Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Exposure cigarette smoke (CS) during prenatal life is the leading cause of preventable premature death. In this study, we explored the hypothesis that in vitro exposure of fetal lung cells to cigarette smoke extract (CSE) may result in the alteration of apoptosis through activation of caspase-3. Alongside we compared the responses of fetal lung cells with A549 cells and rat periodontal ligament (PDL) fibroblasts exposed to CSE in a dose dependent manner. Caspase-3 activity and inhibition was measured using a fluorometric assay. Cell viability in smoke exposed cells was measured using MTT formazan assay. Caspase-3 expression and cellular localization was detected by western blot analysis and immunofluorescence. Our results indicate that caspase-3 activity was significantly (p < 0.05) elevated and cell viability was significantly inhibited in fetal rat lung cells exposed to 10% or 15 % (v/v) CSE. No significant differences were observed in the caspase-3 activity or cellular viability in A549 cells and rat PDL fibroblasts exposed to 5%, 10% or 15% (v/v) CSE. Activation of caspase-3 in fetal lung connective tissue and alveolar epithelial cells may be one of the reasons for the developmental pulmonary toxicity induced by CSE.

Exposure cigarette smoke (CS) during prenatal life is the leading cause of preventable premature death. In this study, we explored the hypothesis that in vitro exposure of fetal lung cells to cigarette smoke extract (CSE) may result in the alteration of apoptosis through activation of caspase-3. Alongside we compared the responses of fetal lung cells with A549 cells and rat periodontal ligament (PDL) fibroblasts exposed to CSE in a dose dependent manner. Caspase-3 activity and inhibition was measured using a fluorometric assay. Cell viability in smoke exposed cells was measured using MTT formazan assay. Caspase-3 expression and cellular localization was detected by western blot analysis and immunofluorescence. Our results indicate that caspase-3 activity was significantly (p < 0.05) elevated and cell viability was significantly inhibited in fetal rat lung cells exposed to 10% or 15 % (v/v) CSE. No significant differences were observed in the caspase-3 activity or cellular viability in A549 cells and rat PDL fibroblasts exposed to 5%, 10% or 15% (v/v) CSE. Activation of caspase-3 in fetal lung connective tissue and alveolar epithelial cells may be one of the reasons for the developmental pulmonary toxicity induced by CSE.

Ο ρινικός πολύποδας (ΡΠ) είναι μια χρόνια φλεγμονώδης νόσος του ρινικού βλεννογόνου, η οποία χαρακτηρίζεται από διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων, όπως ηωσινόφιλα, λεμφοκύτταρα και πλασμοκύτταρα, τροποποιήσεις στη διαφοροποίηση του επιθηλίου και ανάπλαση ιστού, που περιλαμβάνει υπερπλασία της βασικής μεμβράνης, συσσώρευση εξωκυττάριου υλικού και οίδημα. Ο παράγοντας αναστολής της μετανάστευσης μακροφάγων (MIF) είναι μία μοναδική κυτταροκίνη με σημαντικό ρόλο στο σηπτικό σόκ και στις χρόνιες φλεγμονώδεις και αυτοάνοσες ασθένειες.Παράγεται από ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα, μακροφάγα αλλά και από ποικιλία άλλων κυττάρων. Εκτός των άλλων, έχει βρεθεί ότι επάγει την έκφραση της IL-6 από διάφορα κύτταρα και ανταγωνίζεται την κατασταλτική επίδραση των γλυκοκορτικοειδών στην έκφρασή της. Απαντάται σε αυξημένα επίπεδα στο ρινικό πολύποδα. Ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-β1 (TGF-β1) θεωρείται ένας αντιφλεγμονώδης παράγοντες, ο οποίος ανταγωνίζεται τη δράση της IL-1β και του TNF-α, στην έκφραση της ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3. Διεγείρει επίσης την έκφραση του ΤΙΜΡ-1, του κολλαγόνου τύπου Ι και της IL-6 και λόγω των δράσεών του αυτών εμπλέκεται ισχυρά στις διαδικασίες ίνωσης. Απαντάται σε σημαντικά επίπεδα στο ρινικό πολύποδα. Η IL-6 είναι μία Th2 πολυλειτουργική κυτταροκίνη η οποία εμπλέκεται σε ποικίλες φλεγμονώδεις καταστάσεις. Διεγείρει την ανάπτυξη των ινοβλαστών, αυξάνει τη σύνθεση και εναπόθεση του κολλαγόνου και μειώνει την αποικοδόμησή του. Απαντάται σε αυξημένα επίπεδα στο ρινικό πολύποδα και θεωρείται σημαντικός παθαγενετικός παράγοντας μέσω της επαγωγής του σχηματισμού των πλασμοκυττάρων και της σύνθεσης συστατικών του στρώματος, και της προαγωγής της σύνθεσης και εναπόθεσης κολλαγόνου και της ανάπλασης ιστού. Σκοπός της παρούσης εργασίας είναι η μελέτη της συμβολής του MIF και του TGF-β1 στη παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα, των σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται, και η διερεύνηση της πιθανής συνεργειακής δράσης τους στην έκφραση της κυτταροκίνης. Τόσο ο TGF-β1 (0,01-1 ng/ml) όσο και ο MIF (1-100 ng/ml) προκάλεσαν διέγερση της έκφραση της IL-6 σε ινοβλάστες ρινικού πολύποδα κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο, η οποία κατεστάλλει σημαντικά από αναστολέις των ΜΑΡ κινασών και της ΡΙ-3 κινάσης. Ο TGF-β1 (1 ng/ml) προκάλεσε επίσης χρονοεξαρτώμενη αύξηση στα επίπεδα της IL-6 γιά χρόνο επώασης μέχρι 2 ώρες, τα οποιά έμεινα σταθερά στη συνέχεια μέχρι τις 72 ώρες επώασης, επαγωγή της παραγωγής ενδοκυτταρικών ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) με μέγιστο σε δύο χρόνους επώασης 20 και 180 λεπτά, και ενεργοποίηση των ERK κινασών από 15-60 λεπτά επώασης, με μέγιστη ενεργοποίηση στα 30 λεπτά, και στη συνέχεια πτώση στα επίπεδα του μάρτυρα. Ενώ ο MIF σε συγκέντρωση 1-100 ng/ml προκάλεσε μικρή μείωση στην έκφραση της φωσφατάσης-1 των ΜΑΡΚ (ΜΚΡ-1), ο TGF-β1 αντίθετα, σε συγκέντρωση 1 ng/ml προκάλεσε αύξηση στην έκφραση της ΜΚΡ-1 σε δύο χρόνους επώασης 0,5 και 24 ώρες. Μετά από επώαση των ινοβλαστών ρινικού πολύποδα παρουσία TGF-β1 (1 ng/ml) και MIF (100 ng/ml) μαζί, δεν παρατηρήθηκε συνεργειακή επίδραση στην έκφραση της IL-6. Ενώ τόσο ο TGF-β1 όσο και ο MIF προκάλεσαν διέγερση στην έκφραση της IL-6 από ινοβλάστες πνεύμονα, δεν παρατηρήθηκε και πάλι συνεργειακή επίδρασή τους στην έκφραση της κυτταροκίνης αυτής. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι ο MIF, ενώ ανταγωνίζεται την κατασταλτική επίδραση των γλυκοκορτικοειδών στην έκφραση της IL-6 μέσω της ρύθμισης των επιπέδων της ΜΚΡ-1, δεν έχει την ίδια επίδραση στην έκφραση της IL-6 από τον TGF-β1, μέσω ρύθμισης της έκφρασης της φωσφατάσης αυτής. Από την άλλη μεριά η επαγωγή της έκφρασης της ΜΚΡ-1 από τον TGF-β1 φαίνεται να μην επηρεάζει την παραγωγή της IL-6 για μικρούς χρόνους επώασης, μέχρι 2 ώρες, πιθανόν λόγω της ανασταλτικής επίδρασης των ROS, που επάγονται από τον TGF-β1, στη δράση της ΜΚΡ-1, ενώ την επηρεάζει για μεγάλους χρόνους επώασης , εξ ού και τα σταθερά επίπεδα της IL-6 μέχρι και 72 ώρες επώασης. / Nasal polyp (NP) is a chronic inflammatory condition of nasal mucosa, characterized by infiltration of inflammatory cells such as eosinophils, lymphocytes and plasma cells, alterations in epithelial differentiation and tissue reconstruction, involving hyperplasia of basal membrane, accumulation of extracellular material and edema. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a unique cytokine, the role of which in chronic inflammatory and autoimmune diseases and septic shock pathogenesis is very important. MIF is produced by activated T-lymphocytes, macrophages and a plethora of other cells. MIF appears to antagonize the suppressive effect of glucocorticoids as well as induce the expression of IL-6 in multiple cells. High levels of MIF are detected in nasal polyps. Transforming growth factor- β1 (TGF-β1) is an anti-inflammatory factor antagonizing the positive effect of IL-1β and TNF-α on the expression of MMP-1 and MMP-3, TGF-β1 also stimulates the expression of TIMP-1, collagen type I and IL-6; because of these effects, TGF-β1 is involved in the process of fibrosis. TGF-β1 levels in nasal polyps are significantly elevated. IL-6 is a cytokine participating in Th2 response and consequently is involved in a subset of inflammatory reactions. IL-6 stimulates the growth of fibroblasts, increases the production and deposition of collagen and it decreases its degradation. IL-6 is found in nasal polyps at elevated levels and it is thought to be an important pathogenic factor acting mainly in tissue reconstruction, stimulation of plasma cell differentiation, production of stromal material, promotion of collagen synthesis and deposition. The purpose of this paper is to study the effect of MIF and TGF-β1 in IL-6 production by fibroblasts isolated from nasal polyps, dissect the signaling pathways involved, and investigate their synergistic effect on the production of IL-6. Both TGF-β1 (0, 01-1 ng/ml) and MIF (1-100 ng/ml) induced IL-6 expression in nasal polyp fibroblasts in a dose-dependent manner. This effect was significantly suppressed by inhibitors of MAP and PI-3 kinase pathways. TGF-β1 (1 ng/ml) also induced IL-6 expression within 2 hours of administration. Elevated IL-6 levels remained unchanged for 72h further. TGF-β1 also promoted the production of intracellular reactive oxygen species (ROS), which peaked in 20 and 180 minutes and the activation of ERK kinase, peaked in 30 minutes. While MIF, at a concentration of 1-100 ng/ml, caused a slight decrease in the expression of phospatase-1 of MAPK (MKP-1), TGF-β1, at a concentration of 1 ng/ml, increased the expression of MKP-1. No synergistic effect on IL-6 expression was detected after incubating nasal polyp and lung fibroblasts together with TGF-β1 (1 ng/ml) and MIF (100 ng/ml). In conclusion, while MIF antagonizes the suppressive effect of glucocorticoids on the expression of IL-6 by regulating the levels of MKP-1, it fails to antagonize the TGF-β1 inducing effect on IL-6 via MKP-1. The induction of MKP-1expression by TGF-β1 is not affecting the production of IL-6 after short incubation periods; this effect can be explained by the inhibitory effect of TGF-β1 induced ROS on MKP-1. After prolong incubation with TGF-β1 (up to 72 hours), IL-6 levels remain elevated.

Les macrophages (MΦ), des cellules clefs de la réponse immunitaire peuvent répondre à des contaminants environnementaux comme les particules diesel (DEP), des polluants atmosphériques récemment classés cancérigènes pour l'Homme. Les MΦ sont des cellules hétérogènes et plastiques qui s'activent en fonction de leur microenvironnement soit en MΦ M1 (dits classiquement activés ou pro-inflammatoires) sous l'effet de l'INFγ et du LPS soit en MΦ M2 (dits alternativement activés ou réparateurs) sous l'effet de l'IL-4 et/ou de l'IL-13. Les effets des DEP sur la polarisation M1/M2 des MΦ restent peu documentés. Nous avons dans un premier temps caractérisé l'expression des marqueurs des MΦ différenciés in vitro en présence de M-CSF à partir de monocytes humains et polarisés en sous-type M1 ou M2. Nos principaux résultats montrent que les MΦ différenciés au M-CSF considérés comme des MΦ anti-inflammatoires, sont en réalité capables de s'activer vers un phénotype M1 après une stimulation au LPS/IFNγ. De plus, les marqueurs mis en évidence au cours de ce travail ont permis d'évaluer l'impact d'extraits organiques de DEP (DEPe) sur la polarisation des MΦ et plus généralement sur leur physiologie. Les DEPe altèrent l'expression de certains marqueurs M1 et M2 des MΦ, sans toutefois provoquer d'inhibition globale des processus de polarisation M1 et M2 ou de transition d'un phénotype vers un autre. Cette altération du phénotype est associée à une diminution de la réponse inflammatoire LPS-dépendante dans les MΦ M1 et des capacités chimiotactiques des MΦ M2. Les DEPe diminuent la sécrétion de certaines cytokines et chimiokines comme l'IL-6, l'IL-12p40 et le CCL18 via l'activation d'AhR et/ou de Nrf2. Parallèlement, nous montrons que les MΦ M1 et M2 exposés aux DEPe sécrètent le platelet deried growth factor B (PDGF-B), un facteur de croissance profibrosant, via l'activation d'AhR en quantité suffisante pour stimuler la prolifération de fibroblastes pulmonaires. Au total, ces travaux démontrent que les DEP possèdent des propriétés immunotoxiques vis-à-vis de la physiologie des macrophages humains polarisés in vitro. Cette immunotoxicité pourrait participer aux effets délétères de ces contaminants environnementaux urbains sur la santé humaine. / Macrophages (MΦ), well-known to play a key role in immune response, also respond to environmental toxic chemicals such as diesel exhaust particles (DEP), an air pollutant recently classified as carcinogenic to humans. MΦ are heterogeneous and plastic cells which activate according to their microenvironment into either an M1 subtype (so called classically activated or pro-inflammatory) under IFNγ and LPS stimulation or an M2 subtype (so called alternatively activated or anti-inflammatory) under IL-4 and/or IL-13 stimulation. However, potential effects of DEPs on M1/M2 MΦ polarization remain poorly documented. First, we characterized the expression marker of in vitro M-CSF-differentiated MΦ from human monocytes and activated into the M1 or M2 subtypes. Our main results show that M-CSF-generated MΦ considered as anti-inflammatory are actually able to switch to an M1 phenotype after IFNγ/LPS stimulation. Furthermore, the markers identified in this study were used to assess the impact of organic extracts of DEP (DEPe) on MΦ polarization and more generally on their physiology. DEPe alter some M1 and M2 markers expressed by polarized MΦ, without causing the overall inhibition of the M1 and M2 polarization process or the switch to a different phenotype. This phenotype alteration is associated with a decrease in the LPS-dependent inflammatory response in M1 MΦ and the chemotactic capacities in M2 MΦ. DEPe decrease the secretion of some cytokines and chemokines such as IL-6, IL-12p40 and CCL18 via AhR and/or Nrf2 activation. At the same time, we show that M1 and M2 MΦ in response to DEPe are able to secrete a sufficient level of a pro-fibrotic growth factor, the platelet derived growth factor B (PDGF-B) via AhR activation, leading to stimulation of lung fibroblast proliferation. Finally, these works show that DEPe have immunotoxic properties with regards to the physiology of human in vitro polarized MΦ. This immunotoxicity may then contribute to the deleterious effects of these urban environmental contaminants on human health.