Orientadora: Profa. Dra. Silvia Ribeiro de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / As plantas possuem mecanismos de defesas que sao classificados como diretos e indiretos, ativando varias vias de respostas. As defesas diretas estao presentes constitutivamente nas plantas e podem estar relacionadas com o sistema antioxidante que possui componentes tais como glutationa oxidada (GSSH), glutationa reduzida (GHS), acido ascorbico (AA) e acido dehidroascorbico (DHA) que agem na manutencao do balanco oxi/antioxidante das plantas, visando minimizar os danos no sistema celular. As defesas indiretas estao relacionadas com as interacoes ecologicas e sao atribuidas aos compostos organicos volateis (COV) que podem combater o ataque de herbivoros e patogenos mediando as interacoes troficas. A ativacao das defesas ocorre quando as plantas estao expostas ao agente agressor. Dentre os varios agentes, destaca-se ozonio, por ser um poluente fitotoxico que promove estresse oxidativo e danos celulares. Nesse sentido, o presente trabalho tem o objetivo de verificar se o ozonio, e capaz de alterar as defesas quimicas diretas e indiretas de individuos de Croton floribundus e Pipitadenia gonoacantha estudadas em situacao isolada e combinada. Experimentos foram realizados em condicoes controladas e plantas foram expostas a 100 ppb de ozonio em situacao isolada e combinada. As exposicoes ocorreram durante 7 dias por 5 horas. Determinou-se os niveis dos antioxidantes acido ascorbico e glutationa por meio da espectroscopia UV-vis. Os valores dos pares AA/DHA e GHS/GSSH foram comparados com o potencial redox de cada par, obtido para as formas reduzidas/oxidadas pela equacao de Nernst. Os COV foram quantificados por cromatografia gasoasa acoplada a espectroscopia de massas. Os resultados obtidos mostraram que para as defesas diretas, a especie P.gonoacantha nao apresentou diferencas entre os tratamentos ar filtrado (AF) e ar filtrado enriquecido com ozonio (AF+O3) e entre as situacoes (isolada e combinada). Ja C.floribundus apresentou diferencas entre os tratamentos dos potenciais redox AA/DHA e GHS/GSSH na situacao combinada, mesmo assim a dose de ozonio aplicada nao foi capaz de promever danos oxidativos graves. No entanto, as defesas indiretas apresentaram emissao e inibicao de alguns compostos na presenca de ozonio. C.floribundus, em situacao isolada induziu os compostos Hexanal e 1-Hexanol,2-etil, ¿À-Felandreno, Cariofileno, cis-¿À-Farneseno, ¿¿-Muuroleno e (-) Spatulenol, enquanto que na situacao combinada apenas os compostos 3-Hexanal,1 ol (z) e o MeSa foram induzidos, os demais compostos foram inibidos na presenca do ozonio. Ja P.gonoacantha apresentou uma emissao maior de compostos na situacao isolada do que na combinada. Na situacao combinada houve majoritariamente a inducao de um sesqueterpeno nao identificado e do ¿À-Ocimeno. Esses compostos foram considerados como marcadores da coexistencia entre esssas duas especies. / Plants have mechanisms of defenses that are classified as direct and indirect, activating several response pathways. Direct defenses are constitutively present in plants and may be related to the antioxidant system that has components such as oxidized glutathione (GSSG), reduced glutathione (GSH) and ascorbic acid (AA) and dehydroascorbic acid (DHA), acting in the pro-antioxidant balance, minimizing damages in the cellular system. Indirect defenses are related to ecological interactions and are attributed to volatile organic compounds (VOCs) that can be against the attack of herbivores and pathogens mediater in the trophic interactions. Activation of defenses occurs when plants are exposed to the stressor agent. Among several agents, ozone stands out because it is a phytotoxic pollutant that promotes oxidative stress and cellular damage. In this sense, the present work has the objective of verifying that the ozone is capable of altering the direct and indirect chemical defenses of individuals of Croton floribundus and Pipitadenia gonoacantha studied in an isolated and combined situation. Experiments were carried out under controlled conditions and plants were exposed to 100 ppb of ozone in an isolated and combined situation. Exposures occurred for 7 days for 5 hours. The levels of the antioxidants ascorbic acid and glutathione were determined by UV-vis spectroscopy. The values of the DHA/AA and GSH / GSSGpairs were compared with the redox potential of each pair, obtained for the reduced / oxidized forms by the Nernst equation. The VOCs were quantified by gas chromatography coupled to mass spectroscopy. The results showed that the P.gonoacantha species did not indicate any differences between the treatments (AF) and filtered air enriched with ozone (AF + O3) and between situations (isolated and combined). C.floribundus presented differences between treatments of redox DHA/AA and GSH / GSSG potentials in the combined situation, even though the dose of ozone applied was not able to promise serious oxidative damages. However, the indirect defenses showed emission and inhibition of some compounds in the presence of ozone. C.floribundus, in the isolated situation induced the compounds Hexanal and 1-Hexanol, 2-ethyl, â-Felandren, Cariophilene, cis-â-Farnesene, á-Muurolene and (-) Spatulenol, whereas in the combined situation only compounds 3 -Hexanal, 1 ol (z) and MeSa were induced, the other compounds were inhibited in the presence of ozone. Already P.gonoacantha presented a greater emission of compounds in the isolated situation than in the combined one. In the combined situation, there was mainly the induction of an unidentified sesqueterpene and â-Ocimene. These compounds were considered as markers of coexistence between these two species.

Com o propósito de contribuir para o esclarecimento dos mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na resistência sistêmica adquirida (SAR) em plantas suscetíveis contra fitopatógenos, foram conduzidos estudos na interação Coffea arabica-Hemileia vastatrix. A indução de atividade de quitinases e b-1,3-glucanases e o envolvimento dessas enzimas na resistência sistêmica adquirida contra H. vastatrix foram avaliados em cafeeiro suscetível cultivar Mundo Novo (MN) após o tratamento com acibenzolar-S-metil (ASM) (200 mg de i.a./mL). O produto induziu aumento local e sistêmico das atividades de quitinases e b-1,3-glucanases nos tecidos foliares, a partir do primeiro e segundo dia da aplicação do indutor, respectivamente. As atividades enzimáticas atingiram níveis máximos de aumento nas plantas tratadas em relação ao controle, sete dias após a aplicação do ASM. Resistências local e sistêmica ao patógeno foram induzidas a partir do primeiro dia após o tratamento com ASM. A proteção e atividades enzimáticas foram detectadas até 35 dias, após aplicação do indutor. A indução de resistência local contra a ferrugem atingiu um nível máximo de 87% entre 7 e 14 dias. Níveis máximos de proteção sistêmica de 53 a 68% foram observados entre 2 e 21 dias após o tratamento de cafeeiro com o indutor. Neste intervalo de tempo foi observado, também, um aumento sistêmico máximo de atividade enzimática. Os resultados sugerem que o aumento de atividade dessas hidrolases está relacionado com a resistência local e sistêmica, induzida por ASM, em cafeeiro MN contra a ferrugem. Genes relacionados à SAR foram identificados em cafeeiro através de hibridização subtrativa por supressão (HSS), a partir de mRNAs isolados de plantas suscetíveis cv. MN, 72 h após o tratamento com ASM (200 mg i.a./mL). Os mecanismos de respostas de defesa associados à SAR ativada em MN foram comparados, através do isolamento de genes por HSS, com a resistência raça-cultivar específica observada no cafeeiro resistente Híbrido de Timor (HT), 72 h após a inoculação com H. vastatrix. Através da HSS, produziram-se duas bibliotecas de cDNAs subtraídas, enriquecidas de fragmentos de genes induzidos em MN pelo ASM (MN-ASM) ou ativados em HT pelo patógeno (HT-Hv). Os genes encontrados estão envolvidos em diversos processos relacionados à resistência contra fitopatógenos como: formação de espécies de oxigênio reativas, resposta de hipersensibilidade, morte celular programada, síntese e transporte de metabólitos antimicrobianos, percepção e transdução de sinal, síntese de proteínas relacionadas à patogênese, metabolismo de lipídeos e degradação controlada de proteínas. Foi identificado em HT-Hv um número maior de genes implicados em mecanismos de defesa (22%), do que em MN-ASM (16%). Na interação HT-Hv foi detectado um número maior de genes implicados na percepção e transdução de sinal (44%), do que em MN-ASM (30%). Entretanto, o número de genes codificadores de proteínas antimicrobianas foi maior no MN com resistência induzida (22%), do que no cafeeiro resistente HT inoculado com o patógeno (6%). Foram isolados de HT-Hv e MN-ASM, genes codificadores de b-1,3-glucanases e as seqüências completas puderam ser determinadas através da técnica RACE. Os resultados obtidos sugerem que a resistência em HT-Hv e MN-ASM ocorre através de mecanismos distintos. / Studies on the interaction Coffea arabica-Hemileia vastatrix were performed in order to contribute to the elucidation of biochemical and molecular mechanisms involved in systemic acquired resistance (SAR) developed in susceptible plants against pathogens. Induction of chitinase and b-1,3-glucanase activities and their involvement in systemic acquired resistance against H. vastatrix were evaluated in susceptible coffee plants cultivar "Mundo Novo" (MN) after treatment with acibenzolar-S-methyl (ASM) (200 mg a.i./mL). The product induced local and systemic increases in chitinase and b-1,3-glucanase activities in leaf tissues, starting from the first and second days after inducer application, respectively. The increases in enzymatic activity reached their maximum levels in treated plants compared to control seven days after application of ASM. Induction of local and systemic resistance against pathogen was detected one day after ASM treatment. Protection and increases in enzyme activities were detected up to 35 days after product application. Induction of local resistance against coffee leaf rust reached a highest level of 87% between 7 and 14 days. Highest levels of systemic protection ranging from 53% to 68% were observed in coffee plants between 2 and 21 days after inducer treatment. During the same time frame maximum increases in systemic enzymatic activity were also observed. Results suggest that the increases in these hydrolase activities were correlated with the local and systemic resistance induced by ASM in coffee plants against coffee leaf rust. Genes related to SAR were identified in coffee plants by suppression subtractive hybridization (SSH), from mRNA isolated from susceptible plants cv. MN 72 h after treatment with ASM (200 mg a.i./mL). The mechanisms of defense responses associated with SAR activated in MN were compared through the isolation of genes by SSH, with the race-specific resistance observed in the resistant coffee plant "Híbrido de Timor" (HT) 72 h after the inoculation with H. vastatrix. By SSH technique two subtracted cDNA libraries were constructed enriched for gene fragments induced in MN by ASM (MN-ASM) or activated in HT by pathogen infection (HT-Hv). The isolated genes were involved in different processes related to resistance against pathogens, such as: production of active oxygen species, hypersensitive response, programmed cell death, synthesis and transport of antimicrobial metabolites, signal perception and transduction, synthesis of pathogenesis-related proteins, lipid metabolism and selective degradation of proteins. It was identified in HT-Hv a higher number of defense-related genes (22 %) than in MN-ASM (16 %). The incompatible interaction HT-Hv showed a higher number of genes implicated in the signal perception and transduction (44 %) than MN-ASM (30 %). However, the number of genes encoding antimicrobial proteins was higher in the susceptible cultivar MN with induced resistance (22 %) than in the resistant coffee plant HT inoculated with the incompatible pathogen (6 %). Genes encoding b-1,3-glucanases were isolated from HT-Hv and MN-ASM and their complete sequences could be obtained by RACE procedure. Results suggest that distinct recognition events and defense pathways are involved in the expression of resistance in HT-Hv and MN-ASM.

Com o propósito de contribuir para o esclarecimento dos mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na resistência sistêmica adquirida (SAR) em plantas suscetíveis contra fitopatógenos, foram conduzidos estudos na interação Coffea arabica-Hemileia vastatrix. A indução de atividade de quitinases e b-1,3-glucanases e o envolvimento dessas enzimas na resistência sistêmica adquirida contra H. vastatrix foram avaliados em cafeeiro suscetível cultivar Mundo Novo (MN) após o tratamento com acibenzolar-S-metil (ASM) (200 mg de i.a./mL). O produto induziu aumento local e sistêmico das atividades de quitinases e b-1,3-glucanases nos tecidos foliares, a partir do primeiro e segundo dia da aplicação do indutor, respectivamente. As atividades enzimáticas atingiram níveis máximos de aumento nas plantas tratadas em relação ao controle, sete dias após a aplicação do ASM. Resistências local e sistêmica ao patógeno foram induzidas a partir do primeiro dia após o tratamento com ASM. A proteção e atividades enzimáticas foram detectadas até 35 dias, após aplicação do indutor. A indução de resistência local contra a ferrugem atingiu um nível máximo de 87% entre 7 e 14 dias. Níveis máximos de proteção sistêmica de 53 a 68% foram observados entre 2 e 21 dias após o tratamento de cafeeiro com o indutor. Neste intervalo de tempo foi observado, também, um aumento sistêmico máximo de atividade enzimática. Os resultados sugerem que o aumento de atividade dessas hidrolases está relacionado com a resistência local e sistêmica, induzida por ASM, em cafeeiro MN contra a ferrugem. Genes relacionados à SAR foram identificados em cafeeiro através de hibridização subtrativa por supressão (HSS), a partir de mRNAs isolados de plantas suscetíveis cv. MN, 72 h após o tratamento com ASM (200 mg i.a./mL). Os mecanismos de respostas de defesa associados à SAR ativada em MN foram comparados, através do isolamento de genes por HSS, com a resistência raça-cultivar específica observada no cafeeiro resistente Híbrido de Timor (HT), 72 h após a inoculação com H. vastatrix. Através da HSS, produziram-se duas bibliotecas de cDNAs subtraídas, enriquecidas de fragmentos de genes induzidos em MN pelo ASM (MN-ASM) ou ativados em HT pelo patógeno (HT-Hv). Os genes encontrados estão envolvidos em diversos processos relacionados à resistência contra fitopatógenos como: formação de espécies de oxigênio reativas, resposta de hipersensibilidade, morte celular programada, síntese e transporte de metabólitos antimicrobianos, percepção e transdução de sinal, síntese de proteínas relacionadas à patogênese, metabolismo de lipídeos e degradação controlada de proteínas. Foi identificado em HT-Hv um número maior de genes implicados em mecanismos de defesa (22%), do que em MN-ASM (16%). Na interação HT-Hv foi detectado um número maior de genes implicados na percepção e transdução de sinal (44%), do que em MN-ASM (30%). Entretanto, o número de genes codificadores de proteínas antimicrobianas foi maior no MN com resistência induzida (22%), do que no cafeeiro resistente HT inoculado com o patógeno (6%). Foram isolados de HT-Hv e MN-ASM, genes codificadores de b-1,3-glucanases e as seqüências completas puderam ser determinadas através da técnica RACE. Os resultados obtidos sugerem que a resistência em HT-Hv e MN-ASM ocorre através de mecanismos distintos. / Studies on the interaction Coffea arabica-Hemileia vastatrix were performed in order to contribute to the elucidation of biochemical and molecular mechanisms involved in systemic acquired resistance (SAR) developed in susceptible plants against pathogens. Induction of chitinase and b-1,3-glucanase activities and their involvement in systemic acquired resistance against H. vastatrix were evaluated in susceptible coffee plants cultivar "Mundo Novo" (MN) after treatment with acibenzolar-S-methyl (ASM) (200 mg a.i./mL). The product induced local and systemic increases in chitinase and b-1,3-glucanase activities in leaf tissues, starting from the first and second days after inducer application, respectively. The increases in enzymatic activity reached their maximum levels in treated plants compared to control seven days after application of ASM. Induction of local and systemic resistance against pathogen was detected one day after ASM treatment. Protection and increases in enzyme activities were detected up to 35 days after product application. Induction of local resistance against coffee leaf rust reached a highest level of 87% between 7 and 14 days. Highest levels of systemic protection ranging from 53% to 68% were observed in coffee plants between 2 and 21 days after inducer treatment. During the same time frame maximum increases in systemic enzymatic activity were also observed. Results suggest that the increases in these hydrolase activities were correlated with the local and systemic resistance induced by ASM in coffee plants against coffee leaf rust. Genes related to SAR were identified in coffee plants by suppression subtractive hybridization (SSH), from mRNA isolated from susceptible plants cv. MN 72 h after treatment with ASM (200 mg a.i./mL). The mechanisms of defense responses associated with SAR activated in MN were compared through the isolation of genes by SSH, with the race-specific resistance observed in the resistant coffee plant "Híbrido de Timor" (HT) 72 h after the inoculation with H. vastatrix. By SSH technique two subtracted cDNA libraries were constructed enriched for gene fragments induced in MN by ASM (MN-ASM) or activated in HT by pathogen infection (HT-Hv). The isolated genes were involved in different processes related to resistance against pathogens, such as: production of active oxygen species, hypersensitive response, programmed cell death, synthesis and transport of antimicrobial metabolites, signal perception and transduction, synthesis of pathogenesis-related proteins, lipid metabolism and selective degradation of proteins. It was identified in HT-Hv a higher number of defense-related genes (22 %) than in MN-ASM (16 %). The incompatible interaction HT-Hv showed a higher number of genes implicated in the signal perception and transduction (44 %) than MN-ASM (30 %). However, the number of genes encoding antimicrobial proteins was higher in the susceptible cultivar MN with induced resistance (22 %) than in the resistant coffee plant HT inoculated with the incompatible pathogen (6 %). Genes encoding b-1,3-glucanases were isolated from HT-Hv and MN-ASM and their complete sequences could be obtained by RACE procedure. Results suggest that distinct recognition events and defense pathways are involved in the expression of resistance in HT-Hv and MN-ASM.