Les premières cellules progénitrices lympho-myéloïdes (LMPP) entrent dans le thymus et commencent leur processus de différenciation au stade double négatif (DN, CD4-CD8-). Après un réarrangement fonctionnel de la chaine bêta de leur récepteur des cellules T (RCT), les cellules reçoivent des signaux de différenciation, de prolifération, de survie et de sélection et passent au stade double positif (DP, CD4+CD8+). Ensuite, la chaine alpha du RCT est réarrangée et testée via les sélections positive et négative. Si le RCT reçoit un signal ni trop fort, ni trop faible, les cellules passent au stade simple positif où elles exprimeront soit la molécule CD4 ou CD8. ERK3, une MAPK non-conventionnelle, joue un rôle important dans le développement thymique. Des études précédentes ont démontré qu’une déficience en ERK3 diminue de 50 % la cellularité thymique et de 75% le nombre de cellules simples positives CD4 (CD4SP). Nous avons posé comme hypothèses qu’il y a une augmentation de l’apoptose chez les thymocytes DP de souris Erk3-/- et que cette déficience chez les thymocytes DP affecterait la sélection positive des cellules DP, réduisant ainsi le nombre de thymocytes CD4SP. Afin de vérifier la première hypothèse, nous avons regardé les niveaux d’apoptose grâce à la cytométrie en flux et par immunohistochimie. Dans les deux cas, nous étions incapables de détecter une différence du niveau d’apoptose chez les thymocytes DP entre les souris Erk3+/+ et Erk3-/-. Ensuite, nous nous sommes posés la question suivante : La demi-vie des thymocytes DP Erk3-/- était-elle plus courte que le type sauvage? La demi-vie des thymocytes DP a été mesurée à l’aide de l’étude des réarrangements secondaires de la chaine alpha du RCT par PCR semi-quantitatif et à l’aide de cultures de thymus fœtaux. En effet, ERK3 semble important pour prolonger la demi-vie des thymocytes DP. Ensuite, nous avons utilisé des marqueurs cellulaires différentiels (CD69, CD5 et RCT) pour regarder si les thymocytes DP sont capables de passer la sélection positive. En effet, il y a moins de thymocytes DP Erk3-/- qui sont CD69fort, CD5fort et RCTfort. Finalement, nous voulons savoir si les fonctions de ERK3 passent par MK5, son seul partenaire d’interaction connu à ce jour. Après la caractérisation du thymus de la souris Mk5-/-, nous observons que seulement la réduction du nombre de thymocytes CD4SP est identique à celle des thymocytes CD4SP de la souris Erk3-/-. En conclusion, ces résultats révèlent des fonctions importantes pour la molécule ERK3 lors du processus de sélection positive, le maintient de la demi-vie des thymocytes DP et lors de la régulation de développement thymique de manière MK5-dépendante et -indépendante. / Early thymic progenitor cells (ETP) enter the thymus and begin their differentiation process at the double negative (DN) stage, having no CD4 and CD8 expression. After a functional rearrangement of the beta chain of the T-cell receptor (TCR), the cells receive differentiation, proliferation, survival, and selection signals and pass to the double positive (DP) stage and acquire the expression of CD4 and CD8 molecules. Then, the TCR alpha chain is rearranged and the fully composed TCR is tested through positive and negative selection. If the TCR receives a signal that is just right (not too strong or too weak), the cells pass to the single-positive stage by acquiring either the CD4 or CD8 molecule. ERK3, an unconventional MAPK, plays an important role in thymic development. Previous studies have shown that a deficiency in ERK3 decreases by 50% the total thymic cellularity and by 75% the number of CD4 single- positive cells (CD4SP). We hypothesized that there is an increase in apoptosis in DP thymocytes of Erk3-/- mice for and that this deficiency would affect the positive selection of DP cells, resulting in a reduced number of CD4SP. To test the first hypothesis, we looked at apoptosis levels by flow cytometry and immunohistochemistry. In both cases, we were unable to detect a difference in the level of apoptosis in DP thymocytes from Erk3+/+ and Erk3-/- mice. We then made a second assumption, that the half-life of Erk3-/- DP thymocytes for was shorter, which was measured by secondary rearrangements of the RCT alpha chain by semi-quantitative PCR and cultures of fetal thymi. Indeed, ERK3 seems important to extend the half- life of DP thymocytes. Next, we used differential cell markers (CD69, CD5, and TCR) to see if the DP thymocytes are able to pass positive selection. Indeed, there are less DP thymocytes Erk3-/- that are CD69hi, CD5hi, and TCRhi. Finally, we wanted to know whether the functions of ERK3 passes through MK5, its only interacting partner known to date. After characterization of the thymus of Mk5-/- mice, we observe that only the reduction of CD4SP thymocytes is identical to that of CD4SP thymocytes of Erk3-/-mice. In conclusion, these results reveal important functions for the molecule ERK3 for maintaining the half-life of DP thymocytes, for the process of positive selection and for regulating T-cell development in a MK5-dependent and - independent manner.

Les MAP kinases sont des enzymes essentielles impliquées dans 7 voies de signalisation distinctes qui permettent à la cellule de répondre de manière adéquate aux stimuli extra-cellulaires. Chez les mammifères, les MAP kinases les mieux caractérisées sont Erk1/2, Jnk, p38 et Erk5. Ces enzymes jouent un rôle important dans l’embryogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire ainsi que dans la réponse au stress. Erk4 est un membre atypique de la famille MAP kinase. D’une part, la boucle d’activation de Erk4 possède un motif SEG au lieu du motif TXY, très conservé chez les MAP kinases. D’autre part, Erk4 possède une extension en C-terminal du domaine kinase qui n’est pas présente chez les MAP kinases classiques. Jusqu’à présent aucune fonction n’a été attribuée à Erk4. De plus, la voie de signalisation ainsi que le mode de régulation conduisant à l’activation de Erk4 ne sont pas connus. Le seul substrat de Erk4 identifié jusqu’à maintenant est la MAPKAP kinase MK5. L’impact fonctionnel de cette interaction n’est également pas connu. Afin d’en apprendre davantage sur la MAP kinase atypique Erk4, nous avons étudié le mécanisme d’activation de cette kinase ainsi que sa fonction physiologique par une approche de délétion génique chez la souris. En ce qui concerne l’activation de Erk4, nous avons montré que la boucle d’activation de Erk4 (S186EG) est constitutivement phosphorylée in vivo et que cette phosphorylation n’est pas modulée par les stimuli classiques des MAP kinases dont le sérum et le sorbitol. Cependant, nous avons observé que la phosphorylation de la S186 augmente en présence de MK5 et que cette augmentation est indépendante de l’activité kinase de l’une ou l’autre de ces kinases. De plus, nous avons établi que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 est requise pour l’interaction stable entre Erk4 et MK5 ainsi que pour l’activation, et la relocalisation cytoplasmique de MK5. Ainsi, notre étude a permis de révéler que Erk4 est régulée de manière différente des MAP kinases classiques et que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité de MK5. Parallèlement, nos résultats mettent en évidence l’existence d’une “Erk4 kinase”, dont le recrutement et/ou l’activation semble être facilité par MK5. Afin identifier la fonction physiologique de Erk4, nous avons généré des souris Erk4-déficientes. L’inactivation génique de Erk4 est viable et les souris ne présentent aucune anomalie apparente. Dans le but d’expliquer l’absence de phénotype, nous avons regardé si l’expression de Erk3, le paralogue de Erk4, pouvait compenser la perte de Erk4. Notre analyse a révélé que l’expression de Erk3 dans les souris Erk4-/- n’augmente pas au cours du développement embryonnaire ou dans les tissus adultes afin de compenser pour la perte de Erk4. Par la suite, nous avons adressé la question de redondance entre Erk4 et Erk3. Dans notre laboratoire, les souris Erk3-déficientes ont également été générées et le phénotype de ces souris a récemment été analysé. Cette étude a révélé que l’inactivation génique de Erk3 entraîne un retard de croissance intra-utérin, un défaut de maturation pulmonaire et la mort néo-natale des souriceaux. Nous avons donc regardé la contribution de Erk4 dans ces phénotypes. L’analyse des souris Erk4-/- a révélé que l’inactivation de Erk4 n’entraîne pas de retard de croissance ou de maturation du poumon. De plus, nous avons montré que l’inactivation additionnelle de Erk4 dans les souris Erk3-/- n’accentue pas le phénotype des souris Erk3-déficientes. Ainsi, notre étude a révélé que contrairement à Erk3, Erk4 n’est pas essentielle au développement murin dans des conditions physiologiques. Parallèlement, nous avons montré que Erk4 et Erk3 possèdent des fonctions non-redondantes in vivo. / MAP kinases are essential enzymes implicated in 7 distinct signaling pathways that allow cells to respond appropriately to extracellular stimuli. In mammals, Erk1/2, Jnk, p38 and Erk5 are the best characterized MAP kinases. These enzymes play important roles in embryogenesis, cell proliferation and differentiation and in response to cellular stresses. Erk4 is an atypical member of the MAP kinase family. First, its activation loop is composed of an SEG motif instead of the well conserved TXY motif found in MAP kinases. Second, Erk4 has a C-terminal extension following the kinase domain that is not present in classical MAP kinases. Despite its identification more than a decade ago, the function of Erk4 remains elusive. Moreover, the signaling pathway as well as the regulatory mechanism leading to Erk4 activation in still uncharacterized. The only identified substrate of Erk4 is the MAPKAP kinase MK5, but the functional relevance of this interaction is still unknown. To gain information about the atypical MAP kinase Erk4, we decided to study the activation mechanism of Erk4 and its physiological function using a gene targeted deletion approach in mice. Regarding the activation of Erk4, we showed that the activation loop of Erk4 (S186EG) is constitutively phosphosphorylated in vivo and that this phosphorylation is not modulated by classical MAP kinase stimuli such as serum and sorbitol. However, we observed that phosphorylation of S186 increases in the presence of MK5 and we showed that this increase is independent of the kinase activity of either kinases. Moreover, we established that phosphorylation of Erk4 activation loop is required for the stable interaction between Erk4 and MK5 as well as for the activation and cytoplasmic relocalisation of MK5. Thus, our study reveals that Erk4 is differently regulated than classical MAP kinases and that Erk4 activation loop phosphorylation is important for its role in the regulation of MK5 activity. In parallel, our results revealed the existence of an “Erk4 kinase” whose recruitment and/or activation seems to be facilitated by MK5. To gain information about the physiological function of Erk4 we generated Erk4 deficient mice. Gene-targeted inactivation of Erk4 is viable and these mice present no gross abnormality. To explain the absence of phenotype, we analyzed the expression of Erk3, the paralog of Erk4, to determine if it could compensate for the loss of Erk4. Our analysis revealed that Erk3 expression in Erk4-/- mice is not up-regulated during embryogenesis nor in adult mice tissues in order to compensate for the loss of Erk4. We next addressed the question of redundancy between Erk4 and Erk3. In our laboratory, Erk3-/- deficient mice were also generated and the phenotype of these mice was recently analyzed. This study revealed that gene inactivation of Erk3 leads to intra-uterine growth retardation, lung maturation defect and neo-natal lethality. We then investigated the contribution of Erk4 in these phenotypes. The analysis of Erk4-/- mice revealed that inactivation of Erk4 did not delay intra-uterine growth nor cause pulmonary maturation defect. Moreover, we showed that additional loss of Erk4 in Erk3-/-mice does not accentuate Erk3-deficient mice phenotype. Thus, this study reveals that, contrary to Erk3, Erk4 is dispensable for mice development under normal condition and that Erk4 and Erk3 have non-redundant functions in vivo.

La division cellulaire est influencée par les différents stimuli provenant de l’extérieur ou de l’intérieur de la cellule. Plusieurs réseaux enzymatiques élaborés au cours de l’évolution relayent l’information générée par ces signaux. Les modules MAP kinases sont extrêmement importants au sein de la cellule. Chez l’humain, 14 MAP kinases sont regroupées en sept voies distinctes intervenant dans le contrôle d’une myriade de processus cellulaires. ERK3/4 sont des homologues de ERK1/2 pour lesquelles on ne connaît que très peu de choses concernant leurs fonctions et régulation. Ces MAP kinases sont dites atypiques puisqu’elles ont des particularités structurales et des modes de régulation qui diffèrent des autres MAP kinases classiques. Ainsi, notre laboratoire a démontré que l’activité de ERK3 est régulée par le système ubiquitine-protéasome et qu’elle pourrait avoir un rôle à jouer dans le contrôle de la différenciation et la prolifération cellulaire. La première étude présentée décrit la régulation de ERK3 au cours du cycle cellulaire. Nous avons observé que ERK3 est hyperphosphorylée et s’accumule spécifiquement au cours de la mitose. Des analyses de spectrométrie de masse ont mené à l’identification de quatre sites de phosphorylation situés à l’extrémité du domaine C-terminal. Nous avons pu démontrer que la kinase mitotique CDK1/cycline B phosphoryle ces sites et que les phosphatases CDC14A et CDC14B les déphosphorylent. Finalement, nous démontrons que la phosphorylation mitotique de ERK3 a pour effet de la stabiliser. Au début de mes études doctorales, la kinase MK5 fut identifiée comme premier partenaire et substrat de ERK3. MK5 a très peu de fonctions connues. Des données dans la littérature suggèrent qu’elle peut moduler le cycle cellulaire dans certaines conditions. Par exemple, MK5 a récemment été identifié comme inducteur de la sénescence induite par l’oncogène Ras. Dans la deuxième étude, nous décrivons une nouvelle fonction de MK5 dans le contrôle du cycle cellulaire. Nous démontrons par des expériences de gain et perte de fonction que MK5 ralentit l’entrée en mitose suite à un arrêt de la réplication. Cette fonction est dépendante de l’activité enzymatique de MK5 qui régule indirectement l’activité de CDK1/cycline B. Finalement, nous avons identifié Cdc25A comme un nouveau substrat in vitro de MK5 dont la surexpression supprime l’effet de MK5 sur l’entrée en mitose. En conclusion, nos résultats décrivent un nouveau mécanisme de régulation de ERK3 au cours de la mitose, ainsi qu’une nouvelle fonction pour MK5 dans le contrôle de l’entrée en mitose en réponse à des stress de la réplication. Ces résultats démontrent pour la première fois l’implication de ces protéines au cours de la transition G2/M. Nos travaux établissent de nouvelles pistes d’études pour mieux comprendre les rôles encore peu définis des kinases ERK3/4-MK5. / The process of cell division is largely influenced by extracellular and intracellular cues. Many enzymatic pathways refined during evolution propagate the information generated by those cues. MAP kinase modules are extremely important within the cells. Human genome encodes 14 MAP kinases genes grouped into seven distinct pathways involved in the control of many cellular processes. ERK3/4 are kinases homologous to ERK1/2. Very little is known about their regulation and molecular functions. These MAP kinases are described as being atypical based on their unique structural characteristics and mode of regulation. Our laboratory was the first to demonstrate that the activity of ERK3 is mainly regulated by the ubiquitin-proteasome system in proliferating cells. In addition, several lines of evidence suggest a role for ERK3 in the control of cell differentiation and proliferation. The first study presented herein documents the regulation of ERK3 during the cell cycle. We observed that ERK3 is hyperphosphorylated and accumulated specifically during mitosis. Mass spectrometry analyses led to the identification of four phosphorylation sites located in the C-terminal domain. We demonstrate that mitotic kinase CDK1/cyclin B phosphorylates these sites which are dephosphorylated by Cdc14A and Cdc14B phosphatases. Finally, we show that mitotic phosphorylation of ERK3 controls its stability. At the beginning of my Ph.D. training, the kinase MK5 was the first identified binding partner and substrate of ERK3. MK5 is implicated in very few cellular functions. Data suggest that under certain conditions it modulates cell cycle progression. For example, MK5 was recently identified as a tumor suppressor gene essential for ras-induced senescence. In the second study of this thesis, we describe a novel function of MK5 in cell cycle progression. Gain and loss of function experiments demonstrate that MK5 delays G2/M transition following replicative stress. This function depends on its catalytic activity to indirectly regulates CDK1/cyclin B. Finally, we identified Cdc25A as a good in vitro substrate for MK5. Interestingly, Cdc25A expression inhibits MK5-induced delay of entry into mitosis. In conclusion, our results described a novel mechanism of regulation of ERK3 during mitosis and a novel function of MK5 in the control of G2/M transition after replicative stress. These data demonstrate for the first time the relation between these kinases and the G2/M transition. Our work should contribute to a better understanding of the roles of ERK3/4-MK5 kinases.

Les MAP kinases sont des enzymes essentielles impliquées dans 7 voies de signalisation distinctes qui permettent à la cellule de répondre de manière adéquate aux stimuli extra-cellulaires. Chez les mammifères, les MAP kinases les mieux caractérisées sont Erk1/2, Jnk, p38 et Erk5. Ces enzymes jouent un rôle important dans l’embryogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire ainsi que dans la réponse au stress. Erk4 est un membre atypique de la famille MAP kinase. D’une part, la boucle d’activation de Erk4 possède un motif SEG au lieu du motif TXY, très conservé chez les MAP kinases. D’autre part, Erk4 possède une extension en C-terminal du domaine kinase qui n’est pas présente chez les MAP kinases classiques. Jusqu’à présent aucune fonction n’a été attribuée à Erk4. De plus, la voie de signalisation ainsi que le mode de régulation conduisant à l’activation de Erk4 ne sont pas connus. Le seul substrat de Erk4 identifié jusqu’à maintenant est la MAPKAP kinase MK5. L’impact fonctionnel de cette interaction n’est également pas connu. Afin d’en apprendre davantage sur la MAP kinase atypique Erk4, nous avons étudié le mécanisme d’activation de cette kinase ainsi que sa fonction physiologique par une approche de délétion génique chez la souris. En ce qui concerne l’activation de Erk4, nous avons montré que la boucle d’activation de Erk4 (S186EG) est constitutivement phosphorylée in vivo et que cette phosphorylation n’est pas modulée par les stimuli classiques des MAP kinases dont le sérum et le sorbitol. Cependant, nous avons observé que la phosphorylation de la S186 augmente en présence de MK5 et que cette augmentation est indépendante de l’activité kinase de l’une ou l’autre de ces kinases. De plus, nous avons établi que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 est requise pour l’interaction stable entre Erk4 et MK5 ainsi que pour l’activation, et la relocalisation cytoplasmique de MK5. Ainsi, notre étude a permis de révéler que Erk4 est régulée de manière différente des MAP kinases classiques et que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité de MK5. Parallèlement, nos résultats mettent en évidence l’existence d’une “Erk4 kinase”, dont le recrutement et/ou l’activation semble être facilité par MK5. Afin identifier la fonction physiologique de Erk4, nous avons généré des souris Erk4-déficientes. L’inactivation génique de Erk4 est viable et les souris ne présentent aucune anomalie apparente. Dans le but d’expliquer l’absence de phénotype, nous avons regardé si l’expression de Erk3, le paralogue de Erk4, pouvait compenser la perte de Erk4. Notre analyse a révélé que l’expression de Erk3 dans les souris Erk4-/- n’augmente pas au cours du développement embryonnaire ou dans les tissus adultes afin de compenser pour la perte de Erk4. Par la suite, nous avons adressé la question de redondance entre Erk4 et Erk3. Dans notre laboratoire, les souris Erk3-déficientes ont également été générées et le phénotype de ces souris a récemment été analysé. Cette étude a révélé que l’inactivation génique de Erk3 entraîne un retard de croissance intra-utérin, un défaut de maturation pulmonaire et la mort néo-natale des souriceaux. Nous avons donc regardé la contribution de Erk4 dans ces phénotypes. L’analyse des souris Erk4-/- a révélé que l’inactivation de Erk4 n’entraîne pas de retard de croissance ou de maturation du poumon. De plus, nous avons montré que l’inactivation additionnelle de Erk4 dans les souris Erk3-/- n’accentue pas le phénotype des souris Erk3-déficientes. Ainsi, notre étude a révélé que contrairement à Erk3, Erk4 n’est pas essentielle au développement murin dans des conditions physiologiques. Parallèlement, nous avons montré que Erk4 et Erk3 possèdent des fonctions non-redondantes in vivo. / MAP kinases are essential enzymes implicated in 7 distinct signaling pathways that allow cells to respond appropriately to extracellular stimuli. In mammals, Erk1/2, Jnk, p38 and Erk5 are the best characterized MAP kinases. These enzymes play important roles in embryogenesis, cell proliferation and differentiation and in response to cellular stresses. Erk4 is an atypical member of the MAP kinase family. First, its activation loop is composed of an SEG motif instead of the well conserved TXY motif found in MAP kinases. Second, Erk4 has a C-terminal extension following the kinase domain that is not present in classical MAP kinases. Despite its identification more than a decade ago, the function of Erk4 remains elusive. Moreover, the signaling pathway as well as the regulatory mechanism leading to Erk4 activation in still uncharacterized. The only identified substrate of Erk4 is the MAPKAP kinase MK5, but the functional relevance of this interaction is still unknown. To gain information about the atypical MAP kinase Erk4, we decided to study the activation mechanism of Erk4 and its physiological function using a gene targeted deletion approach in mice. Regarding the activation of Erk4, we showed that the activation loop of Erk4 (S186EG) is constitutively phosphosphorylated in vivo and that this phosphorylation is not modulated by classical MAP kinase stimuli such as serum and sorbitol. However, we observed that phosphorylation of S186 increases in the presence of MK5 and we showed that this increase is independent of the kinase activity of either kinases. Moreover, we established that phosphorylation of Erk4 activation loop is required for the stable interaction between Erk4 and MK5 as well as for the activation and cytoplasmic relocalisation of MK5. Thus, our study reveals that Erk4 is differently regulated than classical MAP kinases and that Erk4 activation loop phosphorylation is important for its role in the regulation of MK5 activity. In parallel, our results revealed the existence of an “Erk4 kinase” whose recruitment and/or activation seems to be facilitated by MK5. To gain information about the physiological function of Erk4 we generated Erk4 deficient mice. Gene-targeted inactivation of Erk4 is viable and these mice present no gross abnormality. To explain the absence of phenotype, we analyzed the expression of Erk3, the paralog of Erk4, to determine if it could compensate for the loss of Erk4. Our analysis revealed that Erk3 expression in Erk4-/- mice is not up-regulated during embryogenesis nor in adult mice tissues in order to compensate for the loss of Erk4. We next addressed the question of redundancy between Erk4 and Erk3. In our laboratory, Erk3-/- deficient mice were also generated and the phenotype of these mice was recently analyzed. This study revealed that gene inactivation of Erk3 leads to intra-uterine growth retardation, lung maturation defect and neo-natal lethality. We then investigated the contribution of Erk4 in these phenotypes. The analysis of Erk4-/- mice revealed that inactivation of Erk4 did not delay intra-uterine growth nor cause pulmonary maturation defect. Moreover, we showed that additional loss of Erk4 in Erk3-/-mice does not accentuate Erk3-deficient mice phenotype. Thus, this study reveals that, contrary to Erk3, Erk4 is dispensable for mice development under normal condition and that Erk4 and Erk3 have non-redundant functions in vivo.

La division cellulaire est influencée par les différents stimuli provenant de l’extérieur ou de l’intérieur de la cellule. Plusieurs réseaux enzymatiques élaborés au cours de l’évolution relayent l’information générée par ces signaux. Les modules MAP kinases sont extrêmement importants au sein de la cellule. Chez l’humain, 14 MAP kinases sont regroupées en sept voies distinctes intervenant dans le contrôle d’une myriade de processus cellulaires. ERK3/4 sont des homologues de ERK1/2 pour lesquelles on ne connaît que très peu de choses concernant leurs fonctions et régulation. Ces MAP kinases sont dites atypiques puisqu’elles ont des particularités structurales et des modes de régulation qui diffèrent des autres MAP kinases classiques. Ainsi, notre laboratoire a démontré que l’activité de ERK3 est régulée par le système ubiquitine-protéasome et qu’elle pourrait avoir un rôle à jouer dans le contrôle de la différenciation et la prolifération cellulaire. La première étude présentée décrit la régulation de ERK3 au cours du cycle cellulaire. Nous avons observé que ERK3 est hyperphosphorylée et s’accumule spécifiquement au cours de la mitose. Des analyses de spectrométrie de masse ont mené à l’identification de quatre sites de phosphorylation situés à l’extrémité du domaine C-terminal. Nous avons pu démontrer que la kinase mitotique CDK1/cycline B phosphoryle ces sites et que les phosphatases CDC14A et CDC14B les déphosphorylent. Finalement, nous démontrons que la phosphorylation mitotique de ERK3 a pour effet de la stabiliser. Au début de mes études doctorales, la kinase MK5 fut identifiée comme premier partenaire et substrat de ERK3. MK5 a très peu de fonctions connues. Des données dans la littérature suggèrent qu’elle peut moduler le cycle cellulaire dans certaines conditions. Par exemple, MK5 a récemment été identifié comme inducteur de la sénescence induite par l’oncogène Ras. Dans la deuxième étude, nous décrivons une nouvelle fonction de MK5 dans le contrôle du cycle cellulaire. Nous démontrons par des expériences de gain et perte de fonction que MK5 ralentit l’entrée en mitose suite à un arrêt de la réplication. Cette fonction est dépendante de l’activité enzymatique de MK5 qui régule indirectement l’activité de CDK1/cycline B. Finalement, nous avons identifié Cdc25A comme un nouveau substrat in vitro de MK5 dont la surexpression supprime l’effet de MK5 sur l’entrée en mitose. En conclusion, nos résultats décrivent un nouveau mécanisme de régulation de ERK3 au cours de la mitose, ainsi qu’une nouvelle fonction pour MK5 dans le contrôle de l’entrée en mitose en réponse à des stress de la réplication. Ces résultats démontrent pour la première fois l’implication de ces protéines au cours de la transition G2/M. Nos travaux établissent de nouvelles pistes d’études pour mieux comprendre les rôles encore peu définis des kinases ERK3/4-MK5. / The process of cell division is largely influenced by extracellular and intracellular cues. Many enzymatic pathways refined during evolution propagate the information generated by those cues. MAP kinase modules are extremely important within the cells. Human genome encodes 14 MAP kinases genes grouped into seven distinct pathways involved in the control of many cellular processes. ERK3/4 are kinases homologous to ERK1/2. Very little is known about their regulation and molecular functions. These MAP kinases are described as being atypical based on their unique structural characteristics and mode of regulation. Our laboratory was the first to demonstrate that the activity of ERK3 is mainly regulated by the ubiquitin-proteasome system in proliferating cells. In addition, several lines of evidence suggest a role for ERK3 in the control of cell differentiation and proliferation. The first study presented herein documents the regulation of ERK3 during the cell cycle. We observed that ERK3 is hyperphosphorylated and accumulated specifically during mitosis. Mass spectrometry analyses led to the identification of four phosphorylation sites located in the C-terminal domain. We demonstrate that mitotic kinase CDK1/cyclin B phosphorylates these sites which are dephosphorylated by Cdc14A and Cdc14B phosphatases. Finally, we show that mitotic phosphorylation of ERK3 controls its stability. At the beginning of my Ph.D. training, the kinase MK5 was the first identified binding partner and substrate of ERK3. MK5 is implicated in very few cellular functions. Data suggest that under certain conditions it modulates cell cycle progression. For example, MK5 was recently identified as a tumor suppressor gene essential for ras-induced senescence. In the second study of this thesis, we describe a novel function of MK5 in cell cycle progression. Gain and loss of function experiments demonstrate that MK5 delays G2/M transition following replicative stress. This function depends on its catalytic activity to indirectly regulates CDK1/cyclin B. Finally, we identified Cdc25A as a good in vitro substrate for MK5. Interestingly, Cdc25A expression inhibits MK5-induced delay of entry into mitosis. In conclusion, our results described a novel mechanism of regulation of ERK3 during mitosis and a novel function of MK5 in the control of G2/M transition after replicative stress. These data demonstrate for the first time the relation between these kinases and the G2/M transition. Our work should contribute to a better understanding of the roles of ERK3/4-MK5 kinases.

Les premières cellules progénitrices lympho-myéloïdes (LMPP) entrent dans le thymus et commencent leur processus de différenciation au stade double négatif (DN, CD4-CD8-). Après un réarrangement fonctionnel de la chaine bêta de leur récepteur des cellules T (RCT), les cellules reçoivent des signaux de différenciation, de prolifération, de survie et de sélection et passent au stade double positif (DP, CD4+CD8+). Ensuite, la chaine alpha du RCT est réarrangée et testée via les sélections positive et négative. Si le RCT reçoit un signal ni trop fort, ni trop faible, les cellules passent au stade simple positif où elles exprimeront soit la molécule CD4 ou CD8. ERK3, une MAPK non-conventionnelle, joue un rôle important dans le développement thymique. Des études précédentes ont démontré qu’une déficience en ERK3 diminue de 50 % la cellularité thymique et de 75% le nombre de cellules simples positives CD4 (CD4SP). Nous avons posé comme hypothèses qu’il y a une augmentation de l’apoptose chez les thymocytes DP de souris Erk3-/- et que cette déficience chez les thymocytes DP affecterait la sélection positive des cellules DP, réduisant ainsi le nombre de thymocytes CD4SP. Afin de vérifier la première hypothèse, nous avons regardé les niveaux d’apoptose grâce à la cytométrie en flux et par immunohistochimie. Dans les deux cas, nous étions incapables de détecter une différence du niveau d’apoptose chez les thymocytes DP entre les souris Erk3+/+ et Erk3-/-. Ensuite, nous nous sommes posés la question suivante : La demi-vie des thymocytes DP Erk3-/- était-elle plus courte que le type sauvage? La demi-vie des thymocytes DP a été mesurée à l’aide de l’étude des réarrangements secondaires de la chaine alpha du RCT par PCR semi-quantitatif et à l’aide de cultures de thymus fœtaux. En effet, ERK3 semble important pour prolonger la demi-vie des thymocytes DP. Ensuite, nous avons utilisé des marqueurs cellulaires différentiels (CD69, CD5 et RCT) pour regarder si les thymocytes DP sont capables de passer la sélection positive. En effet, il y a moins de thymocytes DP Erk3-/- qui sont CD69fort, CD5fort et RCTfort. Finalement, nous voulons savoir si les fonctions de ERK3 passent par MK5, son seul partenaire d’interaction connu à ce jour. Après la caractérisation du thymus de la souris Mk5-/-, nous observons que seulement la réduction du nombre de thymocytes CD4SP est identique à celle des thymocytes CD4SP de la souris Erk3-/-. En conclusion, ces résultats révèlent des fonctions importantes pour la molécule ERK3 lors du processus de sélection positive, le maintient de la demi-vie des thymocytes DP et lors de la régulation de développement thymique de manière MK5-dépendante et -indépendante. / Early thymic progenitor cells (ETP) enter the thymus and begin their differentiation process at the double negative (DN) stage, having no CD4 and CD8 expression. After a functional rearrangement of the beta chain of the T-cell receptor (TCR), the cells receive differentiation, proliferation, survival, and selection signals and pass to the double positive (DP) stage and acquire the expression of CD4 and CD8 molecules. Then, the TCR alpha chain is rearranged and the fully composed TCR is tested through positive and negative selection. If the TCR receives a signal that is just right (not too strong or too weak), the cells pass to the single-positive stage by acquiring either the CD4 or CD8 molecule. ERK3, an unconventional MAPK, plays an important role in thymic development. Previous studies have shown that a deficiency in ERK3 decreases by 50% the total thymic cellularity and by 75% the number of CD4 single- positive cells (CD4SP). We hypothesized that there is an increase in apoptosis in DP thymocytes of Erk3-/- mice for and that this deficiency would affect the positive selection of DP cells, resulting in a reduced number of CD4SP. To test the first hypothesis, we looked at apoptosis levels by flow cytometry and immunohistochemistry. In both cases, we were unable to detect a difference in the level of apoptosis in DP thymocytes from Erk3+/+ and Erk3-/- mice. We then made a second assumption, that the half-life of Erk3-/- DP thymocytes for was shorter, which was measured by secondary rearrangements of the RCT alpha chain by semi-quantitative PCR and cultures of fetal thymi. Indeed, ERK3 seems important to extend the half- life of DP thymocytes. Next, we used differential cell markers (CD69, CD5, and TCR) to see if the DP thymocytes are able to pass positive selection. Indeed, there are less DP thymocytes Erk3-/- that are CD69hi, CD5hi, and TCRhi. Finally, we wanted to know whether the functions of ERK3 passes through MK5, its only interacting partner known to date. After characterization of the thymus of Mk5-/- mice, we observe that only the reduction of CD4SP thymocytes is identical to that of CD4SP thymocytes of Erk3-/-mice. In conclusion, these results reveal important functions for the molecule ERK3 for maintaining the half-life of DP thymocytes, for the process of positive selection and for regulating T-cell development in a MK5-dependent and - independent manner.

Il y a 4 isoforme de p38 : α, β, δ, and γ. MK5, à l'origine identifié comme étant un régulateur de PRAK (Regulated/Activated Protein Kinase), est maintenant connu pour être activée par la protéine kinase p38 (qui est un mitogène activé par la protéine kinase, MAPK). Cette dernière est impliquée dans les mécanismes de fibrose et d'apoptose pendant l'hypertrophie cardiaque. De plus, MK5 est également activée par les MAPKs atypiques; ERK3 et ERK4. Bien qu’elles soient fortement exprimées dans le coeur, le rôle physiologique de MK5 et ERK3 demeure inconnu. Par conséquent, nous avons étudié l'effet de la constriction aortique transversale (TAC) – induisant un surcharge chronique de pression chez les souris hétèrozygotes knockout pour MK5 (MK5+/-) ou ERK3 (ERK3+/-) et pour leurs types sauvages (MK5+/+ et ERK3+/+). Deux sem post-TAC; le ratio de poids du coeur/poids corporel a été augmenté chez les 2 souris MK5+/- et MK5+/+. L'échocardiographie de la trans-thoracique démontre que la surcharge de pression a altéré la fonction diastolique du ventricule gauche chez MK5+/+, mais pas chez la souris MK5+/-. De plus, nous avons observé moins de dépôt de collagène, évalué par une coloration au trichrome de Masson, 2 et 3 sem post-TAC chez les souris MK5+/-. Parallèlement, le niveau de l’ARNm de collagène type1 alpha-1 a été significativement diminué dans les coeurs des souris MK5+/-, 2 et 3 sem post-TAC. De même, ERK3, mais pas ERK5 ni p38α, co-IP avec MK5 dans les 2 modèles des coeurs TAC; aigus ou chroniques. En revanche, l’ajout exogénique de GST-MK5 a abaissé ERK4 et p38α, mais pas ERK3 dans les lysâtes de coeur de souris. Par contre, GST-ERK3 et GST-p38α ne démontrent aucune co-IP avec MK5. Ces données suggèrent que dans le coeur seul ERK3, et non ERK4 ou p38α, est capable d’interagir avec, et réguler MK5. A niveau physiologique MK5 interagit entièrement avec ERK3 et par conséquent MK5 n’est pas disponible pour lier les protéines exogéniques. Les souris hétérozygotes pour ERK3 (ERK3+/-) ont également démontré une réduction ou une absence de collagène et une faible expression d’ARNm du collagène type1 alpha1, 3 sem post-TAC. Ces résultats démontrent un important rôle pro-fibrotique de la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression.Nous avons également démontré 5 variant d'épissage de (MK5.1-5), y compris la forme originale (MK5.1). MK5.2 et MK5.5 subissent une délétion de 6 paires de base dans l’exon 12 : MK5.3 manque l'exon 12 : MK5.4 et MK5.5 manquent les exons 2-6. L'expression des ARNm des différents variant d'épissage a été vérifiée par PCR en temps réel (qPCR). Bien que l’expression est ubiquitaire, l'abondance relative de chaque variant était tissu-spécifique (coeur, rein, pancréas, muscle squelettique, poumon, foie, et cerveau). En plus, l'abondance relative des variant d’épissage varie pendant la surcharge de pression et le développement postnatal du coeur. En outre, l'immunofluorescence a indiqué que MK5.1-5.3 se localise au noyau alors que MK5.4-5.5 est situé au niveau cytoplasmic dans les cellules HEK 293 non stimulées. Suite à une stimulation avec l'anisomycin, un activateur de p38 MAPK, MK5.1-5.3 se translocalise du noyau au cytoplasme alors qu’une petite fraction de MK5.4-5.5 translocalise vers le noyau. Ces variant d'épissage peuvent diversifier la signalisation de MK5-ERK3 dans coeur, mais leur rôle exact oblige des recherches supplémentaires. Excepté l’isoforme δ, toutes les isoformes de p38 sont exprimées dans le coeur et la forme α est considérée comme étant l'isoforme dominante. L’analyse par qPCR et immunobuvardage de type western ont démontré que p38α et p38γ sont les deux isoformes prédominantes alors que p38β et p38δ sont exprimées aux mêmes niveaux dans le coeur de rat adulte. L'immunofluorescence a démontré que p38α et p38γ se trouvent dans le cytoplasme et le noyau. Cependant, suite à la surcharge par TAC, p38γ s'est accumulé dans noyau tandis que la distribution de p38α est demeurée inchangée. Ainsi, l'abondance de p38γ et sa translocalisation nucléaire suite à la surcharge de pression indique un rôle potentiel dans l'expression génique pendant le remodelage cardiaque. En conclusion, nous avons mis en évidence pour la première fois un rôle pro-fibrotique pour la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression. D'ailleurs, les niveaux comparables d'expression de p38γ avec p38α, et la localisation différentielle de p38γ pendant la surcharge aiguë ou chronique de pression suggèrent différents rôles possibles pour ces isoformes pendant le remodelage hypertrophique cardiaque. / There are 4 isoforms of p38 MAP kinase: α, β, γ, and δ. p38 signaling has been implicated in fibrosis and apoptosis during cardiac hypertrophy. MK5, originally identified as a p38 Regulated/Activated Protein Kinase (PRAK), is known to be downstream of p38 mitogen activated protein kinase (MAPK). Although highly expressed in the heart, the physiological roles of MK5 remain unknown. To determine if MK5 plays a role in mediating detrimental effects downstream of p38, we studied the effect of transverse aortic constriction (TAC)-induced chronic pressure overload in mice heterozygous for a knockout of MK5 (MK5+/-). Moreover, as MK5 is also activated by the atypical MAPKs, ERK3 and ERK4, the effects of TAC were also studied in ERK3+/- mice. Wild-type (MK5+/+; ERK3+/+) littermates were used as controls. Two wks post-TAC, heart weight/body weight ratios were significantly and similarly increased in both MK5+/- and MK5+/+ hearts. Trans-thoracic echocardiography revealed that pressure overload impaired left ventricular diastolic function in MK5+/+, but not in MK5+/- hearts. In addition, less collagen deposition, assessed by Masson trichrome staining, was observed in MK5+/- hearts 2 and 3 wks post-TAC. Furthermore, TAC-induced increases in collagen alpha1 type1 mRNA levels were significantly lower in MK5+/- hearts at both 2 and 3 wks post-TAC. Immunoprecipitation of MK5 resulted in co-immunoprecipitation of ERK3 but not ERK4 or p38α in either acute or chronic sham-operated and TAC hearts. In contrast, exogenous GST-MK5 pulled down endogenous ERK4 and p38α, but not ERK3, from mouse heart lysates. Neither exogenous GST-ERK3 nor GST-p38α pulled down MK5. These results suggest that MK5 associates with, and is regulated by ERK3, but not ERK4 or p38α in heart. At physiological expressional levels, all MK5 was bound to ERK3 and hence not available to bind exogenous protein. Along similar lines, mice heterozygous for an ERK3 knockout (ERK3+/-) also showed reduced or absent collagen deposition and lower collagen alpha1 type1 mRNA levels 3 wks post-TAC. This data suggests an important pro-fibrotic role of MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload.We also demonstrated the existence of 5 splice variants of (MK5.1-5), including the originally published form (MK5.1). MK5.2 and MK5.5 had a 6 base pair deletion in exon 12: MK5.3 lacked exon 12: and MK5.4 and MK5.5 lacked exons 2-6. Subsequently, expression of the splice variants at the mRNA level was quantified by real time qPCR. Although ubiquitously expressed, the relative abundance of each variant was tissue-specific (heart, kidney, pancreas, skeletal muscle, lung, liver, and brain). Additionally, the relative abundance of MK5 splice variants changed in the heart during pressure overload and post-natal development. Furthermore, immunofluorescence revealed MK5.1-5.3 localized to the nucleus and MK5.4-5.5 to the cytoplasm in unstimulated HEK 293 cells. Upon stimulation with anisomycin, which activates p38 MAPK, MK5.1-5.3 translocated from the nucleus to the cytoplasm and small amounts of MK5.4-5.5 relocated to the nucleus. These splice variants may further diversify MK5-ERK3 signaling in the heart, but their exact role awaits further investigation. With the exception of p38δ, all p38 isoforms are expressed in the heart and α is considered to be the prominent isoform in this tissue. qPCR and western blot analysis revealed p38α and p38γ to be the predominant isoforms and p38β and p38δ are expressed at comparable levels in the adult heart. Confocal immunofluorescence studies revealed p38α and p38γ in both the cytoplasm and nucleus. However, in response to TAC, p38γ accumulated in the nucleus whereas the distribution of p38α remained unaffected. The high abundance of p38γ and its nuclear accumulation during chronic pressure overload suggest that this isoform may play a role in gene expression during pathological cardiac remodeling. In conclusion, we have shown for the first time a pro-fibrotic role for MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload. Moreover, comparable expression levels of p38γ with p38α, and differential localization of p38γ during acute or chronic pressure overload, suggest these isoforms play different roles during cardiac remodeling.

Il y a 4 isoforme de p38 : α, β, δ, and γ. MK5, à l'origine identifié comme étant un régulateur de PRAK (Regulated/Activated Protein Kinase), est maintenant connu pour être activée par la protéine kinase p38 (qui est un mitogène activé par la protéine kinase, MAPK). Cette dernière est impliquée dans les mécanismes de fibrose et d'apoptose pendant l'hypertrophie cardiaque. De plus, MK5 est également activée par les MAPKs atypiques; ERK3 et ERK4. Bien qu’elles soient fortement exprimées dans le coeur, le rôle physiologique de MK5 et ERK3 demeure inconnu. Par conséquent, nous avons étudié l'effet de la constriction aortique transversale (TAC) – induisant un surcharge chronique de pression chez les souris hétèrozygotes knockout pour MK5 (MK5+/-) ou ERK3 (ERK3+/-) et pour leurs types sauvages (MK5+/+ et ERK3+/+). Deux sem post-TAC; le ratio de poids du coeur/poids corporel a été augmenté chez les 2 souris MK5+/- et MK5+/+. L'échocardiographie de la trans-thoracique démontre que la surcharge de pression a altéré la fonction diastolique du ventricule gauche chez MK5+/+, mais pas chez la souris MK5+/-. De plus, nous avons observé moins de dépôt de collagène, évalué par une coloration au trichrome de Masson, 2 et 3 sem post-TAC chez les souris MK5+/-. Parallèlement, le niveau de l’ARNm de collagène type1 alpha-1 a été significativement diminué dans les coeurs des souris MK5+/-, 2 et 3 sem post-TAC. De même, ERK3, mais pas ERK5 ni p38α, co-IP avec MK5 dans les 2 modèles des coeurs TAC; aigus ou chroniques. En revanche, l’ajout exogénique de GST-MK5 a abaissé ERK4 et p38α, mais pas ERK3 dans les lysâtes de coeur de souris. Par contre, GST-ERK3 et GST-p38α ne démontrent aucune co-IP avec MK5. Ces données suggèrent que dans le coeur seul ERK3, et non ERK4 ou p38α, est capable d’interagir avec, et réguler MK5. A niveau physiologique MK5 interagit entièrement avec ERK3 et par conséquent MK5 n’est pas disponible pour lier les protéines exogéniques. Les souris hétérozygotes pour ERK3 (ERK3+/-) ont également démontré une réduction ou une absence de collagène et une faible expression d’ARNm du collagène type1 alpha1, 3 sem post-TAC. Ces résultats démontrent un important rôle pro-fibrotique de la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression.Nous avons également démontré 5 variant d'épissage de (MK5.1-5), y compris la forme originale (MK5.1). MK5.2 et MK5.5 subissent une délétion de 6 paires de base dans l’exon 12 : MK5.3 manque l'exon 12 : MK5.4 et MK5.5 manquent les exons 2-6. L'expression des ARNm des différents variant d'épissage a été vérifiée par PCR en temps réel (qPCR). Bien que l’expression est ubiquitaire, l'abondance relative de chaque variant était tissu-spécifique (coeur, rein, pancréas, muscle squelettique, poumon, foie, et cerveau). En plus, l'abondance relative des variant d’épissage varie pendant la surcharge de pression et le développement postnatal du coeur. En outre, l'immunofluorescence a indiqué que MK5.1-5.3 se localise au noyau alors que MK5.4-5.5 est situé au niveau cytoplasmic dans les cellules HEK 293 non stimulées. Suite à une stimulation avec l'anisomycin, un activateur de p38 MAPK, MK5.1-5.3 se translocalise du noyau au cytoplasme alors qu’une petite fraction de MK5.4-5.5 translocalise vers le noyau. Ces variant d'épissage peuvent diversifier la signalisation de MK5-ERK3 dans coeur, mais leur rôle exact oblige des recherches supplémentaires. Excepté l’isoforme δ, toutes les isoformes de p38 sont exprimées dans le coeur et la forme α est considérée comme étant l'isoforme dominante. L’analyse par qPCR et immunobuvardage de type western ont démontré que p38α et p38γ sont les deux isoformes prédominantes alors que p38β et p38δ sont exprimées aux mêmes niveaux dans le coeur de rat adulte. L'immunofluorescence a démontré que p38α et p38γ se trouvent dans le cytoplasme et le noyau. Cependant, suite à la surcharge par TAC, p38γ s'est accumulé dans noyau tandis que la distribution de p38α est demeurée inchangée. Ainsi, l'abondance de p38γ et sa translocalisation nucléaire suite à la surcharge de pression indique un rôle potentiel dans l'expression génique pendant le remodelage cardiaque. En conclusion, nous avons mis en évidence pour la première fois un rôle pro-fibrotique pour la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression. D'ailleurs, les niveaux comparables d'expression de p38γ avec p38α, et la localisation différentielle de p38γ pendant la surcharge aiguë ou chronique de pression suggèrent différents rôles possibles pour ces isoformes pendant le remodelage hypertrophique cardiaque. / There are 4 isoforms of p38 MAP kinase: α, β, γ, and δ. p38 signaling has been implicated in fibrosis and apoptosis during cardiac hypertrophy. MK5, originally identified as a p38 Regulated/Activated Protein Kinase (PRAK), is known to be downstream of p38 mitogen activated protein kinase (MAPK). Although highly expressed in the heart, the physiological roles of MK5 remain unknown. To determine if MK5 plays a role in mediating detrimental effects downstream of p38, we studied the effect of transverse aortic constriction (TAC)-induced chronic pressure overload in mice heterozygous for a knockout of MK5 (MK5+/-). Moreover, as MK5 is also activated by the atypical MAPKs, ERK3 and ERK4, the effects of TAC were also studied in ERK3+/- mice. Wild-type (MK5+/+; ERK3+/+) littermates were used as controls. Two wks post-TAC, heart weight/body weight ratios were significantly and similarly increased in both MK5+/- and MK5+/+ hearts. Trans-thoracic echocardiography revealed that pressure overload impaired left ventricular diastolic function in MK5+/+, but not in MK5+/- hearts. In addition, less collagen deposition, assessed by Masson trichrome staining, was observed in MK5+/- hearts 2 and 3 wks post-TAC. Furthermore, TAC-induced increases in collagen alpha1 type1 mRNA levels were significantly lower in MK5+/- hearts at both 2 and 3 wks post-TAC. Immunoprecipitation of MK5 resulted in co-immunoprecipitation of ERK3 but not ERK4 or p38α in either acute or chronic sham-operated and TAC hearts. In contrast, exogenous GST-MK5 pulled down endogenous ERK4 and p38α, but not ERK3, from mouse heart lysates. Neither exogenous GST-ERK3 nor GST-p38α pulled down MK5. These results suggest that MK5 associates with, and is regulated by ERK3, but not ERK4 or p38α in heart. At physiological expressional levels, all MK5 was bound to ERK3 and hence not available to bind exogenous protein. Along similar lines, mice heterozygous for an ERK3 knockout (ERK3+/-) also showed reduced or absent collagen deposition and lower collagen alpha1 type1 mRNA levels 3 wks post-TAC. This data suggests an important pro-fibrotic role of MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload.We also demonstrated the existence of 5 splice variants of (MK5.1-5), including the originally published form (MK5.1). MK5.2 and MK5.5 had a 6 base pair deletion in exon 12: MK5.3 lacked exon 12: and MK5.4 and MK5.5 lacked exons 2-6. Subsequently, expression of the splice variants at the mRNA level was quantified by real time qPCR. Although ubiquitously expressed, the relative abundance of each variant was tissue-specific (heart, kidney, pancreas, skeletal muscle, lung, liver, and brain). Additionally, the relative abundance of MK5 splice variants changed in the heart during pressure overload and post-natal development. Furthermore, immunofluorescence revealed MK5.1-5.3 localized to the nucleus and MK5.4-5.5 to the cytoplasm in unstimulated HEK 293 cells. Upon stimulation with anisomycin, which activates p38 MAPK, MK5.1-5.3 translocated from the nucleus to the cytoplasm and small amounts of MK5.4-5.5 relocated to the nucleus. These splice variants may further diversify MK5-ERK3 signaling in the heart, but their exact role awaits further investigation. With the exception of p38δ, all p38 isoforms are expressed in the heart and α is considered to be the prominent isoform in this tissue. qPCR and western blot analysis revealed p38α and p38γ to be the predominant isoforms and p38β and p38δ are expressed at comparable levels in the adult heart. Confocal immunofluorescence studies revealed p38α and p38γ in both the cytoplasm and nucleus. However, in response to TAC, p38γ accumulated in the nucleus whereas the distribution of p38α remained unaffected. The high abundance of p38γ and its nuclear accumulation during chronic pressure overload suggest that this isoform may play a role in gene expression during pathological cardiac remodeling. In conclusion, we have shown for the first time a pro-fibrotic role for MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload. Moreover, comparable expression levels of p38γ with p38α, and differential localization of p38γ during acute or chronic pressure overload, suggest these isoforms play different roles during cardiac remodeling.

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