La fonction barrière de la peau dépend en grande partie d’une différenciation appropriée des kératinocytes épidermiques. Au cours de ce processus, de nombreux changements ont lieu dans ces cellules tels que la diminution de la prolifération, le remodelage du cytosquelette, des changements dans l’expression génique, la dégradation du noyau et des organites de même que la formation d’une structure bien particulière : l’enveloppe cornée. Il est important que de tels évènements soient régulés de façon adéquate puisqu’un débalancement au sein de ces derniers peut mener à l’apparition de conditions pathologiques. La Dual Leucine zipper-bearing Kinase (DLK) est une Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase dont l’expression est très forte au niveau de la couche granuleuse, soit la dernière couche de cellules vivantes avant la couche cornée de l’épiderme. Des études précédentes ont révélé que la surexpression de la DLK dans des kératinocytes en culture avait pour effet d’induire la différenciation terminale. Toutefois, les mécanismes par lesquels la DLK régule ce processus restent encore méconnus faisant en sorte que l’objectif général de cette thèse consiste à mieux les définir. L’hypothèse à la base de ces travaux est que la DLK est requise pour la différenciation des kératinocytes et que celle-ci y participe en favorisant la stabilisation des microtubules de même que l’expression ou l’activité de facteurs de transcription impliqués dans ce processus. Dans un premier temps, un modèle de peau reconstruite in vitro dans lequel l’expression de la DLK a été réduite par interférence à l’ARN a été développé. Il a été noté que la diminution de la DLK avait pour effets d’affecter la distribution de protéines de l’enveloppe cornée telles que la filaggrine et la transglutaminase 1 de même que d’inhiber la formation des couches granuleuse et cornée. Des analyses en immunofluorescence et en microscopie électronique ont permis d’observer des défauts au niveau des jonctions serrées et des desmosomes dans les peaux sous-exprimant la DLK révélant un rôle de cette kinase dans le bon maintien de ces deux types de jonctions cellulaires. L’impact de la DLK sur les microtubules a été étudié dans des kératinocytes en culture transduits à l’aide de vecteurs adénoviraux menant à la surexpression de la DLK de même que dans les peaux reconstruites présentant une expression réduite de cette kinase. Ces études ont permis de conclure que la DLK était non seulement en mesure d’induire la réorganisation et la stabilisation des microtubules en périphérie cellulaire, mais que celle-ci était également requise à la réalisation de ces processus. Afin de mieux décrire les mécanismes par lesquels la DLK assure la réorganisation des microtubules en périphérie cellulaire, les effets de la surexpression ou de la sous-expression de la DLK sur les protéines LIS1 et HSP27 (pour Heat shock protein 27 kDa), des régulateurs de la distribution des microtubules, ont été étudiés. Ces analyses ont permis de définir la DLK en tant qu’élément nécessaire à la bonne distribution en périphérie cellulaire de LIS1 et HSP27. Des études plus poussées ont révélé que l’expression de la DLK dans des kératinocytes en culture était non seulement en mesure d’induire la redistribution en périphérie cellulaire d’HSP27, mais également l’insolubilisation et la phosphorylation de cette protéine de choc thermique. Il a également été démontré que l’ensemble de ces processus dépendaient de l’activité de ERK (pour Extracellular-signal Regulated Kinase). Dans le but de définir l’importance des microtubules dans le processus de différenciation des kératinocytes, des peaux reconstruites ont été traitées avec un agent induisant la dépolymérisation de cette composante cytosquelettique soit plus précisément le nocodazole. Un tel traitement produit un phénotype similaire à celui des peaux reconstruites sous-exprimant la DLK suggérant les microtubules comme d’importants effecteurs de la différenciation induite par la DLK. Dans la perspective de mieux définir les effets de la DLK sur la signalisation cellulaire et l’expression génique globale, nous avons eu recours à l’étude de la phosphorylation d’importants médiateurs de la signalisation moléculaire intracellulaire de même qu’à des analyses en micropuce à ADN d’échantillons provenant de peaux reconstruites sous-exprimant la DLK. Cette démarche a permis de révéler une hausse de la phosphorylation de ERK1/2, de JNK1/2/3, de GSK3 (pour Glycogene Synthase Kinase 1) et du récepteur à l’EGF (pour Epidermal Growth Factor). Les analyses en micropuce à ADN ont permis de révéler une réduction dans l’expression de nombreux gènes impliqués dans la formation de l’enveloppe cornée. Finalement, la réduction de c-Jun et de C/EBPα a pu être observée dans les noyaux de peaux reconstruites sous-exprimant la DLK révélant ainsi l’importance de cette kinase dans la régulation de ces facteurs de transcription dans un contexte de différenciation des kératinocytes. Globalement, nos travaux montrent que la DLK est requise pour la différenciation des kératinocytes et que celle-ci y contribue en assurant la réorganisation des microtubules en périphérie cellulaire, la consolidation des desmosomes et des jonctions serrées de même la régulation positive des facteurs c-Jun et C/EBPα. / Skin barrier function greatly depends on proper keratinocyte differentiation in the epidermis. During this process, many changes occur within the cell such as decrease in cell proliferation, cytoskeleton reorganization, changes in gene expression, nucleus and organelles elimination as well as cornified envelope formation. Keratinocyte differentiation must be finely orchestrated since misregulation of this process may lead to pathological conditions. The Dual Leucine zipper-bearing Kinase (DLK) is a Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase showing a strong expression in the granular layer, the last layer composed of living cells before reaching the cornified layer. Previous studies revealed DLK capacity to induce keratinocyte terminal differentiation process. However, how DLK promotes such an event remains unknown. The main objective of this thesis is to identify mechanisms and potential effectors of the DLK-induced keratinocyte differentiation. Our hypothesis is that DLK is required for keratinocyte differentiation by promoting microtubule stabilization as well as the expression or the activity of transcription factors involved in this process. In order to test our hypothesis, a tissue-engineered skin (TES) model with a reduced DLK expression was produced using a RNA interference approach. Impaired distribution of cornified envelope proteins such as filaggrin and transglutaminase 1 as well as reduced granular and cornified layers were observed in TES with reduced DLK expression. In those samples, immunofluorescence and electron microscopy analyses pointed out desmosomal and tight junctional defects suggesting a role for DLK in the maintenance of these types of cell junctions. The impact of DLK expression on microtubules was also studied in TES with reduced DLK expression and in keratinocytes in culture overexpressing DLK following gene transduction using adenoviral vectors. These studies led to the conclusion that DLK not only promotes but is also required for microtubules reorganization and stabilization to cell periphery. To explain DLK capacity to induce such a process, effects of DLK depletion or overexpression on microtubule regulators such as LIS1 and HSP27 were investigated by immunofluorescence staining. These analyses revealed that DLK induces and is required for LIS1 and HSP27 relocalization to cell periphery. In additional studies, our results show that DLK expression in normal human keratinocytes in culture not only promotes HSP27 distribution to cell periphery but also induces HSP27 insolubilization and phosphorylation in an ERK-dependent manner. In order to more precisely define the role of microtubules in keratinocyte differentiation process, TES were treated with nocodazole, a microtubule depolymerizing agent. The effect of such a treatment was to reproduce the phenotype of DLK-depleted TES suggesting that microtubules are important effectors of DLK-induced keratinocyte differentiation. In an attempt to describe the impact of DLK on global gene expression, RNA samples of DLK-depleted TES were studied using microarray analyses. This approach revealed a reduction in the expression of many genes coding for cornified envelope proteins. Reductions of c-Jun and C/EBPα immunofluorescence staining were also noted in TES with a reduced DLK expression suggesting this kinase as a c-Jun and C/EBPα regulator in the context of keratinocyte differentiation. Globally, our works show that DLK is required for keratinocyte differentiation since it promotes microtubule reorganization to cell periphery, desmosomes and tight junction consolidation as well as c-Jun and C/EBPα localization to the nucleus.

Le développement tumoral nécessite une dérégulation des contrôles normaux de la prolifération et de la différenciation cellulaires. Il est bien connu que la voie de signalisation ERK/MAP kinase est impliquée dans ces processus de régulation cellulaire. De plus, un rôle essentiel dans la transformation cellulaire est attribué à MEK1 qui est un élément central de cette voie. Une meilleure compréhension de l'implication de MEK1 dans les voies de transduction devrait donc nous permettre de mieux comprendre le developpement cellulaire et la transformation morphologique. Mes travaux de recherche tentent d'élucider les mécanismes de régulation des protéines kinases MEK1 et MEK2 dans le but de mieux comprendre leur divergence fonctionnelle et leur implication dans les différentes réponses cellulaires. Ainsi, l'étude de la voie ERK/MAPK chez les fibroblastes embryonnaires mutants pour le gène Mek1 indique que la transduction du signal amorcée par un neuropeptide, la bombésine, passe spécifiquement par MEK1 et serait indépendant de MEK2. La région C-terminale de MEK1 semble médier la spécificité de la réponse à la bombésine. Le domaine MSS, qui est une insertion d'une séquence riche en proline unique à MEK1 et MEK2 pourrait être la clef de cette réponse spécifique. En outre, nos travaux de délétion et d'interactions protéiques suggèrent qu'une variation de la conformation de la région C-terminale de MEK1 pourrait avoir lieu entre l'état inactif et l'état actif de ces MAPKKs. En absence d'activation, la région en caboxy du domaine kinase semble interagir avec la boucle d'activation se trouvant au cœur du domaine kinase. Cette interaction intramoléculaire serait dépendante de l'état de phosphorylation de MEK1. Par contre, la région en carboxy ne semble pas être un domaine d'autoinhibition ou un pseudo substrat puisque sa délétion ne met pas la protéine dans un état constitutivement actif. Ainsi, il est possible que cette région soit essentielle du point de vue structural pour permettre, en fonction de son activité, la régulation des interactions de MEK1 (ou MEK2) avec ses activateurs, substrats ou protéines d'échafaudage.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2006. / Bibliogr.: f. 161-205. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [115]-120. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Le génome des mammifères contient deux gènes ERK/MAP kinase kinase, soient Mek1 (Map2k1) et Mek2 (Map2k2), qui codent pour des enzymes responsables de l’activation de ERK1/2. Chez la souris, la perte de fonction de Mek1 engendre une mortalité embryonnaire, tandis que les mutants Mek2 survivent sans aucun phénotype apparent. Afin d’élucider les fonctions potentielles associées à MEK2 durant l’embryogenèse, la perte de Mek2 a été étudiée en présence d’une haplo-insuffisance de Mek1. La majorité des embryons Mek1+/-Mek2+/- meurent durant la gestation due à des défauts placentaires affectant les tissus extraembryonnaires. Ainsi, bien que Mek1 joue un rôle prédominant, ces résultats mettre en lumière l’implication de Mek2 durant le développement du placenta. La caractérisation histologique des placentas Mek1+/-Mek2+/- a révélé une diminution de la vascularisation et la formation aberrante de cellules trophoblastiques géantes multinucléées (MTG). Des expériences génétiques de traçage cellulaire in vivo ont démontré que les cellules MTG dérivent d’une différenciation aberrante des SynT-II et que leur formation découle en partie d’un effet cellule autonome. Un second objectif de cette thèse était de mieux caractériser le ou les types cellulaires nécessitant une activation de la voie ERK/MAPK essentielle au développement placentaire. Des analyses génétiques et histologiques ont démontré que la formation des cellules MTG résulte d’une fusion ectopique entre les deux couches de SynT qui participent normalement de façon indépendante à la barrière hématoplacentaire. La barrière hématoplacentaire est constituée d’une double couche de SynT et de cellules dérivées de l’allantoïs, soient les cellules endothéliales et leurs péricytes. La délétion d’un allèle supplémentaire de Mek1 dans l’allantoïs des mutants Mek1+/-Mek2+/- augmente la pénétrance et l’expressivité du phénotype placentaire. De plus, les expériences d’ablation cellulaire in vivo ont permis de démontrer que le développement des SynT-I en une fine couche de cellules multinucléées dépend de la présence de la deuxième couche de SynT. Finalement, par approche de gènes candidats et par analyse de biopuces dans les placentas mutants Mek1Mek2, nous avons montré une expression dérégulée de cibles potentielles de ERK1/2 impliquées dans la déterination, la polarité et la fusion cellulaire, ce qui contribue à la compréhension du phénotype observé. / The mammalian genome contains two ERK/MAP kinase kinase genes, Mek1 and Mek2, which encode dual-specificity kinases responsible for ERK/MAP kinase activation. In the mouse, the loss of Mek1 function causes embryonic lethality, whereas Mek2 mutants survive with a normal lifespan, suggesting that Mek1 rescues the lack of Mek2 function. The first objective of my thesis was to clarify potential functions of Mek2 during mouse embryogenesis. To do, I have analyzed the loss of Mek2 function in the presence of Mek1 haploinsufficiency. Most Mek1+/-Mek2+/- embryos die during gestation from placenta defects affecting extra-embryonic tissues. Thus, even though Mek1 plays a predominant role, these results enlightened the function of Mek2 in placenta development. The histological characterization of Mek1+/-Mek2+/- placentas revealed a diminution of the vascularization and an aberrant formation of multinucleated trophoblast giant (MTG) cells. Genetic experiments on the SynT-II cellular lineage in vivo demonstrated that MTG cells derive from the aberrant SynT-II differentiation and that their formation results from a cell-autonomous effect. The second objective of my thesis was to determine in which cell types the ERK/MAPK activation is essential for placenta development. Genetic analyses combined with histological studies revealed that MTG formation resulted from the ectopic fusion between both layers of SynT, which normally participate in an independent way in the blood-placental barrier. The blood-placental barrier is constituted of a double layer of SynT and by the cells derived from the allantois, the endothelial cells and their perycites. The deletion of both Mek1 alleles in allantois-derived tissues in a Mek1+/-Mek2+/- placenta environment increases the penetrance and the expressivity of the MTG phenotype. These results demonstrate the role of the ERK/MAPK pathway in defined embryonic and extraembryonic cell populations for correct placenta formation. Using mouse genetics, we also demonstrated that the normal development of syncytiotrophoblasts type I into a thin layer of multinucleated cells depends on the presence of the syncytiotrophoblasts type II. Finally, the combined mutations of Mek1 and Mek2 genes alter the expression of several genes involved in cell fate specification, cell fusion and cell polarity that likely explain the underdeveloped placenta and the MTG phenotype seen in Mek1Mek2 mutants.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2016-2017 / Les mammifères possèdent deux MAP kinases kinases (MEK1 et MEK2), impliquées dans l’activation de la voie ERK/MAPK essentielle pour la différenciation, la prolifération et la survie cellulaire. Le premier objectif de cette thèse était de déterminer si les fonctions des kinases MEK1 et MEK2 sont redondantes durant le développement embryonnaire. Les souris Mek1-/- meurent à mi-gestation d’une malformation du placenta. Les souris Mek2-/- ne présentent aucun phénotype majeur, suggérant que ces deux protéines ont des rôles différents. Cependant, la plupart des mutants Mek1+/-Mek2+/- meurent pendant la gestation d’un sous-développement du placenta, indiquant que Mek1 et Mek2 ont chacun un rôle dans le développement des tissus extraembryonnaires. À ce jour aucune évidence claire ne permet de statuer sur la redondance fonctionnelle de MEK1 et MEK2. Afin de vérifier la spécificité fonctionnelle de Mek1 et Mek2, nous avons généré au laboratoire un allèle « knockin », exprimant l’ADNc de Mek2 sous contrôle du locus Mek1 (Mek12). L’analyse de ces souris a révélé la redondance fonctionnelle entre MEK1 et MEK2. L’analyse de combinaisons alléliques de Mek a démontré qu’une expression minimale de protéines MEK est cruciale pour le développement embryonnaire et la survie. Le second objectif de cette thèse était de caractériser les mutants Mp1. Les protéines d’échafaudage permettent de moduler l’activité de la voie ERK/MAPK et facilitent la transmission rapide du signal. Parmi les protéines d’échafaudage connues, seule MP1 (Mek Partner 1) a été identifiée comme étant un partenaire spécifique de MEK1 et ERK1. Cette spécificité suggère que MP1 pourrait contribuer à la différence d’activation de MEK1 et MEK2 en spécifiant le signal qui passe par Mek1. Afin d’étudier le rôle de Mp1 au cours du développement chez la souris, nous avons généré des souris Mp1-/-. L’analyse de ces mutants indique que le gène Mp1 est essentiel pour la survie et que sa fonction est nécessaire suite à la post-implantation. La dérégulation de la voie ERK/MAPK dans le développement chez l’homme a aussi des conséquences phénotypiques. Au cours des dernières années, une classe de syndromes a été caractérisée : Les « Rasophaties ». Ces syndromes partagent des caractéristiques communes qui sont, une mutation dans des gènes de la voie ERK/MAPK, une dysmorphologie cranio-faciale, des malformations cardiaques et cutanées ainsi qu’un retard mental. Parmi les mutations de la voie ERK/MAPK qui ont été identifiées, une mutation ponctuelle dans le gène Mek1 (Mek1Y130C) cause le syndrome Cardio-Facio-Cutané (CFC). Le dernier objectif de cette thèse était de générer un modèle animal pour le CFC portant la mutation Mek1Y130C. Les souris portant l’allèle Mek1Y130C présentent les phénotypes associés au CFC (i.e sténose pulmonaire, dysmorphologie cranio-faciale et défauts neurologiques). / Mammals possess two MAP kinase kinase (MEK1 and MEK2), involved in ERK/MAPK pathway. This pathway is essential for proliferation, differentiation and cell survival. The first objective of my thesis was to determinate if MEK1 and MEK2 kinases are redundant during embryonic development. Mek1-/- mice die at embryonic day E10.5 due to placental defects, whereas Mek2-/- mice survive with a normal lifespan suggesting that MEK1 possesses functions not shared by MEK2. However, most Mek1+/-Mek2+/- embryos also die from placental defects, indicating that both Mek genes contribute to placental development. To date, no clear evidence on MEK1 and MEK2 redundancy has been provided. To assess the functional specificity of the Mek1 and Mek2 genes, we produced a Mek1-knockin allele in which the Mek2 coding sequences were placed under the control of Mek1 regulatory sequences. Analyzing these mice allowed us to demonstrate that MEK1 and MEK2 can substitute for each other and that a minimal amount of MEK is critical for placenta development and embryo survival. The second objective of my thesis was to characterize Mp1 mutants. Scaffold proteins modulate MAPK pathway by providing spatial and temporal specificity. Among known ERK/MAPK scaffold proteins, only MP1 (Mek Partner 1) is specific to MEK1 and ERK1, raising the question of the specificity of MP1 in the regulation of ERK/MAPK pathway via MEK1. In order to investigate Mp1 function in vivo, we generated Mp1 knock-out mice. Analyzing these mice enable us to suggest that Mp1 is required for embryonic development and is essential during post-implantation. Deregulation of Ras/MAPK pathway also causes developmental phenotypes in human. During the last decade, a new class of syndromes, which share common phenotypes such as mutations in Ras/MAPK pathway, cranio-facial dysmorphology, cardiac and cutaneous malformations and neurological delay has been described and named Rasophaties. Among the DNA mutations found in rasopathies, the Mek1 mutation, Mek1Y130C, causes cardio-facio-cutaneous syndrome (CFC). The last objective of my thesis was to generate a mouse model of CFC, with the Mek1Y130C mutation. I found that mice carrying the Mek1Y130C mutation partially recapitulate CFC syndrome (i.e pulmonary stenosis, crani-facial dysmophia and neurological defects).

La voie ERK/MAPK est impliquée dans plusieurs processus biologiques dont la prolifération cellulaire, la différenciation, l'apoptose et la migration. Les protéines kinases MEK1 et MEK2 sont les seuls activateurs connus d'ERKl et ERK2. Les mutations inactivant les gènes Mekl et Mek2 ont été développées chez la souris pour étudier les fonctions des ces deux activateurs lors du développement embryonnaire. L'analyse phénotypique des mutants Mekl" montre une diminution de la prolifération et une augmentation de l'apoptose des populations trophoblastiques. Les embryons Mekïf~ meurent à mi-gestation d'une sous-vascularisation du labyrinthe placentaire qui normalement permet les échanges gazeux et nutritiormels foeto-maternels. Des analyses histologiques suggèrent également un problème de migration lors des processus d'invagination du réseau vasculaire. Ces résultats montrent que MEK1 est impliqué spécifiquement dans certaines fonctions des trophoblastes et que son absence induit une dysmorphogénèse létale du placenta murin. Pour étudier l'implication spécifique de MEK1 dans ces populations trophoblastiques, des modèles cellulaires ont été établis.

Les gènes Mekl et Mekl codent pour les activateurs des MAPK ERK1 et ERK2. Afin de déterminer la fonction de ces deux activateurs dans la voie ERK/MAPK lors du développement embryonnaire, les gènes Mekl et Mek2 ont été inactivés chez la souris. Les embryons Mekl ''' meurent à mi-gestation d'une malformation du placenta caractérisée par une sous-vascularisation du labyrinthe, région du placenta impliquée dans les échanges nutritionnels et gazeux foeto-maternels. Les souris Mek2 ~'~ sont viables et fertiles et ne présentent aucun phénotype. Afin d'évaluer le rôle possible du gène Mekl lors du développement embryonnaire, les deux mutations ont été introduites chez les mêmes individus. De façon inattendue, les souris Mekl +/" : Mek2 +/ ~ présentent une diminution du taux de survie de 90%. Les souris Mekl +/ ~ : Mekl +/ ~ meurent durant la gestation à partir du jour 14.5. L'analyse phénotypique montre un problème au niveau de la prolifération, responsable de la diminution de la taille du placenta. Un problème au niveau de la vascularisation du placenta est également observé. L'analyse des génotypes montre que la mort des embryons est causée par un problème qui se situe au niveau des structures extra-embryonnaires. Ces résultats suggèrent que la perte de deux allèles du gène Mekl a moins d'impact sur le développement embryonnaire que la perte d'un allèle de chaque gène Mek, suggérant un rôle important de Mekl lors du développement. Des analyses montrent également que le phénotype au niveau du placenta s'aggrave avec l'augmentation du nombre d'allèles mutés Mek. Ce phénomène pourrait s'expliquer par un effet de dosage des gènes Mek. Un allèle Mekl hypomorphe a été généré ainsi qu'un allèle conditionnel. Ces nouveaux allèles ont servis à tester cette hypothèse. Les phénotypes des différents mutants ont été caractérisés et sont présentés. / MEKl and MEK2 are dual-specificity kinases that activate the extracellular signal - regulated kinase (ERK) mitogen-activated protein (MAP) kinases upon agonist binding to receptors. To determine the function of Mekl and Mek2 during embryonic development, we inactivated each Mek gene in the mouse. Mekl'1 ' embryos died at 10.5 days of gestation. Histopathological analyses revealed a reduction in vascularization of the placenta that is due to a marked decrease of vascular endothelial cells in the labyrinthine region. Mekl''' mice are viable and fertile, and they do not present flagrant morphological alteration. To determine the role of each Mek gene during embryonic development, we introduced both mutations in the same mouse. Surprisily, 90% of the Mekl+/ ~ : Mekl+/ ~ mice died before birth. Histopathological analyses suggest a problem with the vascularization of the placenta and the proliferation of the trophoblasts in the labyrinth. Genotyping analyses revealed that embryos die due to a problem with the extra-embryonic structures. The results show that the loss of two alleles of Mekl gene is less important for the embryo development than the loss of one allele of each Mek gene suggesting an important role of Mekl in embryo development. Our data also indicate that the expressivity of the placental phenotype increases with the number of mutated Mek alleles. This can be explained by a gene dosage effect of the Mek genes. We have also generated an Mekl hypomorph allele and a conditional allele. Those alleles will be used to test this hypothesis. The characterization of the phenotype for each mutant will be presented.

Dans le laboratoire du Dr. Charron, le gène Mekl a été inactivé par mutagenèse d'insertion et il a été démontré que les embryons Mekl'' mouraient à la mi-gestation à cause d'une vascularisation déficiente du placenta (Giroux et al., 1999). Chez les placentas Mekl'' la structure du labyrinthe (impliqué dans les échanges nutritifs et gazeux entre le fœtus et la mère) est réduite voire quasi-inexistante. Les objectifs de la présente thèse étaient (i) d'étudier en détails le phénotype placentaire Mekl'", (ii) d'étudier la signalisation de la voie ERK/MAPK in vitro dans un modèle cellulaire participant au développement du placenta, et (iii) de générer un allèle conditionnel de Mekl afin de faire le 'rescue' du placenta Mekï'~. Par marquage immunohistochimique, il a été montré qu'il y a plus de cellules apoptotiques et moins de cellules prolifératives dans la région chorion-allantois du placenta Mekt' en comparaison avec les placentas Mekt/+ . Des analyses westerns sur des extraits totaux de placentas ont montré que la voie ERK/MAPK est beaucoup moins activée chez les spécimens Mekl~'~. Chez les placentas Mekl*'*, il a été montré que MEK1/2 sont activés de façon ubiquitaire dans la région du labyrinthe alors que, ERK1/2 sont principalement activés au niveau des syncytiotrophoblastes (SCT). Chez les placentas Mekl'', bien que MEK2 soit fortement activé au niveau de la jonction chorion-allantois, aucune activation de ERK n'est détectée à la jonction chorion-allantois. Par hybridation in situ, en utilisant le gène Gcml comme un marqueur des précurseurs de SCT, il a été montré que chez les placentas Mekl"', les SCT sont déterminés au bon moment, semblent se différencier normalement, mais sont incapables d'envahir le chorion pour guider la formation du réseau vasculaire du labyrinthe. Ces résultats suggèrent l'implication de Mekl dans la migration et/ou la différenciation des SCT. Par ailleurs, nous avons aussi montré que chez les spécimens Mekl1 ''", la p38/MAPK est phosphorylée au niveau des cellules endothéliales entourant les vaisseaux sanguins fœtaux du labyrinthe. Ce résultat concorde avec les données publiées dans la littérature indiquant que la voie p38 /MAPK est impliquée dans l'angiogenèse. L'activation de p38/MAPK chez les placentas Mekl'1 ' semble normale. Nos résultats suggèrent donc que la voie ERK/MAPK serait essentielle pour la morphogenèse de la barrière formée par les SCT alors que la p38/MAPK serait plutôt impliquée dans l'angiogenèse des cellules épithéliales des vaisseaux sanguins du labyrinthe. D'autre part, plusieurs lignées de trophoblastes souches (TS : cellules souches participant activement dans la morphogenèse du placenta) Mekl+/+ et une lignée de TS Mek2'y ' ont pu être dérivés. Cependant, aucun TS Mekl' ' n'a pu être établi et deux des quatre lignées Mekl''' établies dans les conditions de culture de cellules TS, se sont avérées être des cellules embryonnaires souches (ES). Cette observation soulève plusieurs questions intéressantes en rapport au rôle de Mekl dans la prolifération et la différenciation des TS et/ou des cellules ES in vitro. Des travaux sont actuellement en cours dans notre laboratoire pour approfondir ces rôles. Un autre volet du présent projet était d'étudier le rôle de Mekl dans le développement de l'embryon proprement dit, il a été montré que lorsque les cellules ES Mekl'' sont agrégées avec des embryons tétraploïdes on arrive à générer des embryons et des placentas qui se développent normalement jusqu'au stade E13.5. Cependant, cette sauvegarde est incomplète, car l'embryon à E13.5 présente une morphologie légèrement anormale. Pour confirmer ce résultat, un allèle conditionnel chez lequel l'exon 3 de Mekl est flanqué par deux sites loxP (Mekl*10™) a été généré. L'excision de l'exon 3 génère un allèle nul de Mekl (MeklA ). En utilisant une lignée de souris transgénique exprimant la Crerecombinase spécifiquement dans l'épiblaste (Sox2Cre), des embryons MeklA/Aayant un placenta de type sauvage ont été généré. De plus, les souris MeklA/A sont viables et fertiles en l'absence de MEK1. En conclusion, les résultats décrits dans cette thèse suggèrent fortement que Mekl est requis principalement pour le développement des structures extra-embryonnaires du placenta murin. / Previously, it has been shown that Mekï' embryos die between E9.5-10.5 without any major embryonic malformations, while the placenta presented marked reduction in labyrinthine vascularisation (Giroux et al., 1999). By western analyses we showed that the ERK/MAPK pathway is much less activated in the Mekï ' placentas compared to wild type specimens. Our immunohistochemical analyses revealed that in Mekl+/+ placentas, MEKl/2 are ubiquitous and highly activated in the labyrinth (where gaseous and nutrient exchange take place between the fetus and the mother). ERK1/2 are activated mostly in syncytiotrophoblasts (SCT: ultimate barrier separating fetal and maternai blood flows in the labyrinth). In Mekï" placentas, MEK2 is mostly activated in the chorio-allantoic junction while ERK1/2 are activated exclusively in the allantois and not in the chorio-allantoic junction. Mekï'' placentas presented abnormal morphogenesis of the SCT barrier. Indeed, in Mekï'" placentas, we showed that SCT precursors (Gcm/-positive cells) are determined at the right moment (around E8.5), seemed to be able to differentiate but did not seem to be able to invade the chorion. We also showed that in Mekl*'+ specimens, the p38/MAPK pathway is phosphorylated in endothelial cells surrounding the labyrinthine fetal blood vessels. This observation is in accord with data published in literature assigning an important role of the p38/MAPK pathway in angiogenesis. Activation of the p38/MAPK pathway in Mekï' embryos seemed normal. Our results suggest that signaling through Mekl might be essential for SCT barrier morphogenesis. Furthermore, Giroux et al., (1999) showed that Mekï'" mouse embryonic fibroblasts failed to migrate in response to a fibronectin matrix. Hence we were interested to verify the migration and differentiation potentials of a cell type participating actively in placental development, i.e. trophoblast stem cells (TS). We managed to isolate several wild type and one Mekl'' TS cell lines while we did not obtain any Mekï'' TS. Interestingly, the cells obtained from Mekï'' blastocysts were mainly embryonic stem cells (ES). Hence these findings posed new questions concerning the implication of Mekl in the growth and maintenance of TS cells in vitro. Experiments are being carried out in our laboratory to pour light on these interrogations. Furthermore, we wanted to investigate the role of Mekl in the development of the embryo after E10.5. Using the tetraploid aggregation strategy, we were able to generate live E13.5 Mekl' ' embryos, hence suggesting that the Mekl phenotype is probably extra-embryonic and cell-autonomous. We confirmed thèse results by generating a conditional Mekl allele, in which the exon 3 of Mekl is flanked by two loxP sites (Mekla ° xed). By crossing this mouse with transgenic Cre mouse line (Sox2cre) expressing Cre recombinase specifically in the epiblast, we showed that the Mekl null {MeklA/A) mouse is viable and fertile. Our results demonstrate that Mekl is primordial for extraembryonic development in mouse.

Nitric oxide (NO) is an important biological molecule within the body, which over production of this molecule in response to different stimulations can cause various inflammatory diseases. Over production of this molecule is caused by the induction of the inducible nitric oxide synthase (iNOS) enzyme. This enzyme uses L-arginine as a substrate and therefore the presence and transport of this amino acid into the cells can be a key factor in regulating NO over production. Different signalling mechanisms have been implicated in the regulation of this pathway and one of which involves the Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK). This family of proteins respond to inflammatory conditions and may mediate effects induced by inflammatory mediators. Of the MAPKs, the role of the c-Jun-N-terminal kinase (JNK) pathway in the induction of iNOS is still controversial. JNK and its downstream target, the transcription factor Activator Protein-1 (AP-1), have shown contradictory effects on iNOS induction leading to controversies over their role in regulating iNOS expression in different cell systems or with various stimuli. The studies described in this thesis have determined the role of JNK/AP-1 on iNOS expression, NO production, L-arginine uptake and also on the transporters responsible for L-arginine transport into the cells. The studies were carried out in two different cell types: rat aortic smooth muscle cells (RASMCs) and J774 macrophages which are both critically associated with the over production of NO in vascular inflammatory disease states. The first approach was to block the expression of the inducible L-arginine-NO pathway using SP600125 and JNK Inhibitor VIII which are both pharmacological inhibitors of JNK. The results from these studies showed that the pharmacological intervention was without effect in RASMCs, but inhibited iNOS, NO and L-arginine transport in J774 macrophages. In contrast, the molecular approach employed using two dominant negative constructs of AP-1 (TAM-67 and a-Fos) revealed a different profile of effects in RASMCs, where a-Fos caused an induction in iNOS and NO while TAM-67 had an inhibitory effect on iNOS, NO, L-arginine transport and CAT-2B mRNA expression. The latter was unaffected in RASMCs but suppressed in J774 macrophages by SP600125. Examination of JNK isoforms expression showed the presence of JNK1 and 2 in both cell systems. Moreover, stimulation with LPS/IFN- or LPS alone resulted in JNK phosphorylation which did not reveal any difference between smooth muscle cells and macrophages. In contrast, expression and activation of AP-1 subunits revealed differences between the two cell systems. Activation of cells with LPS and IFN- (RASMCs) or LPS alone (J774 macrophages) resulted in changes in the activated status of the different AP-1 subunit which was different for the two cell systems. In both cell types c-Jun, JunD and Fra-1 were increased and in macrophages, FosB activity was also enhanced. Inhibition of JNK with SP600125 caused down-regulation in c-Jun in both cell types. Interestingly this down-regulation was in parallel with increases in the subunits JunB, JunD, c-Fos and Fra-1 in RASMCs or JunB and Fra-1 in J774 macrophages. Since, SP600125 was able to exert inhibitory effects in the latter cell type but not in RASMCs, it is possible that the compensatory up-regulation of certain AP-1 subunits in the smooth muscle cells may compensate for c-Jun inhibition thereby preventing suppression of iNOS expression. This notion clearly needs to be confirmed but it is potentially likely that hetero-dimers formed between JunB, JunD, c-Fos and Fra-1 could sustain gene transcription in the absence of c-Jun. The precise dimer required has not been addressed but unlikely to exclusively involve JunB and Fra-1 as these are up-regulated in macrophages but did not sustain iNOS, NO or induced L-arginine transport in the presence of SP600125. To further support the argument above, the dominant negatives caused varied effects on the activation of the different subunits. a-Fos down-regulated c-Jun, c-Fos, FosB, Fra-1 whereas TAM-67 reduced c-Jun and c-Fos but marginally induced Fra-1 activity. Associated with these changes was an up-regulation of iNOS-NO by a-Fos and inhibition by TAM-67. Taken together, the data proposes a complex mechanism(s) that regulate the expression of the inducible L-arginine-NO pathway in different cell systems and the complexity may reflect diverse intracellular changes that may be different in each cell type and not always be apparent using one experimental approach especially where this is pharmacological. Moreover, these findings strongly suggest exercising caution when interpreting pure pharmacological findings in cell-based systems particularly where these are inconsistent or contradictory.