Das Nebennierenkarzinom ist eine seltene Erkrankung mit einer limitierten Prognose. Bei zahlreichen Tumorentitäten wurde gezeigt, dass das Immunsystem entscheidenden Einfluss auf den Erkrankungsverlauf und die Prognose hat. Aufgrund der geringen Prävalenz gab es entsprechende Studien beim Nebennierenkarzinom bisher nicht. Dabei lag die Vermutung nahe, dass die Interaktion Tumor - Immunsystem beim Nebennierenkarzinom besonders ausgeprägt ist, da dieses häufig Glukokortikoide sezerniert, die bekanntermaßen stark die unterschiedlichen Immunzellen beeinflussen. Im ersten Teil der Arbeit zeigte sich, dass Patienten mit Nebennierenkarzinom (n=163) im Vergleich zu gesunden Probanden (n=19) eine signifikant erhöhte Frequenz regulatorischer T-Zellen im peripheren Blut aufweisen (9,25% vs. 4,4%). Das Ausmaß des Glukokortikoid-Exzesses dagegen hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Anzahl dieser Immunzellen. Bezogen auf die Prognose war eine größere Anzahl regulatorischer T-Zellen im Blut mit einer schlechteren Prognose beim Nebennierenkarzinom assoziiert (HR für Tod: 1,8854 (95% CI 1,088-3,158), p=0,023). Bei der Analyse des Tumorimmuninfiltrats (n=58) zeigte sich, dass Nebennierenkarzinome, ihre Rezidive und Metastasen durch CD8 positive zytotoxische T-Zellen, CD4 positive T-Helfer-Zellen, FoxP3 positive regulatorische T-Zellen und CD209 positive dendritische Zellen infiltriert werden. Insgesamt ist die Anzahl der Immunzellen im Tumor allerdings als relativ gering anzusehen. In der Korrelation des Immuninfiltrats mit dem Gesamt- und Rezidiv-freien Überleben zeigten sich keine signifikanten Ergebnisse. Es zeigte sich lediglich bei den T-Helferzellen ein leichter Trend zu einem längeren Überleben, je größer das Immuninfiltrat war (HR für Tod 0,63 (95% CI: 0,305-1,291), p=0,205). Im zweiten Teil der Arbeit wurde speziell die Rolle von Glukokortikoiden in vivo auf regulatorische T-Zellen untersucht. Hierbei zeigte sich in einem Mausmodell, entgegen der Hypothese, dass Glukokortikoide Treg induzieren, dass die Behandlung gesunder Mäuse mit Dexamethason zu einem dosisabhängigen Abfall der absoluten Zahl der regulatorischen T-Zellen führte (z. B. im Blut nach 3 Tagen: 1,3x104 in der 0,8 mg/kg Kohorte vs. 0,07x104 in der 100 mg/kg Kohorte), und sich dies auch bei der relativen Zahl der FOXP3-positiven T-Zellen bestätigte. Ähnlich fielen dann auch die Ergebnisse bei immunkompetenten Menschen aus. Hierbei kam es durch die 14-tägige Steroidgabe zwar zu einer milden T-Zell-Lymphozytose, allerdings war keine relevante Veränderung der Anzahl der zirkulierenden regulatorischen T-Zellen zu erkennen; insbesondere kein Anstieg der Selben (z. B. Anteil der FOXP3-positiven T-Zellen 4,0% vs. 3,4%; p<0.05). Damit widerlegen diese in vivo Daten die weitläufige Vermutung, dass eine kurzfristige Glukokortikoid-Gabe zu einer Induktion von regulatorischen T-Zellen führt. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass - wie bei anderen Tumoren auch - regulatorische T-Zellen bei Patienten mit Nebennierenkarzinom gehäuft vorkommen. Allerdings spielt hierbei der Glukokortikoid-Exzess der Tumore scheinbar keine wesentliche Rolle. Diese fehlende Interaktion zwischen den Steroiden und dieser Immunzell-Subpopulation bestätigt sich dann auch bei den in vivo Arbeiten an gesunden Mäusen und Menschen. Aus diesem Grund ist der Einfluss von Glukokortikoiden auf regulatorische T-Zellen zumindest teilweise neu zu bewerten. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare disease with a limited prognosis. Numerous tumour entities showed that the immune system has significant influence on course of disease and prognosis. There were no appropriate studies dealing with ACC so far due to the low prevalence. Thereby the assumption is suggested that the interaction between tumour and immune system in ACC are particularly distinct as it frequently secretes glucocorticoids which, as is known, strongly influences the different immune cells. In the first part of the thesis it became apparent that patients with ACC (n=163), compared to healthy subjects (n=19), had a significantly increased frequency of regulatory T-cells (Treg) in peripheral blood (9.25 % vs. 4.4 %). The extent of glucocorticoid excess in contrast had no significant influence on the number of these immune cells. With regard to the prognosis, a higher number of Treg in blood was associated with a poorer prognosis at ACC (HR for death 1.8854 (95 % Cl 1.088-3.158), p=0.023). The analysis showed that ACC, their recurrences and metastasis were infiltrated by CD8 positive cytotoxic T-cells, CD4 positive T-helper cells, FoxP3 positive regulatory T-cells and CD209 positive dendritic cells. However, the number of immune cells in the tumour was relatively small. In the correlation of the infiltrating immune cells with the overall and progression-free survival no significant differences were discerned. There was only a slight tendency towards a longer survival, the larger the number of infiltrating CD4-cells was (HR for death 0.63 (95 % Cl 0.305-1.291), p=0.205). In the second part of the thesis, the role of glucocorticoids in vivo on Treg was analysed. In a mouse model treatment of healthy mice with dexamethasone led to a dose-dependent decrease of the absolute number of Treg (e.g. in blood after 3 days: 1.3x104 in the 0.8 mg/kg cohort vs. 0.07x104 in the 100 mg/kg cohort), contrary to the hypothesis that glucocorticoids induce Treg. This also was confirmed at relative number of FoxP3-positive T-cells. Immunocompetent people achieved similar results. 14-day steroid application resulted in a mild T-cell lymphocytosis. However, there was no relevant alteration in the number of circulating Treg, especially no increase of them (e.g. proportion of FoxP3-positive T-cells 4.0 % vs. 3.4 %, p<0.05). Thereby these in vivo data disproved the common assumption that a short-term glucocorticoid application leads to an induction of regulatory T-cells. To conclude, this thesis showed that -as with other tumours- Treg occur cumulatively in patients with ACC. Nonetheless, the glucocorticoid-excess seemingly played no considerable role. This failing interaction between steroids and this immune cell-subpopulation is proven in in vivo works with healthy mice and humans. For this reason, the influence of glucocorticoids on Treg has to be revaluated partially.

Myocardial B-cell infiltration after LAD occlusion in mice is driven by CXCL13 After myocardial infarction, the immune system is activated and regulates wound healing and remodeling processes in the heart. While the role of T cells has been elucidated already, the function of B cells in myocardial infarction remained relatively unclear until now. It is, however, already known that B cells are of importance in healing processes in other tissues, for example in the skin. Our studies therefore addressed the role and function of B cells in healing and early remodeling processes in the myocardium after infarction. Under physiological conditions, only few B cells can be found in the heart. After myocardial infarction, however, which we modelled with a permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD) in C57BL/6J mice, we could demonstrate that B lymphocytes accumulate in the early phase after tissue injury (days one to seven) in the myocardium. To detect B cells, we performed immunofluorescence stainings on cryosections of infarcted hearts using an anti-B220 antibody. Quantitative analysis of tissue infiltration revealed that B cells peaked at day seven. In flow cytometry, we further characterized the B cells infiltrating infarcted tissue. We found that most of them were mature B cells (IgM+, IgD+). Next, we wanted to outline a potential mechanism responsible for B-cell infiltration to the site of tissue injury. We therefore performed ELISA experiments revealing that CXCL13 was upregulated in scar tissue. Antibody-mediated neutralization of CXCL13 verifiably attenuated B-cell infiltration. Treated mice also showed – in the tendency – smaller infarct sizes and an improved survival. In conclusion, we could show that B lymphocytes infiltrate the myocardium after MI in mice following a local CXCL13 gradient and that it is, most likely, beneficial to inhibit this process. / Nach einem Herzinfarkt wird das Immunsystem aktiviert und bestimmt die Wundheilung sowie das Remodeling im Herzen. Während die Rolle von T-Zellen [dabei] bereits relativ gut untersucht ist, war die Funktion von B-Zellen beim Myokardinfarkt bis heute relativ unklar. Man weiß bisher allerdings, dass B-Zellen eine wichtige Rolle in Heilungsprozessen in anderen Geweben spielen, z.B. in der Haut. Unsere Untersuchungen beschäftigten sich daher mit der Rolle und Funktion von B-Zellen nach experimentellem Herzinfarkt im Mausmodell. Unter physiologischen Bedingungen finden sich nur wenige B-Zellen im Herzen. Nach Herzinfarkt, den wir mithilfe einer permanenten Ligatur der linken Herzkranzarterie in C57BL/6J-Mäusen induzierten, konnten wir jedoch zeigen, dass B-Zellen in der frühen Phase nach Gewebeschädigung (Tag eins bis sieben) im Myokard akkumulieren. Um B-Zellen zu detektieren, führten wir Immunfluoreszenz-Färbungen mit einem monoklonalen Anti-B220-Antikörper auf Gefrierschnitten des Herzens durch. Eine quantitative Auswertung der Gewebeinfiltration ergab, dass die Anzahl der B-Zellen an Tag sieben ihren Höhepunkt erreicht. In durchflusszytometrischen Untersuchungen charakterisierten wir [anschließend] die das infarzierte Gewebe infiltrierenden B-Zellen (weiter). Wir stellten dabei fest, dass es sich bei den meisten dieser Zellen um reife B-Zellen (IgM+, IgD+) handelte. Als nächsten Schritt wollten wir einen möglichen Mechanismus, der die B-Zell-Infiltration am Ort der Gewebeschädigung erklärt, umreißen. Wir führten daher ELISA-Messungen durch, die ergaben, dass CXCL13 im Narbengewebe hochreguliert war. Eine Antikörper-vermittelte Neutralisation von CXCL13 konnte nachweisbar die B-Zell-Infiltration hemmen. So behandelte Mäuse zeigten – in der Tendenz – kleinere Infarktgrößen und ein verbessertes Überleben. Zusammenfassend konnten wir somit zeigen, dass B-Lymphozyten nach Myokardinfarkt in der Maus das Myokard aufgrund eines lokalen CXCL13-Gradienten infiltrieren und dass es höchstwahrscheinlich vorteilhaft ist, diesen Prozess zu unterbinden.

Human Vγ9Vδ2 T cells are the main γδ T cell subset in the circulation, accounting for up to 5% of the total peripheral blood lymphocyte population. They have been suggested to be important in response to tumors and infections. Their immune mechanisms encompass cell killing via cytotoxicity and secretion of pro-inflammatory cytokines such as IFNγ and tumor necrosis factor (TNF). The main stimulators of Vγ9Vδ2 T cells are isopentenyl pyrophosphate (IPP) and (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), denominated phosphoantigens (PAg). A major advance in the understanding of PAg detection and Vγ9Vδ2 T cell activation has been the identification of the butyrophlin 3A (BTN3A) proteins as key mediators in these processes. In humans, three isoforms constitute the BTN3A family: BTN3A1, BTN3A2, and BTN3A3; and their genes are localized on the short arm of chromosome 6. The role of BTN3A1 has been highlighted by BTN3A-specific monoclonal antibody 20.1 (mAb 20.1), which has an agonist effect and causes proliferation, expansion, and activation of primary human Vγ9Vδ2 T cells. On the other hand, BTN3A-specific monoclonal antibody 103.2 (mAb 103.2) is antagonistic, inhibiting the Vγ9Vδ2 T cell response. The actual mechanism underlying both PAg- and mAb 20.1-mediated activation is not completely elucidated, but the importance of BTN3A1 is clear. The main objective of this dissertation was to characterize the role of BTN3A1 in the PAg-dependent and PAg-independent Vγ9Vδ2 T cell activation and to evaluate its contribution in the response to influeza A virus infected cells. This research work demonstrated, by using Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine cells (reporter cells), that human chromosome 6 (Chr6) is mandatory for PAg-induced stimulation, but not for stimulation with mAb 20.1. The reporter cells responded to mAb 20.1 in cultures with BTN3A1-transduced Chinese hamster ovary cells (CHO BTN3A1) as antigen presenting cells. Nevertheless, for PAg-dependent activation the presence of Chr6 in CHO BTN3A1 was mandatory. Although reporter cells expressing clonotypically different Vγ9Vδ2 TCRs showed similar PAg response, they clearly differed in the mAb 20.1 response. The reporter cell line transduced with Vγ9Vδ2 TCR D1C55 demonstrated essentially no response to mAb 20.1 compared to Vγ9Vδ2 TCR MOP cells. These findings were further supported by experiments performed with human PBMCs-derived Vγ9Vδ2 T cell clones. The results indicate heterogeneity in the PAg- and 20.1-dependent responses, in terms of CD25 and CD69 expression, among three different Vγ9Vδ2 T cells clones. Co-cultures of reporter cells with Raji RT1BI and PAg plus mAb 20.1 or single chain antibody 20.1 (sc 20.1) revealed no additive or synergistic activating effects. In contrast, mAb 20.1 or sc 20.1 inhibited the PAg-mediated activation of the reporter cells. The comparison of the relative contribution of the isoforms BTN3A2 and BTN3A3, in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, was undertaken by overexpression of these isoforms in CHO cells. The results showed that BTN3A2 contributes to both PAg- and mAb-induced Vγ9Vδ2 T cell activation. On the contrary, BTN3A3 does not support PAg-mediated γδ T cell response. Additionally, mutations in the proposed PAg- and mAb 20.1-binding sites of the extracellular BTN3A1 domain were generated by means of site-directed mutagenesis. These mutations revoked the mAb 20.1-induced Vγ9Vδ2 T cell activation, but not that induced by PAg. Finally, co-cultures of Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine reporter cells with influenza A/PR/8/34-infected cells, or infection of PBMCs with this virus strain indicated that BTN3A1 might be dispensable for the Vγ9Vδ2 T cell response against influenza A. The data of this research work points out that: i) in addition to BTN3A1, other Chr6-encoded genes are necessary for Vγ9Vδ2 T cell activation with PAg; ii) clonotypical (CDR3) differences influence the PAg- and mAb 20.1-mediated Vγ9Vδ2 T cell activation; iii) the PAg- and mAb 20.1-induced responses are not synergistic and interfere with each other; iv) BTN3A2 and BTN3A3 isoforms differ in the ability to support PAg- or mAb 20.1-dependent Vγ9Vδ2 T cell activation; v) the importance of the intracellular B30.2 domain of BTN3A1, in the Vγ9Vδ2 T cell activation, might be higher than that of the extracellular domain; and vi) in spite of the importance of BTN3A1 in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, it is possible that many molecules with redundant functions are involved in the elimination of influenza virus infection by these cells. In summary, it is possible to hypothesize a model in which BTN3A1 detects prenyl pyrophosphates in the cytoplasm via its B30.2 domain and in association with another protein(s). The binding of PAg to this domain induces a multimerization of BTN3A1 or a conformational change of its extracellular domain (mimicked by mAb 20.1). These modifications might be recognized by the Vγ9Vδ2 TCR or by an associated T cell protein. In the case that the TCR directly recognizes BTN3A1, the intensity of the response will depend on the Vγ9Vδ2 TCR clonotype. Future research will allow to gain a better understanding of BTN3A1, its interaction with other proteins, its actual role in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, and its importance in specific models of cancer or infection. This knowledge will be necessary to transform these cells into effective tools in the clinic. / Im Menschen stellen Vγ9Vδ2 T Zellen die größte Subpopulation an γδ T Zellen im Blut dar und machen bis zu 5% der Gesamtpopulation peripherer Blutlymphozyten aus. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung von Tumoren und Infektionen. Ihre Immunantwort umfasst cytotoxische Aktivität sowie Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie IFNγ und dem Tumor Necrosis Faktor (TNF). Vγ9Vδ2 T Zellen werden am stärksten durch Isopentenylpyrophosphat (IPP) und (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphat (HMBPP) stimuliert, welche als Phosphoantigene (PAg) bezeichnet werden. Ein großer Schritt für das Verständnis der Phosphoantigenerkennung und Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung war die Identifzierung der Schlüsselrolle, die Butyrophilin 3A (BTN3A) Proteinen in diesen Prozessen zukommt. Im Menschen existieren drei Isoformen von BTN3A (BTN3A1, BTN3A2 und BTN3A3), deren Gene auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 lokalisiert sind. Die Rolle von BTN3A1 wurde durch den BTN3A spezifischen monoklonalen Antikörper 20.1 (mAk 20.1) besonders hervorgehoben, der eine agonistische Wirkung besitzt und Proliferation, Expansion, sowie Aktivierung primärer humaner Vγ9Vδ2 T Zellen hervorruft. Zudem existiert ein antagonistischer BTN3A spezifischer monoklonale Antikörper 103.2 (mAk 103.2), welcher Vγ9Vδ2 T Zellantworten inhibiert. Die der PAg- und mAk 20.1 vermittelten Aktivierung zugrunde liegenden Mechanismen wurden noch nicht vollständig aufgeklärt, die bedeutende Rolle von BTN3A1 in diesem Prozess ist jedoch eindeutig. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle von BTN3A1 in der PAg abhängigen sowie unabhängigen Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung zu charakterisieren und ihren Beitrag zu der Immunantwort gegen mit Influenza A Virus infizierte Zellen zu ermitteln. Durch die Nutzung Vγ9Vδ2 TCR MOP transduzierter muriner Zellen als Reporterzellen konnte gezeigt werden, dass das humane Chromosom 6 (Chr6) zwar für die PAg abhängige Stimulation, nicht jedoch für die Aktivierung durch mAk 20.1 zwingend notwendig ist. In Kultur mit BTN3A1 transduzierten “chinese hamster ovary” (CHO) Zellen antworteten die Reporterzellen auf mAk 20.1. Für eine PAg abhängige Aktivierung war jedoch zusätzlich die Anwesenheit des humanen Chr6 in CHO BTN3A1 Zellen Voraussetzung. Obwohl Reporterzellen, die Vγ9Vδ2 TCRs verschiedener Klonotypen exprimierten, ähnliche PAg Antworten zeigten, unterschieden sie sich in der mAk 20.1 Antwort klar. Die mit Vγ9Vδ2 TCR D1C55 transduzierten Reporterzellen zeigten im Vergleich zu Vγ9Vδ2 TCR MOP Zellen nahezu keine mAk 20.1 abhängige Antwort. Diese Befunde wurden auch durch Experimente gestützt, die mit humanen, aus PBMCs gewonnenen Vγ9Vδ2 T Zellklonen durchgeführt wurden. Deren Resultate weisen, bezüglich der CD25 und CD69 Expression, auf eine heterogene PAg- und 20.1 abhängige Antwort der drei unterschiedlichen Vγ9Vδ2 T Zellklone hin. Kokulturen von Reporterzellen mit Raji RT1BI und PAg plus mAk 20.1 oder dem Einzelkettenantikörper 20.1 (sc 20.1) zeigten keine additive oder synergistische aktivierende Wirkung, vielmehr wurde die PAg vermittelte Aktivierung der Reporterzellen durch mAk 20.1 oder sc 20.1 inhibiert. Mittels Überexpression der beiden Isoformen BTN3A2 und BTN3A3 in CHO Zellen, wurde deren jeweiliger Beitrag zur Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass BTN3A2 sowohl zu PAg als auch mAk induzierten Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung beiträgt. BTN3A3 hingegen unterstützt die PAg vermittelte γδ T Zellaktivierung nicht. Weiterhin wurden, mittels gerichteter Mutagenese, in den vorgeschlagenen PAg- und mAk 20.1 Bindungsstellen der extrazellulären BTN3A1 Domäne Mutationen generiert. Diese verhinderten die mAk 20.1-, jedoch nicht die PAg vermittelte Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung. Zuletzt zeigten Kokulturen von Vγ9Vδ2 TCR MOP transduzierten murinen Reporterzellen und Influenza A/PR/8/34 infizierten Zellen, sowie eine Infektion von PBMCs mit diesem Virusstamm, dass BTN3A1 für die Vγ9Vδ2 T Zellantwort gegen Influenza A entbehrlich sein könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass i) zusätzlich zu BTN3A1, andere auf Chr6 befindliche Gene für die PAg abhängige Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen nötig sind; ii) klonotypische (CDR3) Unterschiede die PAg und mAk 20.1 vermittelte Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung beeinflussen; iii) die PAg- and mAk 20.1 induzierten Antworten sich nicht verstärken, sondern beeinträchtigen; iv) sich die Isoformen BTN3A2 und BTN3A3 in der Fähigkeit, die PAg- oder mAk 20.1 abhängige Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung zu unterstützen, unterscheiden; v) die intrazelluläre B30.2 Domäne von BTN3A1 eine größere Bedeutung für die Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung haben könnte als die extrazelluläre; und dass vi) trotz der Bedeutung von BTN3A1 für die Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen, die Möglichkeit besteht, dass viele Moleküle mit redundanter Funktion bei der Eliminierung von Influenza Viren durch diese Zellen eine Rolle spielen. Zusammenfassend lässt sich als Hypothese ein mögliches Modell aufstellen, in dem BTN3A1 in Assoziation mit einem oder mehreren zusätzlichen Proteinen zytoplasmatische Prenylpyrophosphate mittels der B30.2 Domäne detektiert. Die Bindung der PAg an diese Domäne würde dann eine Multimerisierung von BTN3A1 oder eine Konformationsänderung der extrazellulären Domäne (wie auch durch mAk 20.1 herbeigeführt) induzieren. Diese Modifizierungen könnten vom Vγ9Vδ2 TCR oder von einem assoziierten T Zellprotein erkannt werden. Für den Fall einer direkten Erkennung von BTN3A1 durch den TCR würde der Grad der T Zellantwort vom Vγ9Vδ2 TCR Klonotyp abhängen. Zukünftige Forschung wird ein besseres Verständnis von BTN3A1, dessen Proteininteraktionen, dessen Rolle in der Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung, und dessen Bedeutung in spezifischen Krebs- oder Infektionsmodellen ermöglichen. Wissen, das benötigt wird, um diese Zellen effizient in klinischen Therapien einzusetzen.

Zugl.: Berlin, Humboldt-University, Diss., 2009.

Würzburg, Univ., Diss., 2009

Göttingen, Universität, Habilitation, 1998.

Erlangen, Nürnberg, Universiẗat, Diss., 2006. / Enth. 1 Sonderabdr. aus: International journal of cancer ; 111. 2004. - Beitr. teilw. dt., teilw. engl.

Würzburg, Universiẗat, Diss., 2006.

Ulm, Univ., Diss., 2007.

Zugl.: Leipzig, Universiẗat, Diss., 2008. / Text teilw. dt., teilw. engl. - Enth. 2 Sonderabdr. aus : Clinical and Experimental Allergy ; 36. 2006 und: 38. 2007.