Este estudo foi realizado com o objetivo de desenvolvimento e validação do método microbiológico rápido empregando a técnica de bioluminescência de Adenosina Trifosfato (ATP) como método alternativo para o teste de esterilidade. O ATP reage com o sistema enzimático luciferina/luciferase e gera um fóton de luz em presença de íons magnésio, reação que pode ser utilizada na detecção de microrganismos. A luz gerada na reação é medida por um dispositivo chamado luminômetro, que traduz o sinal em unidades relativas de luz (URL), metodologia altamente sensível que pode ser utilizada na análise de produtos estéreis com o objetivo de diminuição no tempo do ensaio. Enquanto a turbidez do meio de cultura só pode ser visualizada quando o contaminante chega à concentração de 106 UFC/ml, a tecnologia de bioluminescência de ATP pode detectar amostras com concentração em torno de 104 UFC. Foram empregados na validação dados obtidos a partir do método tradicional de esterilidade (técnica de filtração) realizado paralelamente ao método alternativo. As soluções parenterais utilizadas nos ensaios foram: solução fisiológica 0,9%; solução de dextrose 5%; ringer lactato; e solução de metronidazol 0,5%. As soluções-teste foram inoculadas intencionalmente com suspensões microbianas preparadas através da diluição de Bioballs&#174, com concentrações de 10 UFC/100 ml, 2 UFC/100 ml e 0,4 UFC/100 ml. Após a realização do teste convencional, as membranas resultantes do ensaio foram incubadas nos meios de cultura caldo caseína de soja e tioglicolato. Alíquotas destes meios foram retiradas após 96 horas de incubação para análise pelo método alternativo. Os seguintes microrganismos foram selecionados para o estudo: Staphylococcus aureus, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Clostridium sporogenes, Aspergillus brasiliensis, Kocuria rosea e Micrococcus luteus. A análise dos resultados obtidos mostrou que o método alternativo é capaz de detectar os microrganismos testados. Quanto à sensibilidade, o método alternativo apresentou vantagem na concentração 2 UFC/100 ml, e equivalência nas outras concentrações. A não interferência dos diferentes produtos e meios nos resultados encontrados permite vislumbrar evidência de robustez do método. Adicionalmente, em relação ao tempo de resposta, o método alternativo demonstrou ser equivalente ao convencional (p-valor=0,43). / This study is being conducted with a goal of validating and developing the fast microbiological method of ATP bioluminescence, as an alternative method to the sterility test. The ATP reacts with the enzymatic system luciferin-luciferase and produces light in the presence of magnesium ions, this reaction can be used for microorganism\'s detection. The light generated in this reaction can be measured by a device called luminometer that translates the signal in relative light units (RLU). This methodology has high sensibility and it can be used in the sterile products analysis with the objective of reducing the time of the sample. While the turbidity of the culture medium it can be visualized just when the sample reaches a concentration of 106 UCF per mL, the bioluminescence assay can detect samples at concentrations around 104 UCF per mL. The both methods, conventional (filtration technique) and alternative were done in parallel and the result data were used in the validation study. It was used in the assay the next parenteral solutions: physiological solution 0,9%, metronidazole solution 0,5%, dextrose solution 5% and Ringer lactate. The test solutions were inoculated with the microorganism suspensions, prepared by the dilution of the Bioballs® with result concentrations of 10 CFU/100 mL, 2 FU/100 mL and 0,4 CFU/ mL. After the conventional test was performed, the result membranes were incubated in thioglicollate and soybean casein broth. After 96 hours of incubation, aliquots from the broth were taken to perform the analysis by the alternative method. The following microorganisms were selected to perform the validation study: Staphylococcus aureus, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Aspergillus brasiliensis, Kocuria rosea and Micrococcus luteus. The analysis of results shows that the alternative method can detect the test microorganisms. Regarding of the sensibility, the alternative method shows advantage in the 2 CFU/mL inoculum concentration and equivalence in the other two concentrations. The method shows evidence of robustness because the results were not affected by the products or culture media used in the assay. Additionally concerning the detection time, the alternative method was established equivalent to the conventional method (p-value=0,43).

De acordo com compêndios farmacêuticos, o teste de esterilidade, requer período de incubação de 14 dias para obtenção de resultado analítico, período em que produto farmacêutico é mantido em quarentena, o que demanda custos elevados. Os métodos alternativos com aplicação na avaliação da esterilidade são particularmente interessantes, quando possibilitam a redução do período de incubação do teste, o período de quarentena e, em consequência, os custos envolvidos, além de reduzir o tempo para preparação do material requerido, para execução do ensaio e para a capacitação técnica. O presente estudo avaliou o desempenho do método microbiológico rápido BacT/Alert 3D (Biomerieux®) aplicado ao teste de esterilidade em comparação ao teste de esterilidade por método indireto descrito nas farmacopeias (brasileira, americana, européia e japonesa). O Bact/Alert 3D se baseia na detecção do crescimento microbiano, que é feita por meio de detecção de alteração da cor de um sensor sensível à liberação de dióxido de carbono produzido por metabolismo microbiano. Os testes utilizaram três diferentes soluções parenterais de grande volume: solução salina 0,9%, concentrado polieletrolítico para diálise e solução de metronidazol. Micro-organismos desafio: Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Clostridium sporogenes ATCC 19404, Candida albicans ATCC 10231 e Aspergillus brasiliensis ATCC 16404. Cargas de contaminação: 20, 2 e 0,2 UFC/membrana. Temperatura de incubação: 32,5 ± 0,5 °C. As amostras foram avaliadas por 14 dias. Amostras dos três produtos foram artificialmente contaminadas com BioBalls® SingleShot dos micro-organismos desafio de diferentes cargas de contaminação foram submetidas ao teste de esterilidade farmacopeico, com inoculação por método indireto. Após 18h de incubação, foram retiradas alíquotas de cada um dos meios de cultura, que foram inoculadas nos frascos de meio de cultura do BacT/Alert 3D. Bact/Alert 3D demonstrou equivalência ao método farmacopeico (p > 0,05) e tempo de detecção inferior. / Nowadays, the harmonized sterility test method described on pharmacopoeias requires an incubation period of 14 days. During this period the product stays on quarantine waiting the result for release, which demands warehousing and inventory costs. The application of Rapid microbiologial methods for sterility testing is particulary interesting considering the benefits of incubation time reduction, quarantine period reduction, time reduction for material preparation, reduction of time for test execution and technical training.This work evaluated comparetivelly the performance of Bact/Alert 3D system as a rapid microbiologial method applied to sterility testing and sterility testing according to described on Brazilian pharmacopeia and harmonized pharmacopeias (American pharmacopeia, European pharmacopeia and Japanese pharmacopeia). The Bact/Alert 3D is based on microrganisms gowth and has as principle the detection of pad color change which is sensible to carbon dioxide release by microorganism metabolism. To perform the evaluation it was considered Buffer saline solution, Metronidazol solution and Polieletrolitic dialysis concentrate solution. Challenge Microrganisms: Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Bacilus subtilis (ATCC 6633), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739 ), Clostridium sporogenes (ATCC 19404), Candida albicans (ATCC 10231) and Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404). Inoculum load: 20CFU/sample; 2 CFU/sample; 0,2CFU/sample. Incubation temperature: 32,5 ± 0,5 °C. The samples were evaluated during 14 days. Aseptic samples of the three products were intentionally contaminated with BioBalls® SingleShot of challenge microorganisms, according to inoculum concentration desired, and were tested by indirect inoculation. After 18h aliquotes of were taken from inoculated culture media and inoculated into BacT/Alert 3D culture media bottles. Bact/Alert showed equivalence to compendial method (p > 0,05) and showed results faster than compendial method.

De acordo com compêndios farmacêuticos, o teste de esterilidade, requer período de incubação de 14 dias para obtenção de resultado analítico, período em que produto farmacêutico é mantido em quarentena, o que demanda custos elevados. Os métodos alternativos com aplicação na avaliação da esterilidade são particularmente interessantes, quando possibilitam a redução do período de incubação do teste, o período de quarentena e, em consequência, os custos envolvidos, além de reduzir o tempo para preparação do material requerido, para execução do ensaio e para a capacitação técnica. O presente estudo avaliou o desempenho do método microbiológico rápido BacT/Alert 3D (Biomerieux®) aplicado ao teste de esterilidade em comparação ao teste de esterilidade por método indireto descrito nas farmacopeias (brasileira, americana, européia e japonesa). O Bact/Alert 3D se baseia na detecção do crescimento microbiano, que é feita por meio de detecção de alteração da cor de um sensor sensível à liberação de dióxido de carbono produzido por metabolismo microbiano. Os testes utilizaram três diferentes soluções parenterais de grande volume: solução salina 0,9%, concentrado polieletrolítico para diálise e solução de metronidazol. Micro-organismos desafio: Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Clostridium sporogenes ATCC 19404, Candida albicans ATCC 10231 e Aspergillus brasiliensis ATCC 16404. Cargas de contaminação: 20, 2 e 0,2 UFC/membrana. Temperatura de incubação: 32,5 ± 0,5 °C. As amostras foram avaliadas por 14 dias. Amostras dos três produtos foram artificialmente contaminadas com BioBalls® SingleShot dos micro-organismos desafio de diferentes cargas de contaminação foram submetidas ao teste de esterilidade farmacopeico, com inoculação por método indireto. Após 18h de incubação, foram retiradas alíquotas de cada um dos meios de cultura, que foram inoculadas nos frascos de meio de cultura do BacT/Alert 3D. Bact/Alert 3D demonstrou equivalência ao método farmacopeico (p > 0,05) e tempo de detecção inferior. / Nowadays, the harmonized sterility test method described on pharmacopoeias requires an incubation period of 14 days. During this period the product stays on quarantine waiting the result for release, which demands warehousing and inventory costs. The application of Rapid microbiologial methods for sterility testing is particulary interesting considering the benefits of incubation time reduction, quarantine period reduction, time reduction for material preparation, reduction of time for test execution and technical training.This work evaluated comparetivelly the performance of Bact/Alert 3D system as a rapid microbiologial method applied to sterility testing and sterility testing according to described on Brazilian pharmacopeia and harmonized pharmacopeias (American pharmacopeia, European pharmacopeia and Japanese pharmacopeia). The Bact/Alert 3D is based on microrganisms gowth and has as principle the detection of pad color change which is sensible to carbon dioxide release by microorganism metabolism. To perform the evaluation it was considered Buffer saline solution, Metronidazol solution and Polieletrolitic dialysis concentrate solution. Challenge Microrganisms: Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Bacilus subtilis (ATCC 6633), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739 ), Clostridium sporogenes (ATCC 19404), Candida albicans (ATCC 10231) and Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404). Inoculum load: 20CFU/sample; 2 CFU/sample; 0,2CFU/sample. Incubation temperature: 32,5 ± 0,5 °C. The samples were evaluated during 14 days. Aseptic samples of the three products were intentionally contaminated with BioBalls® SingleShot of challenge microorganisms, according to inoculum concentration desired, and were tested by indirect inoculation. After 18h aliquotes of were taken from inoculated culture media and inoculated into BacT/Alert 3D culture media bottles. Bact/Alert showed equivalence to compendial method (p > 0,05) and showed results faster than compendial method.

Este estudo foi realizado com o objetivo de desenvolvimento e validação do método microbiológico rápido empregando a técnica de bioluminescência de Adenosina Trifosfato (ATP) como método alternativo para o teste de esterilidade. O ATP reage com o sistema enzimático luciferina/luciferase e gera um fóton de luz em presença de íons magnésio, reação que pode ser utilizada na detecção de microrganismos. A luz gerada na reação é medida por um dispositivo chamado luminômetro, que traduz o sinal em unidades relativas de luz (URL), metodologia altamente sensível que pode ser utilizada na análise de produtos estéreis com o objetivo de diminuição no tempo do ensaio. Enquanto a turbidez do meio de cultura só pode ser visualizada quando o contaminante chega à concentração de 106 UFC/ml, a tecnologia de bioluminescência de ATP pode detectar amostras com concentração em torno de 104 UFC. Foram empregados na validação dados obtidos a partir do método tradicional de esterilidade (técnica de filtração) realizado paralelamente ao método alternativo. As soluções parenterais utilizadas nos ensaios foram: solução fisiológica 0,9%; solução de dextrose 5%; ringer lactato; e solução de metronidazol 0,5%. As soluções-teste foram inoculadas intencionalmente com suspensões microbianas preparadas através da diluição de Bioballs&#174, com concentrações de 10 UFC/100 ml, 2 UFC/100 ml e 0,4 UFC/100 ml. Após a realização do teste convencional, as membranas resultantes do ensaio foram incubadas nos meios de cultura caldo caseína de soja e tioglicolato. Alíquotas destes meios foram retiradas após 96 horas de incubação para análise pelo método alternativo. Os seguintes microrganismos foram selecionados para o estudo: Staphylococcus aureus, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Clostridium sporogenes, Aspergillus brasiliensis, Kocuria rosea e Micrococcus luteus. A análise dos resultados obtidos mostrou que o método alternativo é capaz de detectar os microrganismos testados. Quanto à sensibilidade, o método alternativo apresentou vantagem na concentração 2 UFC/100 ml, e equivalência nas outras concentrações. A não interferência dos diferentes produtos e meios nos resultados encontrados permite vislumbrar evidência de robustez do método. Adicionalmente, em relação ao tempo de resposta, o método alternativo demonstrou ser equivalente ao convencional (p-valor=0,43). / This study is being conducted with a goal of validating and developing the fast microbiological method of ATP bioluminescence, as an alternative method to the sterility test. The ATP reacts with the enzymatic system luciferin-luciferase and produces light in the presence of magnesium ions, this reaction can be used for microorganism\'s detection. The light generated in this reaction can be measured by a device called luminometer that translates the signal in relative light units (RLU). This methodology has high sensibility and it can be used in the sterile products analysis with the objective of reducing the time of the sample. While the turbidity of the culture medium it can be visualized just when the sample reaches a concentration of 106 UCF per mL, the bioluminescence assay can detect samples at concentrations around 104 UCF per mL. The both methods, conventional (filtration technique) and alternative were done in parallel and the result data were used in the validation study. It was used in the assay the next parenteral solutions: physiological solution 0,9%, metronidazole solution 0,5%, dextrose solution 5% and Ringer lactate. The test solutions were inoculated with the microorganism suspensions, prepared by the dilution of the Bioballs® with result concentrations of 10 CFU/100 mL, 2 FU/100 mL and 0,4 CFU/ mL. After the conventional test was performed, the result membranes were incubated in thioglicollate and soybean casein broth. After 96 hours of incubation, aliquots from the broth were taken to perform the analysis by the alternative method. The following microorganisms were selected to perform the validation study: Staphylococcus aureus, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Aspergillus brasiliensis, Kocuria rosea and Micrococcus luteus. The analysis of results shows that the alternative method can detect the test microorganisms. Regarding of the sensibility, the alternative method shows advantage in the 2 CFU/mL inoculum concentration and equivalence in the other two concentrations. The method shows evidence of robustness because the results were not affected by the products or culture media used in the assay. Additionally concerning the detection time, the alternative method was established equivalent to the conventional method (p-value=0,43).