itself using circular dichroism and fourier transform infrared spectroscopy; (3) and, determination of changes in glucose metabolism. Electrospray mass spectrometry analysis of the major listerial phospholipid, phosphatidylglycerol, revealed that membranes of resistant strains had increased levels of unsaturated and short-acyl-chain phosphatidylglycerol molecular species, indicating more fluid membranes. In addition, treatment with a desaturase inhibitor resulted in increased sensitivity of only the intermediate resistant strains to the class na bacteriocin, leucocin A. This indicated the influence of membrane adaptation in only lower levels of resistance. It is conceivable that more fluid membranes could also impact on decreased stability of pore formation by the bacteriocin. Complementary biophysical studies using fourier transform infrared spectroscopy indicated the possible occurrence of greater membrane fluidity of resistant cells, by the notable shift in the anti symmetric CH2 stretching vibration from 2921 cm-I to 2922 cm-I. Additionally, circular dichroism revealed a decreased a-helical and increased random structure of leucocin A in the presence of listerial liposomes derived from highly resistant cell membrane extracts. It is possible that this may result in reduced activity of the bacteriocin in resistant cell membranes as a-helical stucture is a critical feature for membrane insertion of cationic antimicrobial peptides. Cell surface charge was determined by quantification of alanine and lysine esterification of the anionic cell surface polymer, teichoic acid, and membrane phospholipids respectively. Increased D-alanine, which causes neutralisation of the cell surface, was observed in all resistant cells. A tendency for greater lysine content in membrane phospholipids, which also impacts on neutralisation of the anionic phospholipid of listerial membranes, was observed in highly resistant strains only. This neutralisation of the negative charge of the cell surface may interfere with initial electrostatic interaction of bacteriocin with the cell, and subsequent interactions required for permeabilisation of the cell membrane. These differences in alanine and lysine esterification were not the result of increased expression of certain associated genes (d/tA and /mo1695) and may be the result of post-transcriptional regulation. It was, however, found that all resistant L. monocytogenes strains, including the intermediate resistant strains, exhibited decreased expression of a putative docking molecule, the mannose-specific phosphotransferase system EIIAB subunit (EIlABMan).A clear correlation existed between the levels of resistance and EIIABMandown-regulation. Finally, analysis of the glucose metabolism in highly resistant and wild-type strains, indicated a more efficient metabolism with regards to higher growth yields and ATP yield, in contrast to a lower specific growth rate in a spontaneous and genetically defined (EIlABMan inactivated) highly resistant mutant. The switch in metabolic end-product observed, was attributed to the loss of the glucose transporter, EIlABMan,and may cast doubts on the feasibility of the use of class Ha bacteriocins as food preservatives in light of a stable and efficient resistant phenotype. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Sien volteks vir opsomming

Varying concentrations of the food preservatives nisin and lysozyme were adsorbed onto glass surfaces chemically modified to exhibit different degrees of hydrophobicity. The antimicrobial activity of the adsorbed preservatives was evaluated by documenting the ability of Listeria monocytogenes to adhere and grow on the glass surfaces. A bioluminescence protocol was developed to effectively enumerate bacterial cells adhered to glass. Lysozyme adsorption onto glass surfaces was monitored by labeling with ¹²⁵I. Results indicated that synergy was present for 0.9/0.1 molecular ratio of nisin/lysozyme. Synergistic effect was increasing gradually with the increase of nisin in the ratios tested. This trend was observed on both surface types. However, the magnitude of synergy was more pronounced on hydrophobic surfaces than on hydrophilic ones. Results from protein radiolabeling showed that lysozyme was adsorbed with higher mass to hydrophilic surfaces than to hydrophobic ones. / Graduation date: 1999

Bacteriophage (phage), virus of bacteria, has been proposed as a mean to inactivate bacteria that are pathogens of humans. Applied prophylatically to food, phage might decrease the numbers of potential pathogens we ingest. Much active research on using the phages of bacteria to control Gram negative foodborne pathogens are described in the literatures, but comparatively little research describes the phages of Gram positive bacteria and their use as biocontrol agents on food. In this work, previous undescribed phages, able to infect Bacillus cereus and Listeria monocytogenes, were isolated from soil and ruminants faecal material, respectively. As the first step in assessing their potential as biocontrol agents, the isolated phages were purified, concentrated and characterised (albeit to different degrees). The Bacillus phages had a narrow host range while the Listeria phages had a broad host range. Listeria phages also infected L. monocytogenes 2000/47, a strain which recurs in New Zealand clinical cases. Both Bacillus and Listeria phages appeared to be of the Myoviridae family judging by their structure in electron micrographs. The Bacillus FWLBc1 and FWLBc2 phages were lytic phages with a latent period of 106 and 102 min at 37°C, and an average burst size of 322 and 300 phages per infected cell, respectively. Moreover, they both had genomes of approximately 134 kb. All newly isolated and characterized phages were chloroform resistant and survived storage better at 4°C than at room or freezing temperatures. Bacillus phages significantly reduced the bacterial population in mashed potatoes within 24 h at room temperature, when applied at a phage to host ratio of 1000. Listeria phages rapidly inactivated the host population to a low optical density. The findings of this thesis will add to the current knowledge of phages in the context of various environmental conditions for different bacteria and will demonstrate the potential of phages as food safety biocontrol agents.

Listeria meningoencephalitis is a rare condition, occurring mainly in immunocompromised patients. We present two cases of Listeria monocytogenes meningoencephalitis in immunocompetent children, with successful treatment with betalactam/aminoglycoside combination. Unpasteurized cheese was postulated as the source of infection.

Se analizaron 60 muestras de Salchicha tipo Huacho de los Mercados de Abastos del Cercado de Lima, con la finalidad de determinar la incidencia de Listeria monocytogenes. Estas muestras se llevaron al Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, en recipientes estériles, refrigerados y se procesaron dentro de las 24 horas de colectadas. Para el análisis microbiológico se utilizó la técnica según USDA- FSIS, que consta de tres fases: Pre-enriquecimiento, Enriquecimiento de la muestra y siembra en agares selectivos, pruebas Bioquímicas, Catalasa, Gram positivos y la prueba del CAMP para su confirmación. La incidencia de L. monocytogenes en Salchicha tipo Huacho, en los Mercados de Abastos del Cercado de Lima es de 78%, siendo un valor considerable y que supera a los valores reportados en estudios a nivel internacional. Estos resultados permiten considerar que la Salchicha tipo Huacho se constituye como un alimento de riesgo potencial para la Salud Pública. / --- 60 samples of the Huacho Sausage from the Food Markets in Cercado de Lima, in Lima, Peru, were analyzed in order to determine the incidence of Listeria monocytogenes. These samples were taken to the Laboratory of Microbiology to the Faculty of Pharmacy and Biochemistry at the National University of San Marcos. They were taken in sterile containers for being refrigerated. Then they were processed within 24 hours of being collected. The USDA-FSIS technique was used for microbiological analysis, which consists of three phases: Pre-enrichment of the sample, Sample Enrichment and Reseeding on selective agars. At the same time, some biochemical tests were applied, such as the positive Catalase test, the test of Great Positive, and CAMP test to confirm the results. The incidence of the Listeria monocytogenes in the Huacho Sausage, from the Food Markets in Cercado de Lima, is 78%. This is quite high, as it exceeds the values reported in international studies. These results support the conclusion that the Huacho Sausage is a food with a potential risk to the public health.

Se analizaron 75 muestras de quesos frescos de diferentes mercados del Cercado de Lima, con la finalidad de aislar e identificar Listeria monocytogenes, además de determinar su capacidad para formar biopelículas. El análisis microbiológico se realizó empleando las metodologías recomendadas por el Manual de Bacteriología Analítica de la Food and Drug Administration (BAM - FDA). El procedimiento para determinar la capacidad de formación de biopelículas fue el método de microplaca de 96 pocillos descrito por Djordjevic con las modificaciones recomendadas por Borucki. El estudio microbiológico permitió aislar Listeria monocytogenes en 14 muestras de quesos frescos (18,67%), siendo un valor elevado representando un riesgo potencial para la población consumidora. La capacidad de las cepas de Listeria monocytogenes para producir biopelículas en microplaca de poliestireno fue clasificada según la densidad óptica obtenida a 595 nm. Se obtuvo que el 64,29 % (9/14) de las cepas de Listeria monocytogenes tienen capacidad de formar biopelículas, distinguiéndose entre formadores débiles y moderadas dependiendo del medio de enriquecimiento estudiado, los cuales fueron caldo tripticasa de soya (TSB) e Infusión cerebro corazón (BHI). El medio BHI fue el más efectivo en promover la formación de biopelículas de Listeria monocytogenes en microplaca de poliestireno. Palabras clave: Listeria monocytogenes, quesos frescos, Cercado de Lima, biopelículas, microplaca. / --- A total of 75 samples of fresh cheese from different markets in Cercado de Lima, were analyzed in order to isolate and identify Listeria monocytogenes and also determine its ability to produce biofilms. The microbiological analysis was performed using the methodologies recommended by FDA’s Bacteriological Analytical Manual (BAM – FDA). The methodology for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation was the 96-well microtiter plate method described by Djordjevic with the modifications recommended by Borucki. The microbiological study allowed identifying Listeria monocytogenes in 14 samples of fresh cheese (18,67%), being a high value and which means a potential risk for the consumer population. The assessment of Listeria monocytogenes strains to produce biofilm in microtiter polystyrene plate was classified according to optical density at 595 nm. It was found that 64,29% (9/14) of Listeria monocytogenes strains have the ability to produce biofilms, distinguishing between weak and moderate biofilm producers depending of the type of enrichment medium used, which were Trypticase Soy Broth (TSB) and Brain Heart Infusion (BHI). BHI medium was the most effective in promoting the Listeria monocytogenes biofilm formation in polystyrene microtiter plate. Key words: Listeria monocytogenes, fresh cheese, Cercado de Lima, biofilm, microtiter plate.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Con el propósito de cuantificar la presencia de Listeria monocytogenes en choritos vivos (Mytilus chilensis) y choritos cocidos congelados procesados en una planta procesadora que los comercializan para exportación, se analizaron 40 unidades de muestra de choritos vivos y 40 unidades de muestra de choritos cocidos congelados obtenidas en una planta procesadora ubicada en la Isla Grande de Chiloé, X Región de Chile. La toma de muestras se realizó en ocho oportunidades, entre los meses de Abril y Julio del año 2010. Los planes de muestreos y los criterios microbiológicos se realizaron según el Reglamento Sanitario de Alimentos y el Reglamento Europeo de Criterios Microbiológicos en Productos Alimenticios, debido a que ése es el mercado de destino del producto final. El total de unidades de muestras analizadas mostraron valores inferiores a 10 ufc/g de L. monocytogenes, lo que las hace aptas para el consumo humano según los estándares establecidos. De lo anteriormente expuesto se evidencia la baja presencia de L. monocytogenes en los choritos vivos y cocidos congelados examinados, lo que puede interpretarse como un bajo riesgo para la población consumidora. Hubo una colonia de Listeria spp. en una unidad de muestra de chorito cocido congelado, obtenida del sexto muestreo. Según los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas de identificación de especies del género Listeria, la colonia corresponde a L. welshimeri, considerada una listeria apatógena. Las principales conclusiones de este estudio son que los niveles de L. monocytogenes encontrados en choritos vivos y cocidos congelados analizados cumplen con la normativa nacional y la establecida en la Unión Europea para este producto. La detección de una colonia Listeria spp. en alimentos o elementos relacionados con su manufactura puede indicar la presencia de L. monocytogenes, debido a que pueden coexistir bajo las mismas condiciones. A pesar de los pocos casos documentados de infecciones humanas por otras especies del género Listeria, éstos podrían ser resultado de una baja patogenicidad para los humanos, o que no se han descubierto aún los mecanismos con los que estas especies apatógenas están provocando casos de listeriosis no notificados o identificados erróneamente debido a la falta de investigación al respecto / Programa Domeyko Alimentos de la Vicerrectoría de Investigación y Desarrollo de la Universidad de Chile 2008- 2010

Listeria monocytogenes ist ein weit verbreitetes, Gram-positives humanpatho-genes Bakterium, welches in immunsupprimierten Personen das Krankheitsbild der Listeriose auslösen kann. Der Infektionszyklus der Listerien im Wirt ist im Hinblick auf die Pathogenese dieses Erregers intensiv untersucht worden. Die Regulation der verschiedenen beteiligten Virulenzfaktoren unterliegt in L. monocytogenes einer starken Kontrolle, die einerseits durch regulatorische Proteine aber auch durch Umweltfaktoren beeinflusst wird. Die Mechanismen, die auf transkriptionaler wie auch auf translationaler Ebene die Expression verschiedener listerieller Virulenzgene regulieren, wurden kürzlich näher charakterisiert. Es wurden für verschiedene listerielle Virulenzgene Riboswitch-mechanismen zur Expressionskontrolle in Listerien neu beschrieben. Durch Vorarbeiten wurde auch für das inlAB-Operon ein posttranskriptionaler Regu-lationsmechanismus postuliert. Dabei wurde der anaerobe Stoffwechsel der Listerien als möglicher Auslöser für die beobachtete Translationssteigerung des inlA- und inlB-Gens diskutiert. Innerhalb der vorliegenden Arbeit sollte nun weitergehend untersucht werden, in welchem Bereich der Sequenz des inlAB-Operons sich regulatorische Strukturen zur posttranskriptionalen Regulation unter anaeroben Wachstumsbedingungen befinden. Dazu wurden verschiedene Mutanten mit unterschiedlichen Deletionen im inlAB-Operon konstruiert und die Transkription und Translation sowohl des inlA-, als auch des inlB-Gens betrachtet. Eine Deletion im aroA-Gen bewirkt das Wachstum der Bakterien bei anaerobem Stoffwechsel. Diese Deletion wurde in die konstruierten Stämme eingefügt, um die Expression der Gene unter den verschiedenen Wachstumsbedingungen vergleichen zu können. Außerdem wurden verschiedene gus-Reportergen-Fusionsmutanten und Promotor-austauschmutanten konstruiert, um quantitativ aussagekräftigere Daten zu erheben. Die Charakterisierung der Mutanten ließ erkennen, dass keiner der deletierten Bereiche des inlAB-Operons von L. monocytogenes für die beobachtete Translationssteigerung im inlA-Gen bei anaerobem Stoffwechsel verantwortlich zu sein scheint. Das inlB-Gen war innerhalb der hier gezeigten Experimente nicht posttranskriptional reguliert, wie im Vorfeld postuliert. Nach plasmidkodierter Expression verschiedener Bereiche des inlAB-Operons konnte, verglichen mit genomischer Expression, keine Veränderung in der inlA-Expression beobachtet werden. Die mögliche Beteiligung eines potentiellen Regulatorproteins konnte innerhalb dieser Arbeit daher nicht näher eingegrenzt werden. Auch ein Einfluss der regulatorischen Faktoren Hfq und CcpA auf die Expression des InlA Proteins in der L. monocytogenes &#916;aroA-Mutante konnte nicht gefunden werden. Es zeigte sich interessanterweise außerdem, dass weitere Virulenzgene wie actA und hly unter den anaeroben Bedingungen ebenfalls eine Translations-steigerung zeigten. Somit stellt sich abschließend die Frage, ob es sich bei der beobachteten Translationssteigerung des inlA-Gens wirklich um einen durch bestimmte Strukturen in der inlAB-mRNA ausgelösten Mechanismus handelt. L. monocytogenes ist als intrazellulär replizierendes, Gram-positives Bakterium interessant für den Einsatz in immun- und tumortherapeutischen Anwendungen. Attenuierte L. monocytogenes-Stämme wurden dazu bereits erfolgreich im Mausmodell als Trägerbakterien für Impfstoffstrategien eingesetzt. Die gezielte Infektion von Geweben ist jedoch aufgrund des wenig ausgeprägten Zelltropismus der Listerien im Wirt bisher ein Problem für einen Einsatz in bakterienbasierten Anwendungen, wie z.B. der Tumor- oder Gentherapie. Innerhalb dieser Arbeit wurden L. monocytogenes-Stämme konstruiert, bei denen chromosomal das für die Integrase codierende Gen gegen das Gen für das Staphylokokken Protein A (SPA) unter der Kontrolle listerieller Promotoren ausgetauscht wurde. Die erfolgreiche Oberflächenlokalisation von Protein A in der Zellwand von Listerien konnte im Western Blot oder in funktionellen Immunfluoreszenzfärbungen in Mikroskop- und FACS-Analysen nachgewiesen werden. Diese Stämme sollen im Cell Targeting zur gezielten Infektion von Geweben eingesetzt werden. Dazu konnten die Bakterien über Herceptin®-HER2/neu-vermittelte Adhäsion an SK-BR-3-Zellen erfolgreich in diese aufgenommen werden und innerhalb dieser replizieren. Die neu konstruierten Listeria-Stämme zeigten im Mausmodell keine Veränderung in ihrer Virulenz verglichen mit nicht-SPA-exprimierenden Stämmen. Die in dieser Arbeit vorgestellte Antikörper-Rezeptor-vermittlelte Aufnahme der Listerien in Zellen stellt einen neuen, bisher nicht beschriebenen Mechanismus dar, der in vielen therapeutischen Anwendungen zur Infektion spezifischer Gewebe durch Listerien genutzt werden kann. / Listeria monocytogenes is a widely distributed gram-positive pathogenic bacterium, that causes the disease listeriosis in immunocompromised persons. The infectious cycle of this pathogen has been well investigated concerning the mechanisms of pathogenesis. The regulation of the involved virulence factors underlie strong control mechanisms both by regulatory proteins and environmental conditions. The mechanisms that control the expression of listerial virulence genes on the transcriptional and translational level have recently been characterized more closely. For some of these virulence factors, regulatory posttranscriptional riboswitch control mechanisms have recently been newly described in Listeria. In studies prior to this work, a posttranscriptional regulation mechanism has been postulated for the inlAB-Operon, also. As a trigger for the enhanced translation of the inlA and inlB gene the anaerobic metabolism of Listeria has been discussed. In the here presented work, it should be further investigated which part of the inlAB operon comprises regulatory structures for the posttranscriptional regulation at anaerobic growth conditions. To this purpose, different mutants with varying deletions in the inlAB operon have been constructed and transcription and translation of both the inlA and inlB genes observed. A deletion in the aroA gene provokes growth of the bacteria at anaerobic metabolism. This deletion was introduced in the newly constructed strains to be able to compare the different growth conditions. Additionally, gus-reportergene fusion as well as promoter exchange mutants were constructed to be able to raise quantitatively significant data. The characterization of the deletion mutants showed that none of the introduced deletions in the inlAB operon seems to be responsible for the enhanced expression of inlA in anaerobically growing Listeriae. In the here presented experiments, the inlB-gene was not found to be posttranscriptionally regulated, in accordance with a previous report. The plasmid encoded expression of different parts of the inlAB operon did not lead to an alteration in the inlA expression compared to genomically encoded inlA. The possible interaction of a potential regulator protein could thus not be further elucidated. Also, the engagement of the regulators like Hfq or CcpA could not be found. Interestingly, also the virulence genes actA and hly showed an enhanced translational efficiency under the given conditions. Thus, in the herein presented work, the question is raised, whether the observed translation enhancement of the inlA gene is really due to regulatory structures within the inlAB-mRNA. As an intracellularly replicating, Gram positive bacterium, L. monocytogenes is a very interesting means to be used in immuno- or tumortherapeutic applications. Attenuated L. monocytogenes strains have already been successfully applied as carrier strains in vaccine strategies in the mouse model. Due to the distinct cell tropism of Listeriae in the host, the targeted infection of tissue has so far been a problem regarding the use in bacteria-based applications like tumor or gene therapy. In this work, L. monocytogenes strains have been constructed, that contain the chromosomal integrase gene exchanged for the staphylococcal Protein A (SPA) gene under the control of different listerial promoters. The successful translocation and anchoring of SPA in the cell wall was confirmed by either western blot or functionally by immunofluorescence staining using microscopic and FACS analysis. These strains should be used to specifically infect tissues via cell targeting. Through Herceptin®-HER2/neu-mediated adhesion to SK-BR-3 cells the bacteria could be successfully taken up and replicate in these cells. The newly constructed Listeria strains did not show any alteration in virulence in the mouse model when compared to non-SPA-expressing strains. The herein presented antibody-receptor-mediated uptake of the Listeriae in cells demonstrates a new, so far not described mechanism, that can be used in many therapeutic applications involving the infection of specific tissues by Listerae.

Listeria monocytogenes gehört zu den Gram-positiven fakultativ intrazellulären Bakterien, ist aber auch zu einem saprophytischen Leben in freier Natur fähig. Zahlreiche, umfassend charakterisierte Virulenzfaktoren sind für die verschiedenen Schritte im Infektionszyklus von L. monocytogenes erforderlich: InlA und InlB induzieren die Aufnahme von L. monocytogenes in nicht-phagozytische Zellen, LLO und PlcA sind für die Freisetzung aus dem primären Phagosom, ActA für die Zell-zu-Zell-Ausbreitung und LLO zusammen mit PlcA und vor allem PlcB für die Freisetzung der Listerien aus dem sekundären Phagosom erforderlich. Der Hexose-Phosphat-Transporter UhpT ist teilweise für die Vermehrung von L. monocytogenes im Zytosol der infizierten Wirtszelle verantwortlich. Die Gene, die für diese Virulenzfaktoren kodieren, sind größtenteils in dem 9,6 kb-großen Virulenzgencluster LIPI-1 zusammengefasst oder liegen verteilt auf dem Chromosom. Alle diese Virulenzgene werden durch den positiven Regulationsfaktor PrfA (PrfA = positive regulatory factor A) in ihrer Transkription kontrolliert. Das prfA-Gen, kodierend für PrfA, ist benfalls Bestandteil des Virulenzgenclusters (LIPI-1). In bisherigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Verwertung der Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose und Cellobiose zur Hemmung der PrfA-Aktivität in L. monocytogenes führt. Basierend auf Literaturdaten und eigenen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass Komponenten der globalen Kohlenstoff-Katabolitrepression (KKR) oder des PTS (Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase-System)-abhängigen Zuckertransports an der Modulation der PrfA-Aktivität beteiligt sind. Um zu überprüfen, ob über die KKR die Aktivität von PrfA gesteuert wird und dadurch auch die Regulation der PrfA-abhängigen Virulenzgenexpression, wurden in dieser Arbeit pLSV101-Insertionsmutanten für die Gene ccpA (kodierend für CcpA = catabolite control protein A), hprK (kodierend für die HPr-Kinase/Phosphorylase, die HPr am Ser46 phophoryliert) und ptsH (kodierend für das hitzestabile HPr) charakterisiert. Die Insertionsmutanten ::ccpA und ::hprK zeigten sowohl in BHI (undefiniertes nährstoffreiches Medium) als auch in definiertem Minimalmedium (MM) mit 50 mM Glukose ein verlangsamtes Wachstum und eine verringerte [14C]-Glukose-Aufnahme im Vergleich zum Wildtyp (WT). Die ::ptsH-Insertionsmutante war nur zu einem Wachstum in BHI fähig und zeigte erwartungsgemäß (fehlendes HPr) kein Wachstum in definiertem MM mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle. Die ::hprK- und (unter bestimmten Wachstumsbedingungen) auch die ::ptsH–Mutante wiesen sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene eine gesteigerte Expression PrfA-abhängiger Virulenzgene auf. Cellobiose-Verwertung führte auch in der ::hprK-Insertionsmutante zu einer Hemmung der PrfA-Aktivität. Dagegen wurde in der ::ccpA-Insertionsmutante eine geringere Expression aller PrfA-abhängigen Virulenzgene im Vergleich zum WT festgestellt. Die Revertanten RccpA, RhprK und RptsH wiesen im Wachstumsverhalten und in der PrfA-abhängigen Virulenzgenexpression wieder einen wildtypischen Phänotyp auf. Trotz der etwas gesteigerten Virulenzgenexpression zeigte die ::ptsH-Mutante eine deutlich verringerte Replikationsrate in J744 Makrophagen gegenüber dem WT. Die Transkriptomprofile der ::ccpA- und ::hprK-Insertionsmutanten zeigten im Vergleich zum WT viele hochregulierte Gene. Diese umfassen Gene, die v.a. für den PTS-abhängigen Zuckertransport, ABC-Transporter und Enzyme des C- und N-Metabolismus kodieren und im WT wahrscheinlich unter den gegebenen Wachstumsbedingungen unter KKR-Kontrolle stehen. Die erhöhte PrfA-abhängige Virulenzgenexpression in der ::hprK-Mutante korreliert mit der Herunterregulation einiger Gene, die in ihrer Transkription durch einen aktiven PTSvermittelten Glukose-Transport kontrolliert werden. Die gesteigerte PrfA-Aktivität und die Abwesenheit von HPr-Ser46~P (neben CcpA eine wichtige Komponente der KKR) in den ::hprK- und ::ptsH-Insertionsmutanten führten zu der Annahme, dass eine Korrelation zwischen der Menge an HPr-Ser46~P und der PrfA-Aktivität bestehen könnte. Die Untersuchung der PrfA-Aktivität und parallel dazu die Mengenbestimmung von HPr-Ser46~P in MM mit Glukose, Cellobiose und Glyzerin zeigte jedoch, dass weder HPr-Ser46~P noch HPr-His15~P direkte Modulatoren der PrfA-Aktivität sind. Eine direkte Interaktion zwischen HPr-Ser46~P und PrfA konnte mittels Biacor-Analyse ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Auch in vitro Transkriptions-Studien zeigten keinen inhibitorischen Effekt von HPr-Ser46~P auf die Initiation der Transkription bei PrfA-abhängigen Promotoren (S. Müller-Altrock, persönliche Mitteilung). Interessanterweise war bei einem aktiven Glukose-Transport, bei Bedingungen also, wo die EIIA-Komponenten aller aktiven Glukose-spezifischen PTS im unphosphoryliertem Zustand vorliegen (EIIA-Komponenten übertragen über EIIB das aktive Phosphat auf die über EIIC in die Bakterienzelle transportierte Glukose), die PrfA-Aktivität gering. Erst in der spätlogarithmischen bis stationären Wachstumsphasen, wenn Glukose nur noch in geringem Umfang von der Bakterienzelle aufgenommen wird und die Glukose-spezifischen EIIA-Komponenten in phosphorylierter Form vorliegen, steigt die PrfA-Aktivität. Die Verwertung der PTS-unabhängigen Kohlenstoffquelle Glyzerin zeigte gegenüber den PTS Zuckern Glukose und Cellobiose schon in der frühen Wachstumsphase eine erhöhte PrfA-Aktivität. Demnach scheint sich die Expression spezifischer PTS und der Phosphorylierungszustand von EIIA dieser PTS regulatorisch auf die PrfA-Aktivität auszuwirken. Die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ist noch nicht vollständig aufgeklärt (R. Stoll, unveröffentlichte Ergebnisse). Doch kann aufgrund des Wachstumsverlustes der ::ptsH-Insertionsmutante in Glukose-haltigem MM davon ausgegangen werden, dass die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ausschließlich PTS-abhängig erfolgt. Ein Glukose-spezifisches PtsG, das in B. subtilis und anderen Bakterien als wichtiger Glukose-Transporter beschrieben wurde, existiert in L. monocytogenes nicht. Hier konnte nur eine PtsG-spezifische EIIA-Komponente (kodiert von lmo1017) identifiziert werden. Wachstumsuntersuchungen in definiertem MM mit den Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose, Cellobiose und Glyzerin ergaben keinen Wachstumsunterschied zwischen der in dieser Komponente defekten &#916;eIIAGlc-Mutante und dem WT. Die PrfA-Aktivität dieser Mutante war leicht erhöht, was sich in einer etwas gesteigerten ActA- bzw. PrfA-Expression und einer höheren LLO-Aktivität gegenüber dem WT ausprägte. Es konnte jedoch keine eindeutige Interaktion zwischen dieser gereinigten EIIAGlc-Komponente und dem PrfA-Protein mittels Biacor-Analyse nachgewiesen werden (S. Müller-Altrock und G. Seidel, persönliche Mitteilung). Welche EIIA-Komponenten spezifischer PTS an der Modulation der PrfA-Aktivität beteiligt sind, konnte in dieser Arbeit damit nicht abschließend geklärt werden. Der Transport von phosphorylierten Zuckern, wie Glukose-1-, Glukose-6- oder Mannose-6- Phosphat, erfolgt in L. monocytogenes über den Hexose-Phosphat-Transporter UhpT, der von dem strikt PrfA-abhängig uhpT-Gen kodiert wird. Durch die Zugabe von Amberlite XAD-4 zu LB-Medium oder durch vorherigen Anzucht in Glyzerin-haltigem MM, Bedingungen, die sich stimulierend auf die PrfA-Aktivität auswirken, konnte ein effizientes Wachstum von L. monocytogenes in Glukose-6-Phosphat-haltigem Medium erreicht werden. Obwohl die Kohlenstoff-Verbindungen (Glukose, Cellobiose und Glukose-6-Phosphat) in die Glykolyse eingeschleust werden, führte die Verwertung von Glukose-6-Phosphat zur Aufhebung der KKR. Dies konnte durch vergleichende Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und an der Bestimmung der HPr-Ser46~P Meng gezeigt werden. Die PTS-unabhängige Glukose-6-Phosphat-Aufnahme führt, ähnlich wie die von Glyzerin, zu einer erhöhten Aktivität von PrfA. Neben Glyzerin können auch Dihydroxyaceton (Dha) und Pyruvat (letztere allerdings mit niedriger Wachstumseffizienz), nicht aber Glyzerin-3-Phosphat in vitro als C3-Quellen dienen. Da die ::ptsH-Insertionsmutante kein Wachstum in Glyzerin- oder Dha-haltigem Medium zeigte, lässt sich vermuten, dass die listeriellen Glyzerin-Kinase(n) (GlpK), ähnlich wie die von B. subtilis, durch HPr-His15~P aktiviert werden muss und die Dha-Kinase(n) (DhaK) von L. monocytogenes ebenfalls HPr-His15~P als Kofaktor für die Phosphorylierung von Dha verwendet. Der Glyzerin-Metabolismus in L. monocytogenes wurde vor allem über Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und Real-time RT-PCR Untersuchungen näher charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes mehrere Gene besitzt, die in Glyzerin-haltigem Medium verstärkt exprimiert werden und vermutlich am Glyzerin- bzw. Dha-Metabolismus beteiligt sind. L. monocytogenes besitzt zwei Dha-Kinasen (kodiert von lmo0347-48 und lmo2695-96), die beide eine hohe Homologie zur DhaK aus E. coli besitzen. Eine Deletion beider Dha-Kinasen (&#916;dhaK = &#916;lmo0347-48/lmo2695-96) führte zu einer starken Wachstumshemmung in Glyzerin-haltigem MM und zur weitgehenden Inaktivierung von PrfA. Die &#916;dhaK- und die &#916;glpD/dhaK-Mutante wiesen in J744 Makrophagen eine verringerte Replikationsrate im Vergleich zum WT auf, was für eine Verwertung von Glyzerin und/oder Dha durch L. monocytogenes im Zytoplasma von Wirtszellen spricht. Da diese Mutanten aber noch –wenn auch mit verringerter Effizienz – in diesem Zellkompartiment der Makrophagen wachsen können, muss L. monocytogenes wohl auch in der Lage sein, weitere Kohlenstoffquellen dieser Wirtszelle verwerten zu können. / Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular bacterium of mammals naturally inhabiting decayed plant matter in the soil. Several well-characterised virulence factors are necessary for the different steps in the infection cycle of L. monocytogenes: InlA and InlB for active internalization of L. monocytogenes into nonprofessional phagocytic cells, LLO and PlcA for the release of the primary phagosome, ActA for cell-to-cell spreading, LLO together with PlcA and mainly PlcB are responsible for the escape from the secondary phagosome. The hexose-phosphate-transpoter (UhpT) is partially involved in intracellular replication in the cytosol of the host. The genes that encode these virulence factors are clustered mainly in a single 9,6 kb region of the chromosome (LIPI-1) or dispersed elsewhere on the listerial chromosome. The transcriptions of these genes are regulated by the positive regulatory factor A ( PrfA), encoded by prfA, which is itself a member of the same gene cluster (LIPI-1). Previous studies have indicated that the utilization fermentable sugars like glucose, mannose, and cellobiose repressed the PrfA-controlled virulence gene expression in L. monocytogenens. Based on the published results and the results obtained in this study, it is tempting to hypothesise that components of the carbon catabolite repression (CCR) or of the PTS- (Phosphoenolpyruvate Phosphotransferase System) dependent sugar transport are involved in modulation of PrfA activity. To show that components of CCR could be involved in modulation of PrfA activity and therfore in regulation of PrfA-dependent virulence gene expression in L. monocytogenes, insertion mutants of ccpA (coding for CcpA = catabolite control protein A), hprK (coding for HPr kinase/phosphatase which phosphorylates HPr at Ser46) and ptsH (coding for HPr) were characterised. The ::ccpA and ::hprK mutants showed reduced growth in BHI (undefined nutrient rich medium) as well as in defined minimal medium (MM) with 50 mM glucose and decreased [14C]-glucose uptake compared to wild-type. The ::ptsH mutant could only grow in a rich culture medium and as expected was unable to grow in MM with glucose as sole carbon source because of its inability to produce HPr. ::hprK and ::ptsH mutant (under certain growth conditions) too showed increased expression of PrfA-controlled genes both at the transcriptional and translational level. Cellobiose utilisation in the ::hprK mutant led to inhibition of PrfA activity. In contrast, the ::ccpA mutant showed decreased expression of the PrfA-dependent virulence genes in comparison to wild-type. Revertants, RccpA RhprK and RptsH again showed a wild type phenotype with respect to growth and expression of the PrfA regulated genes. In spite of slight increased virulence gene expression, the ::ptsH mutant showed reduced replication in J744 macrophages compared to wild-type. The transcript profiles of the::ccpA and ::hprK mutants revealed in comparison to the wildtype several upregulated genes. Amongst others, genes coding for PTS-dependent sugar transport, ABC-transporter and enzyms of the C- and N-metabolism were upregulated, suggesting that they were repressed in wild-type under those growth conditions. Upregulation of the PrfA-dependent virulence genes in the ::hprK mutant correlates with the down-regulation of genes which are controlled by the efficiency of PTS-mediated glucose transport. The increased PrfA activity and the absence of the HPr-Ser46~P (beside CcpA a main key player of CCR) in ::hprK and ::ptsH mutants led to assumption that there is an inverse correlation between the level of HPr-Ser46~P and PrfA activity. However, the determination of the PrfA activity and quantification of the amount of HPr-Ser46~P in the medium with glucose cellobiose and glycerol respectively showed that neither HPr-Ser46~P nor HPr-His15~P could act as direct negative modulators of PrfA activity. Recent studies aimed at demonstrating direct binding of purified HPr-Ser46~P and PrfA using Biacore assays also failed. In addition in vitro transcription showed no inhibition effect by HPr-Ser46~P to initiated transcription from several PrfA-dependent promoters (S. Müller-Altrock, personal communication). Interestingly, during active glucose transport, conditions where EIIA components of active glucose-specific PTS are unphosphorylated (EIIA components transfer the phosphate via EIIB to the glucose being tranported by EIIC into the bacterial cell) the PrfA activity is low. In the late log phase and the early stationary phase where less glucose is taken up by the bacteria and glucose-specific EIIA components are phosphorylated, the PrfA activity increased. L. monocytogenes grown in the presence of the non-PTS carbon source glycerol showed already in the early growth phase a higher PrfA activity in comparison to growth with PTS-dependent sugars like glucose or cellobiose. Based on these results, the expression of specific PTS and the phosphorylation state of EIIA componentes of these PTS seams to affect the regulation of PrfA activity. The exact mechanism of glucose uptake in L. monocytogenes is still unclear (R. Stoll; unpublished data). Due to the growth deficiency of the ::ptsH mutant in glucose-containing MM glucose uptake must be PTS-dependent. The glucose-specific PtsG described for B. subtilis and other bacteria as important glucose transporter is not present in L. monocytogenes. Only a PtsG-specific EIIA component (encoded by lmo1017) has been identified. Growth analysis in defined MM supplemented with glucose, mannose, cellobiose and glycerol respectively showed no differences in growth between eIIAGlc mutant and wildtype. The PrfA activity in that mutant was slightly increased, shown in a slight increased expression of ActA and PrfA and a higher LLO activity compared to wild-type. However, studies aimed at demonstrating direct binding of purified EIIAGlc and PrfA with in Biacore assays failed (S. Müller-Altrock and G. Seidel, personal communication). Which of the EIIA components of specific PTS are involved in modulation of PrfA activity needs further clarification. Transport of phosphate sugars like glucose-1-, glucose-6- or mannose-6-phosphate is mediated by the hexose-phosphate-transporter UhpT encoded by the strictly PrfA-dependent gene uhpT. Addition of Amberlite XAD-4 to LB-Medium or preincubation in glycerolcontaining MM conditions which induce PrfA activity led to efficient growth of L. monocytogenes in glucose-6-phosphate containing medium. Even though, glucose, cellobiose and glucose-6-phosphate are catabolised via glycolyis, glucose-6-phosphate utilisation led to deregulation of the CCR. This deregulation was shown on the basis of wholegenome-transcriptom analysis and quantification of the amount of HPr-Ser46~P. The non-PTS-dependent transport of glucose-6-phosphate resulted similar to that of glycerol to a higher activation of PrfA. Besides glycerol, dihydroxyacetone (dha) and pyruvate (with lower growth efficiencies) but not glycerol-3-phosphate seem to be suitable C3 sources for L. monocytogenes. The ::ptsH mutant was unable to grow in glycerol- or dha-containing medium which suggests that the listerial glycerol kinase(s) (GlpK) similar to that of B. subtilis is activated by HPr-His15~P and that the dha kinase(s) (DhaK) also use HPr-His15~P as a cofactor for dha phosphorylation. The glycerol metabolism of L. monocytogenes was mainly characteriezed by wholegenome transcriptome analysis and Real-time RT-PCR. It was shown that L. monocytogenes exhibits many genes highly upregulated in glycerol-containing MM indicating an involvement in glycerol and dha metabolism, respectively. L. monocytogenes possesses two dha kinases (encoded by lmo0347-48 and lmo2695-96) with high sequence homology to the dha kinase of E. coli. Deletion of both dha kinases (&#916;dhaK = &#916;lmo0347-48/lmo2695-96) led to high growth inhibition and to almost complete PrfA inactivation. The dhaK and glpD/dhaK mutants exhibited a reduction in intracellular replication in J744 macrophages compared to wild-type, suggesting an utilisation of glycerol and/or dha in the host cytosol by L. monocytogenes. The fact that these mutants could still grow in this cell compartment of macrophages (however with lower efficiencies) indicates that L. monocytogenes must be able to utilise additional carbon sources in the host cell.