La méthylation de l’adénine en position 58 des ARNt (m1A58) est présente dans les trois domaines de vie et joue un rôle crucial chez plusieurs organismes. Sa formation est catalysée par la méthyltransférase SAM-dépendante TrmI. Alors que chez les eucaryotes et les bactéries, TrmI est site-spécifique pour l’adénine en position 58, chez l’archée Pyrococcus abyssi, TrmI est région-spécifique puisqu’elle catalyse également la méthylation de l’adénine en position 57. Nous nous sommes intéressés à cette enzyme, PabTrmI, pour comprendre cette différence de spécificité par rapport à ses homologues eucaryotes et bactériens.La structure cristallographique de l'enzyme, en complexe avec son cofacteur SAM ainsi qu’avec le produit de la réaction, la SAH, nous a conduit à construire différents mutants de la protéine et de son substrat ARNt. Nous avons ainsi montré que His78, située à l’entrée du site actif, est mobile et est importante pour l’efficacité catalytique de PabTrmI. L’analyse des positions de méthylation par spectrométrie de masse, simple et en tandem, montre qu’une partie de la région-spécificité de l’enzyme pour certains ARNt de P. abyssi, est liée à la présence de trois adénines consécutives, PabTrmI ne méthylant que la première adénine d’une séquence AA.En vue d’étudier les cinétiques rapides du mécanisme de retournement de la base de l’ARNt par l’enzyme région-spécifique PabTrmI et l’enzyme bactérienne site-spécifique TthTrmI de T. thermophilus, nous avons vérifié dans un premier temps, par spectrométrie de masse, qu’un mini-ARNt, constitué de la tige acceptrice et de la tige-boucle T, est substrat de TrmI. / The methylation of adenine 58 in the T-loop of tRNAs (m1A58) is a modification present in all three domains of life. An important biological role for m1A58 has been demonstrated in different organisms. Its formation is catalyzed by the SAM-dependent methyltransferase TrmI. In contrast to bacterial and eukaryotic tRNA m1A58 methyltransferases that are site-specific, the homologous archaeal enzyme from Pyrococcus abyssi is region-specific, since it catalyzes the formation of m1A also at the adjacent position 57. A structural and biochemical study of this enzyme, PabTrmI, was undertaken to shed light on the origin of the multisite recognition mechanism.First, we determined the crystal structure of PabTrmI in complex with its cofactor SAM and the reaction product SAH. These structures enabled us to construct both protein and tRNA mutants. We show that His78, which lies near the active site, is mobile and important for catalytic efficiency of PabTrmI. The analysis of the méthylation positions, by mass spectrometry, shows that at least part of the enzyme region-specificity for several P. abyssi tRNAs, is related to the presence of three consecutive adenines, with the enzyme modifying the first adenine of an AA sequence.To investigate the mechanism of tRNA base flipping by the region-specific enzyme PabTrmI and the site-specific bacterial enzyme TthTrmI of T. thermophilus, we checked, as a first step, by mass spectrometry, that a mini-tRNA, formed from the acceptor stem and the T-arm, was substrate of TrmI.

La méthylation de l'adénine en position 58 des ARNt (m1A58) est présente dans les trois domaines de vie et joue un rôle crucial chez plusieurs organismes. Sa formation est catalysée par la méthyltransférase SAM-dépendante TrmI. Alors que chez les eucaryotes et les bactéries, TrmI est site-spécifique pour l'adénine en position 58, chez l'archée Pyrococcus abyssi, TrmI est région-spécifique puisqu'elle catalyse également la méthylation de l'adénine en position 57. Nous nous sommes intéressés à cette enzyme, PabTrmI, pour comprendre cette différence de spécificité par rapport à ses homologues eucaryotes et bactériens.La structure cristallographique de l'enzyme, en complexe avec son cofacteur SAM ainsi qu'avec le produit de la réaction, la SAH, nous a conduit à construire différents mutants de la protéine et de son substrat ARNt. Nous avons ainsi montré que His78, située à l'entrée du site actif, est mobile et est importante pour l'efficacité catalytique de PabTrmI. L'analyse des positions de méthylation par spectrométrie de masse, simple et en tandem, montre qu'une partie de la région-spécificité de l'enzyme pour certains ARNt de P. abyssi, est liée à la présence de trois adénines consécutives, PabTrmI ne méthylant que la première adénine d'une séquence AA.En vue d'étudier les cinétiques rapides du mécanisme de retournement de la base de l'ARNt par l'enzyme région-spécifique PabTrmI et l'enzyme bactérienne site-spécifique TthTrmI de T. thermophilus, nous avons vérifié dans un premier temps, par spectrométrie de masse, qu'un mini-ARNt, constitué de la tige acceptrice et de la tige-boucle T, est substrat de TrmI.

Le travail retranscrit dans cette thèse regroupe l'étude de différents processus biologiques impliquant les ARN de transfert. Premièrement, dans le cadre de l'étude du rôle de la protéine de nucléocapside (NC) dans la formation du complexe d'initiation de la transcription inverse du VIH-1, un site de fixation fort et spécifique de la NC a été identifié sur le bras D de l'ARNtLys3 — l'ARNt servant d'amorce à la transcriptase inverse lors de la synthèse du brin d'ADNc(-). Cette fixation permet d'une part la fusion des interactions tertiaires entre les bras T et D de l'ARNtLys3 et pourrait d'autre part être l'un des facteurs déplaçant l'équilibre vers la formation de l'hybride ARNtLys3/ARN viral. L'étude structurale par RMN du complexe NC/bras D s'est heurtée à des problèmes d'échange chimique dans la gamme intermédiaire–rapide de l'échelle de temps spectrale. L'utilisation de séquences de type CPMG–HSQC a permis d'améliorer le rapport signal/bruit des expériences RMN, et particulièrement celui des signaux des résidus de l'interface. Ceci nous a permis d'identifier les résidus de la NC impliqués dans la reconnaissance du bras D. Deuxièmement, la structure de la m1A58 méthyltransférase de T. thermophilus (TrmI) — une enzyme de modification des ARNt — a été résolue par cristallographie et affinée à 1.7 Å. Ceci a permis d'identifier trois résidus potentiellement impliqués dans la catalyse et/ou la reconnaissance du substrat ARNt (D170, Y78 et Y194). La production de variants de TrmI au niveau de ces résidus ainsi que des études d'amarrage moléculaire d'une adénine au site actif ont permis de confirmer cette hypothèse et de proposer un rôle catalytique pour chacun d'eux. Parallèlement, des études par gel natif et par spectrométrie de masse en conditions non dénaturantes ont montré une stoechiométrie 1/2 pour le complexe entre l'enzyme TrmI tétramérique et le substrat ARNt. Troisièmement, la résolution de la structure cristallographique de l'ARNtfMet initiateur d'E. coli a révélé une conformation unique de la région de l'anticodon. Cette conformation unique est associée au paires GC de la tige anticodon, caractéristiques des ARNt initiateurs. Cette conformation particulière — dans laquelle la base A37 ne vient pas s'empiler entre les bases 36 et 38, comme dans tous les ARNt élongateurs — permet de mettre en lumière de nombreux résultats biochimiques de la littérature et suggère un mécanisme par lequel la machinerie de l'initiation de la traduction pourrait discriminer l'ARNt initiateur de tous les ARNt cellulaires.