Το σύστημα του συμπληρώματος περιλαμβάνει περισσότερες από 30 πρωτεΐνες του ορού και της κυτταρικής επιφάνειας και αποτελεί έναν από τους αρχαιότερους φυλογενετικά μηχανισμούς ανοσίας του ξενιστή. Η ενεργοποίησή του, μέσω της κλασικής, της εναλλακτικής ή της λεκτινικής οδού, οδηγεί σε έναν καταρράκτη αντιδράσεων. Οι αντιδράσεις αυτές συγκλίνουν στην τελική λυτική οδό, οδηγώντας στη δημιουργία του συμπλόκου MAC, με αποτέλεσμα την ωσμωτική λύση του κυττάρου στόχου. Στην παρούσα εργασία, σχετικά με τη μελέτη της μοριακής εξέλιξης των γονιδίων της τελικής λυτικής οδού του συμπληρώματος, κλωνοποίηθηκε η αλληλουχία του cDNA του έκτου συστατικού του συμπληρώματος (C6). Στη συνέχεια, προκειμένου να εξαχθούν συμπεράσματα σχετικά με τη συντήρηση όλων των δομικών γονιδίων του συμπλόκου MAC κατά τη διάρκεια της φυλογενετικής εξέλιξης, δημιουργήθηκε φυλογενετικό δέντρο, στο οποίο συγκρίνονται τα παραπάνω γονίδια με τα αντίστοιχα ορθόλογα, σε διάφορους οργανισμούς. Από τη φυλογενετική ανάλυση φαίνεται ότι το C6 της όρνιθας ομαδοποιείται με τα αντίστοιχα ορθόλογα των θηλαστικών και του βατράχου, δημιουργώντας μια καλά καθορισμένη υποομάδα μέσα στην οικογένεια των πρωτεϊνών MACPF. Σύμφωνα με την υπάρχουσα βιβλιογραφία, εκτός από το ρόλο που διαδραματίζει το σύστημα του συμπληρώματος στην ανοσία, έχει δειχθεί η εμπλοκή του, μεταξύ άλλων, σε διαδικασίες αναγέννησης ιστών, ενεργοποίησης και πολλαπλασιασμού κυττάρων και ρύθμισης της απόπτωσης. Προκειμένου λοιπόν να διερευνηθεί περαιτέρω η πιθανότητα εμπλοκής του συστήματος του συμπληρώματος σε διαδικασίες που σχετίζονται με την ανάπτυξη, μελετήθηκε το αναπτυξιακό και ιστικό πρότυπο έκφρασης συστατικών του στην όρνιθα. Η ιστική μελέτη περιελάμβανε τη διερεύνηση και ημι-ποσοτική ανάλυση της έκφρασης, σε επίπεδο mRNA, σε οκτώ ιστούς της ενήλικης όρνιθας: εγκέφαλο, καρδιά, έντερο, νεφρό, ήπαρ, πνεύμονα, σπλήνα και στόμαχο. Η αναπτυξιακή μελέτη, περιελάμβανε τη διερεύνηση και ημι-ποσοτική ανάλυση της έκφρασης, σε επίπεδο mRNA, σε ολικό ομογενοποιημένο έμβρυο 4 και 6 ημερών, σε ήπαρ εμβρύου 12 και 17 ημερών και σε ήπαρ νεογένητου ατόμου 2 και 5 ημερών. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η έκφρασή του γονιδίου C3 σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια, όπου και πιστοποιήθηκε η παρουσία του μορίου σε όλα τα στάδια. Επίσης, μελετήθηκε η ιστική και η αναπτυξιακή έκφραση των δομικών γονιδίων του συμπλόκου MAC (C6, C7, C8α, C8β, C8γ) και η αναπτυξιακή των ρυθμιστικών γονιδίων του (CD59, CLU,VTN). Η μελέτη του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης για τα δομικά συστατικά του συμπλόκου, έδειξε ότι τα διάφορα συστατικά παρουσιάζουν ποικίλη έκφραση στους υπό μελέτη ιστούς, ενώ κύρια πηγή έκφρασής τους αποτελεί το ήπαρ. Κατά τη μελέτη του αναπτυξιακού προτύπου έκφρασης, δείχθηκε ότι τα δομικά συστατικά του συμπλόκου πρωτοεμφανίζονται τη 12η εμβρυική μέρα ενώ δεν παρατηρείται έκφρασή τους σε νεογέννητο άτομο 2 ημερών. Αντίθετα, η μελέτη του αναπτυξιακού προτύπου έκφρασης των ρυθμιστικών μορίων του συμπλόκου, έδειξε έκφραση όλων των συστατικών σε όλα τα υπό μελέτη στάδια. Το γεγονός αυτό αντανακλά πιθανώς την πλειοτροπική δράση των ρυθμιστικών αυτών πρωτεϊνών, καθώς εμπλέκονται σε πρόσθετες λειτουργίες οι οποίες δε σχετίζονται με τη δράση του συμπληρώματος, όπως είναι η ανάπτυξη και ωρίμανση οργάνων. Ανάλογα συμπεράσματα θα μπορούσαν να εξαχθούν και στην περίπτωση του μορίου C3, λόγω της έκφρασής του σε πρώιμα στάδια ανάπτυξης της όρνιθας, παρά την απουσία έκφρασης των γονιδίων του συμπλόκου MAC στα αντίστοιχα αναπτυξιακά στάδια. Συμπερασματικά, η παραπάνω εργασία αποτελεί την πρώτη αναφορά στη χωρική και χρονική μελέτη της έκφρασης γονιδίων του συμπληρώματος στην όρνιθα. Βάσει των παραπάνω, περαιτέρω διερεύνηση αναφορικά με τη συμμετοχή των συστατικών του συμπληρώματος σε αναπτυξιακές διεργασίες, παρουσιάζει πλέον ιδιαίτερο ενδιαφέρον. / The complement system includes more than 30 serum and membrane proteins and constitutes one of the most phylogenetically ancient immune mechanisms of the host. Its activation, via the classic, alternative or lectin pathway, leads to a cascade of reactions. All these reactions converge to the terminal lytic pathway, leading to the MAC complex creation, which results in osmotic lysis of the targeted cells. In the present work, concerning the study of the molecular evolution of the terminal complement pathway genes, the sixth complement component (C6) of the chicken (Gallus gallus) was cloned. Afterwards, a phylogenetic tree was created, in which the above genes are compared with the respective orthologs, in various organisms. As it seems from the phylogenetic analysis, chicken’s C6 clusters with the respective mammalian and frog orthologs, creating a well defined subgroup in the MACPF gene family. According to literature, besides the complement system’s role in immunity, it has been shown that it is also involved, in tissue regeneration, cell activation, proliferation and regulation of apoptosis. In order to further investigate the hypothesis of complement system’s involvement in developmental procedures, the developmental and tissue expression profile of complement components were studied in the chicken. The tissue study involved the investigation and semi-quantitative expression analysis, at the mRNA level, in eight tissues deriving from one adult chicken: brain, heart, intestine, kidney, liver, lung, spleen and stomach. The developmental study included the investigation and semi-quantitative expression analysis, at the mRNA level, of the whole homogenized 4 and 6 day embryo, in the liver from a 12 and 17 day embryo and the liver from a neonate chicken, 2 and 5 days old. In particular, the expression of C3 gene was studied in various developmental stages where the gene expression was certified in all stages. Moreover, the tissue and developmental expression of MAC complex structural genes (C6, C7, C8α, C8β, C8γ) was studied, as well as the developmental expression of the regulatory genes of MAC complex (CD59, CLU,VTN). The study of the tissue expression profile for the structural MAC components was shown that the various components exhibit a variable expression, with the liver being the major source of expression. In the developmental expression 117 profile study, it was shown that all structural MAC components initially appear in the 12th embryonic day, while no expression of them was detected in the 2 day old neonate chicken. On the contrary, the developmental expression profile study of the regulatory MAC genes was shown that they expressed throughout the developmental stages. This fact possibly reflects the regulatory proteins pleiotropic action, as they are involved in additional functions, which are not related to complement functions, such as development and organs maturation. Analogous conclusions could be drawn in the case of C3 gene, because of its expression in stages of chicken early development, despite the absence of expression of structural MAC genes in the respective developmental stages. Concluding, the above study is the first reference to the spatial and temporal expression of complement genes in the chicken. In accordance with the above mentioned, further investigation concerning the involvement of complement components in developmental procedures, appears to be of great interest.

Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. / Το σύστημα του συμπληρώματος περιλαμβάνει πάνω από 30 πρωτεΐνες του πλάσματος (διαλυτές και υποδοχείς) και παίζει σημαντικό ρόλο, τόσο στη φυσική όσο και στην προσαρμοστική ανοσία. Το συμπλήρωμα ενεργοποιείται μέσω τριών οδών, της κλασσικής, της εναλλακτικής και της λεκτινικής, καταλήγοντας σε κάθε περίπτωση, μέσω της λυτικής οδού, στη διαμόρφωση ενός τελικού συμπλόκου, που λύει το παθογόνο. Τα συστατικά του συμπληρώματος τα οποία απαρτίζουν το τελικό σύμπλοκο MAC, και συμμετέχουν έτσι στη λυτική οδό, είναι τα C5b, C6, C7, C8α, C8β, C8γ και C9. Προκειμένου να μελετήσουμε την μοριακή εξέλιξη της λυτικής οδού του συμπληρώματος κλωνοποιήσαμε και χαρακτηρίσαμε την α και γ υπομονάδα του όγδοου συστατικού του συμπληρώματος στην ιριδίζουσα πέστροφα. Τα cDNA που προέκυψαν για τα C8α και C8γ ήταν 2.037 και 977 νουκλεοτίδια, αντίστοιχα, ενώ η συναγόμενη αμινοξική αλληλουχία ήταν 615 και 221 αμινοξέα, αντίστοιχα. Τα δύο μόρια παρόλο που αλληλεπιδρούν άμεσα και δευσμεύονται επι του συμπλόκου MAC, ανήκουν σε διαφορετικές πρωτεϊνικές οικογένειες. Η μοριακές τους δομές ομοιάζουν με τις αντίστοιχες των μορίων των θηλαστικών και οι αμινοξικές τους αλληλουχίες παρουσιάζουν σημαντικό βαθμό συντήρησης. Στην πέστροφα, το C8α δείχνει να εκφράζεται κύρια στο ήπαρ και στο νεφρό, ενώ το C8γ εκφράζεται επιπλέον και στον ιστό της καρδιάς και της σπλήνας. Ανάλυση κατά Southern έδειξε πως τα δύο γονίδια συναντώνται ως μοναδικά αντίγραφα στο γονιδίωμα της ιριδίζουσας πέστροφας. Αξίζει, τέλος, να σημειωθεί οτι αυτή είναι η πρώτη αναφορά για την κλωνοποίηση της α και γ υπομονάδας του όγδοου συστατικού του συμπληρώματος στα κατώτερα σπονδυλωτά. / The complement system consists of 30 and more proteins present in blood and cell membranes and plays an important role in host defense by interacting with components of both innate and adaptive immunity. It is activated through three distinct activation pathways: the antibody-dependent classical pathway and the alternative and lectin pathways, which are activated by direct binding of complement components to microbial surfaces. Unlike mammalian and other species, teleost are the only organisms that reveal a completely developed and extended complement system, via gene duplication and functional diversity. Complement activation via the classical, lectin, or alternative pathway leads to the formation of the (pore forming) membrane attack complex (MAC) on the surface of complement-opsonized cells. The assembly of MAC involves the aggregation of the lytic complement components C5b, C6, C7, C8α, C8β, C8γ, and C9. In order to elucidate the phylogeny of the lytic pathway of complement we now report the cloning and characterization of the C8α and C8γ genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). The deduced amino acid sequence of the trout C8α gene exhibits 44 and 43% identity with human and frog orthologs, respectively. The domain architecture of the trout C8α resembles that of mammalian orthologs, and the cysteine backbone shows a high degree of conservation. The trout C8α shows a similar expression profile with that of trout C8β and C8γ, pointing to the liver as the main source of the C8α gene expression. Although the presence of a fully developed lytic pathway of complement system is expected in teleost, this is the first report of the C8α gene in an organism other than mammalian. The deduced amino acid sequence of trout C8γ shows significant identity (37%) to the human C8γ homolog and much lower to the other known lipocalins. The lipocalin domain is present and all the cysteine residues are conserved. The trout C8γ gene is probably present as a single copy in the trout genome showing a differential expression pattern among tissues investigated. This is the first report the C8α and C8γ genes in an organism other than mammalian.