L’overespressione dei geni EVI1(3q26) e PRDM16(1p36), è descritta sia in presenza che in assenza di riarrangiamenti 3q26 e 1p36 in specifici sottogruppi citogenetici di LAM, ed è associata ad una prognosi sfavorevole. Lo scopo principale del nostro studio è stato identificare e caratterizzare tramite FISH e RQ-PCR, alterazioni di EVI1 e PRDM16 in pazienti con alterazioni cromosomiche 3q e 1p.Riarrangiamenti di EVI1 si associavano ad alterazioni cromosomiche 3q26, ma, in 6 casi (6/35;17,1%) erano presenti in assenza di coinvolgimenti, in citogenetica convenzionale, della regione 3q26, a causa di meccanismi complessi e/o alterazioni ‘criptiche’. Inoltre, abbiamo identificato quattro nuovi riarrangiamenti di EVI1, tra cui due nuove traslocazioni simili presenti in due fratelli. Riarrangiamenti e/o amplificazioni di PRDM16 erano spesso associate ad alterazioni 1p36 (7/14;50%). L’analisi di EVI1 e PRDM16 è stata estesa ad altri casi con alterazioni -7/7q-, con cariotipo normale, con alterazioni 3q per PRDM16 e con alterazioni 1p per EVI1. L’overespressione di EVI1 era presente solo nel gruppo -7/7q- (10/58;17.2%) ed in un caso si associava ad amplificazione genica, mentre PRDM16 era overespresso in casi di tutti i gruppi analizzati,sia con cariotipi complessi, dove si associava in alcuni casi ad amplificazione genica, sia con cariotipi normali o con singole alterazioni. Il nostro studio dimostra come la FISH permetta di identificare alterazioni dei geni EVI1 e PRDM16, anche in assenza di coinvolgimenti delle regioni 3q26 e 1p36. Riarrangiamenti complessi e/o una scarsa qualità dei preparati citogenetici sono le cause principali per la mancata identificazione di queste alterazioni. La RQ-PCR permette di identificare l’overespressione anche nei casi in cui non sia dovuta ad alterazioni citogenetiche. È importante confermare con FISH e/o RQ-PCR il coinvolgimento di questi due geni, per individuare alla diagnosi pazienti con prognosi sfavorevole e che potranno beneficiare di terapie maggiormente aggressive e/o di trapianto allogenico di cellule staminali. / EVI1 and PRDM16 overexpression has been associated with poor prognosis in myeloid malignancies. The main mechanism is the rearrangement of chromosome bands 3q26 and 1p36, where they are mapped, respectively. Overexpression has also been reported in specific cytogenetic subgroups, without 3q26 and 1p36 abnormalities observable by chromosome banding analysis (CBA). The main aim of this study has been to identify and characterize EVI1 and PRDM16 rearrangements in cases with 3q and 1p cytogenetic abnormalities. EVI1 rearrangements were mainly associated with 3q26 cytogenetic abnormalities, but they have also been demonstrated in 6 cases (6/35;17,1%) without 3q26 cytogenetic involvement, because of complex mechanism and/or ‘cryptic‘ abnormalities. We have also identified new EVI1 rearrangements. Interestingly, two new similar translocations appeared in two brothers. Rearrangements, but also amplifications of PRDM16 resulting in gene overexpression, have often been associated with 1p36 aberrations. EVI1 and PRDM16 analyses have been performed in others cytogenetics subgroups, such as: -7/7q-, normal karyotype, and 3q abnormalities for PRDM16 and 1p for EVI1. EVI1 overexpression was frequent only in -7/7q- group (17.2%;10/58), and in one case was associated with amplification, not seen by CBA, because of metaphases’ poor quality. On the contrary, PRDM16 overexpression has been found in all cytogenetic subgroups, that we have considered. In some cases with complex karyotype, PRDM16 overexpression has been associated with gene amplification. FISH analysis and RQ-PCR have allowed us to identify EVI1 and PRDM16 abnormalities in patients with or without 3q26 and 1p36 abnormalities. Complex rearrangements or metaphases’ poor quality were the main reasons for the failed detection of these abnormalities in CBA. These observations indicate the importance of screening for EVI1 and PRDM16 abnormalities, especially in cases with 3q and 1p cytogenetic abnormalities, to identify at diagnosis patients with poor prognosis that could benefit from more aggressive chemotherapy and/or stem cell transplantation.

Sia nei tumori solidi che nelle neoplasie ematologiche, è stato dimostrato che alcuni agenti chemioterapici, come le antracicline, sono altamente immunogenici e determinano, attraverso le cellule dendritiche (DCs), un’efficiente attivazione della risposta antitumorale mediata dalle cellule T. Tale processo, caratterizzato dalla traslocazione della calreticulina e delle HSPs 70/90 sulla superficie cellulare delle cellule tumorali e dal rilascio di HMGB1 e di ATP, è detto morte cellulare immunogenica (ICD). Oltra alla ICD, però, la chemioterapia genera fenomeni infiammatori nel microambiente tumorale e attiva pathway immunosoppressivi a carico delle DCs, che potrebbero alterare la risposta immunitaria. Scopo del presente studio è stato caratterizzare la ICD indotta da antracicline nella leucemia acuta mieloide (LAM) e valutare l’induzione di pathway inibitori, come l’enzima indoleamina-2,3-diossigenasi (IDO1). In vitro, ex vivo ed in vivo abbiamo dimostrato che il trattamento con antracicline induce ICD anche nella LAM. Nei pazienti sottoposti a chemioterapia è stata riscontrata una risposta anti-leucemica caratterizzata dalla produzione di IFN- nei linfociti CD4+ e CD8+, capaci di uccidere i blasti autologhi pur mostrando un fenotipo exhausted, ma anche l’espansione di una popolazione di linfociti T regolatori. La ICD infatti determina la maturazione delle DCs, che attivano efficacemente linfociti T antigene-specifici ma, allo stesso tempo, esprimendo elevati livelli di IDO1, inducono linfociti T regolatori che limitano la risposta anti-leucemica. Questi risultati sono stati confermati nel modello murino leucemico dove, a seguito della chemioterapia, l’infiltrato tumorale è arricchito di DCs, mature esprimenti IDO1, ma anche di linfociti T caratterizzati da fenotipo exhausted. I nostri dati confermano che la ICD, attiva anche nella LAM, determina una risposta immunitaria efficace nei confronti della malattia ma anche l’attivazione di pathway inibitori nelle DCs che alterano tale risposta. La combinazione della chemioterapia con inibitori di IDO1 rappresenterebbe un approccio interessante per potenziare l'effetto immunogenico della chemioterapia e la risposta anti-leucemica. / Recently, both in solid tumors and haematological malignancies, it has been shown that some chemotherapeutic agents, such as daunorubicin, are highly immunogenic and activate the immune response via cross-priming of anti-tumor T cells by dendritic cells (DCs). Such process, known as immunogenic cell death (ICD), is characterized by tumor cells modifications, such as cell surface translocation of calreticulin and heat shock proteins, extracellular release of ATP and pro-inflammatory factor HMGB1. Alongside with ICD, chemotherapy is known to induce inflammatory modifications within tumor microenvironment, which may also elicit immunosuppressive pathways. In particular, DCs may be driven to acquire tolerogenic features, which may ultimately hamper anti-tumor T-cells. Aim of this study is to characterize ICD in acute myeloid leukemia (AML) and to evaluate the involvement of some DC-related inhibitory pathways, such as indoleamine-2,3-dioxygenase 1 (IDO1) expression. In vitro, ex vivo and in vivo we demonstrated that daunorubicin treatment induced ICD in AML. Ex vivo, T-cell monitoring of daunorubicin-treated AML patients displayed an increase in leukemia-specific IFN--producing CD4+ and CD8+ T cells, which were capable to kill autologous blasts but showed an exhausted phenotype. We also observed the expansion of regulatory T cells (Tregs). ICD, in fact, induced maturation of DCs which efficiently activate antigen-specific T lymphocytes but simultaneously express high levels of IDO1, inducing a population of Tregs which inhibit the anti-leukemia response. These results were confirmed in leukemic murine model where daunorubicin treatment resulted in increased maturation status of tumor infiltrating DCs expressing IDO1, but also in an increased infiltration of exhausted T lymphocytes. Our data confirm that ICD is active in AML and results in an immunological response against AML but also in the induction of inhibitory pathway. The combination of chemotherapy with IDO1 inhibitors represents an interesting approach to enhance the immunogenic effect of chemotherapy and anti-leukemic immune response.

The present work reports the outcome of the GIMEMA CML WP study CML0811, an independent trial investigating nilotinib as front-line treatment in chronic phase chronic myeloid leukemia (CML). Moreover, the results of the proteomic analysis of the CD34+ cells collected at CML diagnosis, compared to the counterpart from healthy donors, are reported. Our study confirmed that nilotinib is highly effective in the prevention of the progression to accelerated/blast phase, a condition that today is still associated with high mortality rates. Despite the relatively short follow-up, cardiovascular issues, particularly atherosclerotic adverse events (AE), have emerged, and the frequency of these AEs may counterbalance the anti-leukemic efficacy. The deep molecular response rates in our study compare favorably to those obtained with imatinib, in historic cohorts, and confirm the findings of the Company-sponsored ENESTnd study. Considering the increasing rates of deep MR over time we observed, a significant proportion of patients will be candidate to treatment discontinuation in the next years, with higher probability of remaining disease-free in the long term. The presence of the additional and complex changes we found at the proteomic level in CML CD34+ cells should be taken into account for the investigation on novel targeted therapies, aimed at the eradication of the disease.

Solid organ transplantation (SOT) is considered the treatment of choice for many end-stage organ diseases. Thus far, short term results are excellent, with patient survival rates greater than 90% one year post-surgery, but there are several problems with the long term acceptance and use of immunosuppressive drugs. Hematopoietic Stem Cells Transplantation (HSCT) concerns the infusion of haematopoietic stem cells to re-establish acquired and congenital disorders of the hematopoietic system. The main side effect is the Graft versus Host Disease (GvHD) where donor T cells can cause pathology involving the damage of host tissues. Patients undergoing acute or chronic GvHD receive immunosuppressive regimen that is responsible for several side effects. The use of immunosuppressive drugs in the setting of SOT and GvHD has markedly reduced the incidence of acute rejection and the tissue damage in GvHD however, the numerous adverse side effects observed boost the development of alternative strategies to improve the long-term outcome. To this effect, the use of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells (Treg) as a cellular therapy is an attractive approach for autoimmunity disease, GvHD and limiting immune responses to allograft after transplantation. Treg have a pivotal role in maintaining peripheral immunological tolerance, by preventing autoimmunity and chronic inflammation. Results of my thesis provide the characterization and cell processing of Tregs from healthy controls and patients in waiting list for liver transplantation, followed by the development of an efficient expansion-protocol and the investigation of the impact of the main immunosuppressive drugs on viability, proliferative capacity and function of expanded cells after expansion. The conclusion is that ex vivo expansion is necessary to infuse a high Treg dose and although many other factors in vivo can contribute to the success of Treg therapy, the infusion of Tregs during the administration of the highest dose of immunosuppressants should be carefully considered.

Due to inadequate treatments, the survival rate of adult patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) is still very poor. Thus there is a need to improve the efficacy of conventional therapy. In this study we evaluated the effectiveness of checkpoint kinase inhibitors (Chk-i) in single agent and in combination with different compounds conventionally used for the treatment of B-/T-ALL. We showed that Chk1 and Chk2 kinases are highly expressed and hyper-activated in tumor samples in comparison to normal tissue. On these bases we speculate that the inhibition of these kinases could mine the genetic stability and enhance cell death in ALL cells. We firstly evaluate the efficacy in single agent of the Chk1/Chk2 (PF-0477736 and LY2606368) and of the Wee1 (MK-1775) inhibitors on different cell lines and on primary cells isolated from adult B-ALL patients. We demonstrated that the inhibition of Chk1/Chk2 kinases reduces of the cell viability, activates the apoptosis and modify the expression of different elements of the G2/M checkpoint. To assess the chemo-sensitizer activity of different checkpoint kinase inhibitors, several combination studies were performed. To this purpose, LY2606368 and MK-1775 were combined with different tyrosine kinase inhibitors (imatinb, dasatinib and bosutinib) and with the purine nucleoside analogue, clofarabine. The efficacy of the combinations was not only evaluated in term of reduction of the cell viability but also in term of induction of apoptosis and induction of DNA damages. The results found were then confirmed on primary cells of B-ALL patients. Finally different class of checkpoint kinase inhibitors were combined together in order to evaluate their interaction. In our opinion the preclinical data presented in this study are the basis for a future evaluation of this class of compound in clinical trials in the treatment of adult ALL patients.

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La letteratura scientifica degli ultimi anni si è arricchita di un numero sempre crescente di studi volti a chiarire i meccanismi che presiedono ai processi di homing di cellule staminali emopoietiche e del loro attecchimento a lungo termine nel midollo osseo. Tali fenomeni sembrano coinvolgere da un lato, l’interazione delle cellule staminali emopoietiche con la complessa architettura e componente cellulare midollare, e dall’altro la riposta ad un’ampia gamma di molecole regolatrici, tra le quali chemochine, citochine, molecole di adesione, enzimi proteolitici e mediatori non peptidici. Fanno parte di quest’ultimo gruppo anche i nucleotidi extracellulari, un gruppo di molecole-segnale recentemente caratterizzate come mediatori di numerose risposte biologiche, tra le quali l’allestimento di fenomeni flogistici e chemiotattici. Nel presente studio è stata investigata la capacità dei nucleotidi extracellulari ATP ed UTP di promuovere, in associazione alla chemochina CXCL12, la migrazione di cellule staminali umane CD34+. E’ così emerso che la stimolazione con UTP è in grado di incrementare significativamente la migrazione dei progenitori emopoietici in risposta al gradiente chemioattrattivo di CXCL12, nonché la loro capacità adesiva. Le analisi citofluorimetriche condotte su cellule migranti sembrano inoltre suggerire che l’UTP agisca interferendo con le dinamiche di internalizzazione del recettore CXCR4, rendendo così le cellule CD34+ maggiormente responsive, e per tempi più lunghi, al gradiente attrattivo del CXCL12. Saggi di homing competitivo in vivo hanno parallelamente mostrato, in topi NOD/SCID, che la stimolazione con UTP aumenta significativamente la capacità dei progenitori emopoeitci umani di localizzarsi a livello midollare. Sono state inoltre indagate alcune possibili vie di trasduzione del segnale attivate dalla stimolazione di recettori P2Y con UTP. Esperimenti di inibizione in presenza della tossina della Pertosse hanno evidenziato il coinvolgimento di proteine Gαi nella migrazione dipendente da CXCL12 ed UTP. Ulteriori indicazioni sono provenute dall’analisi del profilo trascrizionale di cellule staminali CD34+ stimolate con UTP, con CXCL12 o con entrambi i fattori contemporaneamente. Da questa analisi è emerso il ruolo di proteine della famiglia delle Rho GTPasi e di loro effettori a valle (ROCK 1 e ROCK 2) nel promuovere la migrazione UTP-dipendente. Questi dati sono stati confermati successivamente in vitro mediante esperimenti con Tossina B di C. Difficile (un inibitore delle Rho GTPasi) e con Y27632 (in grado di inibire specificatamente le cinasi ROCK). Nel complesso, i dati emersi in questo studio dimostrano la capacità del nucleotide extracellulare UTP di modulare la migrazione in vitro di progenitori emopoietici umani, nonché il loro homing midollare in vivo. L’effetto dell’UTP su questi fenomeni si esplica in concerto con la chemochina CXCL12, attraverso l’attivazione concertata di vie di trasduzione del segnale almeno parzialmente condivise da CXCR4 e recettori P2Y e attraverso il reclutamento comune di proteine ad attività GTPasica, tra le quali le proteine Gαi e i membri della famiglia delle Rho GTPasi.

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