Depuis plus de 80 ans, le métabolisme spécialisé nous fournit de nombreuses molécules utilisées en médecine, en particulier comme anti-infectieux. Aujourd’hui, avec l’augmentation mondiale de la résistance aux antimicrobiens, de nouveaux antibiotiques sont indispensables. Une des réponses à cette pénurie grave pourrait provenir de la biologie synthétique. Dans le domaine du métabolisme spécialisé, la biologie synthétique est utilisée en particulier pour la biosynthèse de métabolites non naturels. Parmi les métabolites spécialisés, les peptides non ribosomiques constituent une cible attrayante, car ils nous ont déjà fourni des molécules à haute valeur clinique (ex. les antibiotiques vancomycine et daptomycine). De plus, la plupart sont synthétisés par des enzymes multimodulaires appelées synthétases de peptides non ribosomiques (NRPS), et sont diversifiés davantage par des enzymes de décoration. Ainsi, ces voies de biosynthèse se prêtent particulièrement à la biosynthèse combinatoire, consistant à combiner des gènes de biosynthèse provenant de divers groupes de gènes ou, dans le cas des NRPS, à combiner des modules ou domaines pour créer de nouvelles enzymes. Cependant, si plusieurs études ont établi la faisabilité de telles approches, de nombreux obstacles subsistent avant que les approches combinatoires de biosynthèse soient totalement efficaces pour la synthèse de nouveaux métabolites. Les travaux présentés ici s’inscrivent dans le cadre d’un projet visant à comprendre les facteurs limitant les approches de biosynthèse combinatoire basées sur les NRPS, en utilisant une approche de biologie synthétique. Nous avons choisi de travailler avec les NRPS responsables de la biosynthèse des pyrrolamides. En effet, ces NRPS sont constitués uniquement de modules et de domaines autonomes, et donc particulièrement adaptés aux manipulations génétiques et biochimiques. La caractérisation du groupe de gènes de biosynthèse du pyrrolamide anthelvencine constitue la première partie de cette thèse et nous a fourni de nouveaux gènes pour notre étude. La deuxième partie a consisté à construire de vecteurs intégratifs modulaires, outils essentiels pour la construction et l’assemblage de cassettes génétiques. La dernière partie présente la reconstruction du groupe de gènes du pyrrolamide congocidine, basée sur la construction et l’assemblage de cassettes de gènes synthétiques. Dans l’ensemble, ces travaux ouvrent la voie à de futures expériences de biosynthèse combinatoire, expériences qui devraient contribuer à une meilleure compréhension du fonctionnement précis des NRPS. / For more than 80 years, specialized metabolism has provided us with many molecules used in medicine, especially as anti-infectives. Yet today, with the rise of antimicrobial resistance worldwide, new antibiotics are crucially needed. One of the answers to this serious shortage could arise from synthetic biology. In the field of specialized metabolism, synthetic biology is used in particular to biosynthesize unnatural metabolites. Among specialized metabolites, non-ribosomal peptides constitute an attractive target as they have already provided us with clinically valuable molecules (e.g. the vancomycin and daptomycin antibiotics). In addition, most are synthesized by multimodular enzymes called non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) and further diversified by tailoring enzymes. Thus, such biosynthetic pathways are particularly amenable to combinatorial biosynthesis, which consists in combining biosynthetic genes coming from various gene clusters or, in the case of NRPSs, combining modules or domains to create a new enzyme. Yet, if several studies have established the feasibility of such approaches, many obstacles remain before combinatorial biosynthesis approaches are fully effective for the synthesis of new metabolites. The work presented here is part of a project aiming at understanding the limiting factors impeding NRPS-based combinatorial biosynthesis approaches, using a synthetic biology approach. We chose to work with the NRPSs involved in the biosynthesis of pyrrolamides. Indeed, these NRPS are solely constituted of stand-alone modules and domains, and thus, particularly amenable to genetic and biochemical manipulations. The characterization of the biosynthetic gene cluster of the pyrrolamide anthelvencin constitutes the first part of this thesis, and provided us with new genes for our study. The second part involved the construction of modular integrative vectors, essential tools for the construction and assembly of gene cassettes. The final part presents the successful refactoring of the congocidine pyrrolamide gene cluster, based on the construction and assembly of synthetic gene cassettes. Altogether, this work paves the way for future combinatorial biosynthesis experiments that should help deciphering the detailed functioning of NRPSs.

Le nombre des génomes bactériens séquencés disponibles dans les bases des données ne cesse d’augmenter. Grâce au développement d’outils bio informatiques, l’exploration de ces données génomiques est devenue beaucoup plus aisée. Ces analyses génomiques révèlent qu’un important réservoir de gènes du métabolisme spécialisé, et potentiellement de métabolites bioactifs, reste encore à explorer. J’ai étudié le métabolisme spécialisé d’une souche de Streptomyces appelée Streptomyces sp.TN58, isolée à partir d’un échantillon de sol tunisien et retenue pour son spectre d’activité biologique assez large. Son génome a été séquencé dans le cadre de ce travail. Je me suis particulièrement intéressée à la biosynthèse de deux familles de métabolites spécialisés, les acyl alpha-L-rhamnopyranosides et les dicétopipérazines.Les acyl alpha-L-rhamnopyranosides sont des composés qui possèdent un groupement rhamnose lié à un groupement acyle. Ils présentent plusieurs activités d’intérêt médical (antitumorale, antifongique, antibactérienne…). Leur biosynthèse par des Streptomyces a déjà été décrite, mais aucune étude de leur voie de biosynthèse n’est disponible dans la littérature. La souche Streptomyces sp.TN58 était connue pour produire deux molécules de cette famille. J’ai montré qu’elle en produisait une troisième et j’ai recherché quels gènes dirigeaient leur biosynthèse. J’ai pu identifier les gènes impliqués dans la biosynthèse du précurseur rhamnose et montrer qu’ils sont impliqués dans la biosynthèse des acyl alpha-L-rhamnopyranosides. Les gènes localisés au voisinage de ceux qui dirigent la biosynthèse du rhamnose ne sont pas impliqués dans la biosynthèse des acyl alpha-L-rhamnopyranoides. Cette organisation est originale, car tous les gènes impliqués dans la biosynthèse d’un métabolite spécialisé ne sont pas groupés, contrairement à ce qui est classiquement trouvé chez les Streptomyces et plus généralement chez les microorganismes. L’analyse du génome de Streptomyces sp. TN58 a permis l’identification d’autres gènes candidats, mais l’inactivation de certains de ces gènes n’abolit pas la biosynthèse des trois molécules d’acyl alpha-L-rhamnopyranoside. Ceci peut suggérer plusieurs enzymes promiscuitaires pourraient être impliquées dans la biosynthèse des acyl alpha-L-rhamnopyranosides.Les dicétopipérazines sont des dérivés de dipeptides cycliques et constituent une classe de produits naturels possédant des activités biologiques diverses, mais leur rôle physiologique chez l’organisme producteur reste peu connu. Elles peuvent être synthétisées par des mégacomplexes enzymatiques, les synthétases de peptides non ribosomiques (NRPS), ou par des cyclodipeptides synthases (CDPS). Ces dernières sont des enzymes de petite taille utilisant des ARN de transfert amino-acylés comme substrat. Les cyclodipeptides synthétisés peuvent subir différentes modifications, ce qui explique la diversité de leur structure chimique. L’analyse du génome de Streptomyces sp.TN58 a permis d’identifier un cluster de deux gènes (codant une CDPS et un cytochrome P450) homologues à des gènes impliqués dans la biosynthèse d’une dicétopipérazine (la mycocyclosine) chez Mycobacterium tuberculosis. J’ai identifié les produits dont la biosynthèse est dirigée par ces gènes. J’ai construit des souches mutées pour tester l’hypothèse d’un rôle de ces produits dans la signalisation pour la différenciation morphologique et la production d’antibiotiques chez Streptomyces sp.TN58. Les premiers résultats obtenus semblent en accord avec cette hypothèse. / The number of sequenced bacterial genomes available in databases is steadily increasing. With the development of bioinformatics tools, the exploration of these genomic data has become much easier. These genomic analyzes reveal that an important reservoir of genes for specialized metabolism, and potentially bioactive metabolites, remains to be explored. The vast majority of bacterial specialized metabolism was therefore ignored. I studied the specialized metabolism of a Streptomyces strain called Streptomyces sp.TN58, isolated from a Tunisian soil sample and retained for its broad spectrum of biological activity. Its genome has been sequenced in the frame of this work. I was particularly interested in the biosynthesis of two families of specialized metabolites, acyl alpha-L-rhamnopyranosides and diketopiperazines (DKPs).Acyl alpha-L-rhamnopyranosides are compounds having a rhamnose group linked to an acyl group. They possess a variety of biological activities of medical interest (anti-tumor, antifungal, antibacterial…). Their production by Streptomyces sp. has been described previously but no study of their biosynthetic pathway is available in literature. Streptomyces sp.TN58 strain was known to produce two molecules of this family. I showed that it produced a third one and I looked for the genes directing their biosynthesis. I have identified the genes involved in the biosynthesis of the rhamnose precursor and shown that their inactivation abolished the biosynthesis of acyl alpha-L-rhamnopyranosides. However, the genes located in the vicinity of the rhamnose biosynthetic genes are not involved in acyl alpha-L-rhamnopyranoside biosynthesis. This organization is unusual because all the genes directing the biosynthesis of a specialized metabolite are not clustered, contrarily to what is usually found in Streptomyces and more generally in microorganisms. A genome-mining approach allowed the identification of candidate genes, but the inactivation of some of these genes did not abolish the biosynthesis of the three acyl alpha-L-rhamnopyranoside molecules. This suggests that several rather promiscuous enzymes might be involved in the biosynthesis of acyl alpha-L-rhamnopyranosides.DKPs are cyclic dipeptide derivatives. This class of natural products possesses a wide variety of biological activities, but their physiological role in the producing organism remains often unknown. DKPs can be synthesized by non-ribosomal peptide synthases (NRPSs) or by cyclodipetide synthases (CDPSs). Contrarily to NRPSs which are enzymatic megacomplexes using amino acids as substrate, CDPSs are small enzymes using amino-acylated tRNAs as a substrate. The synthesized cyclodipeptides can undergo various modifications, which explains the diversity of DKP chemical structures. Mining the genome of Streptomyces sp. TN58 allowed the identification of a cluster of two genes (encoding a CDPS and a cytochrome P450) homologous to genes involved in the biosynthesis of a DKP (mycocyclosin) in Mycobacterium tuberculosis. I managed to identify the DKP synthesized. I constructed mutant strains to test the hypothesis that these DKPs could play a role as signaling molecules for morphological differentiation and antibiotic production in Streptomyces sp.TN58. Preliminary results seem to support this hypothesis

Le sclaréol est un diterpène produit par les organes floraux de la sauge sclarée (Salvia sclarea, Lamiaceae). Il est utilisé en parfumerie pour l’hémisynthèse de l’ambroxide, une substance caractérisée par une odeur ambrée et une grande capacité de fixation des parfums. L’augmentation de la demande mondiale en sclaréol stimule actuellement les tentatives d’accroître le rendement de la production de sclaréol à partir de la sauge sclarée. L’objectif du travail présenté dans ce manuscrit était d’améliorer notre compréhension de la biosynthèse du sclaréol et de sa régulation chez la sauge sclarée, afin de mettre en évidence des stratégies d’augmentation du contenu en sclaréol de la sauge sclarée. L'analyse de la surface des calices de sauge sclarée par imagerie par spectrométrie de masse suggère que le sclaréol est principalement sécrété par des structures épidermiques spécialisées appelées trichomes glandulaires. De plus, nous avons mis en évidence les contributions respectives des deux voies de biosynthèse des terpènes présentes chez les plantes, les voies MVA et MEP, à la biosynthèse de trois terpènes de la sauge sclarée. Des expériences de marquage au ¹³C indiquent que le sclaréol et l’acétate de linalyle sont tous deux issus de la voie MEP, alors que le β-caryophyllène semble être d’origine mixte. Nous avons également étudié le rôle potentiel d’une phytohormone, le méthyljasmonate, dans la régulation de la production de sclaréol chez la sauge sclarée. Enfin, nous avons exploré la diversité génétique et phénotypique de populations croates de sauge sclarée sauvage, et montrons que ces populations représentent une ressource génétique distincte par rapport aux populations de référence. L’ensemble de ces résultats met en évidence des pistes prometteuses pour l'amélioration génétique ciblée des performances de la sauge sclarée. / Sclareol is a diterpene produced by floral organs of clary sage (Salvia sclarea, Lamiaceae). It is used in perfume industry for the hemisynthesis of ambroxide, a high-valued perfume component characterized by an amber scent and a high perfume fixation capacity. The global demand for sclareol currently rises, prompting attempts at increasing the yield of sclareol production from clary sage. The purpose of the work presented in this manuscript was to improve knowledge on sclareol biosynthesis and its regulation in clary sage, in order to highlight strategies aiming at enhancing clary sage sclareol content. The analysis of the surface of clary sage calyces by mass spectrometry imaging suggests that sclareol is mainly secreted by specialized epidermal structures called glandular trichomes. Moreover, we have highlighted the respective contributions of the two terpenoid biosynthesis pathways present in plants, MVA and MEP pathways, to the biosynthesis of three terpenoids of clary sage. ¹³C-labeling experiments indicate that sclareol and linalyl acetate both originate from the MEP pathway, whereas β-caryophyllene seems to be of mixed origin. We have also investigated the potential role of a phytohormone, methyljasmonate, in the regulation of sclareol production in clary sage. Finally, we have explored the genetic and phenotypic diversity of Croatian wild clary sage populations and show that these populations represent a distinct genetic resource compared to reference populations. Taken together, these results highlight promising avenues for targeted genetic enhancement of clary sage performances.