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During development of epithelial organs, epithelial cells collectively migrate and invade into their surroundings to form complex 3D structures, such as the tubular ducts and alveoli of the mammary gland. A prerequisite for coordinating such collective movement is apicobasal cell polarity. This polarity divides the plasma membrane of epithelial cells into an apical domain towards the lumen of structures and a basal domain facing the matrix. Polarity is essential for the functionality of epithelial tissues and signals from the surrounding matrix are known to participate in its establishment. In contrast, loss of polarity has been associated with progression of diseases such as cancer. During epithelial tubulogenesis, the pro-invasive enzyme MT1-MMP is regulated according to apicobasal polarity. This regulation is essential for tubulogenesis to occur and restricts MT1-MMP activity to the tip of protruding tubules by ensuring that the enzyme only localises to the basal, matrix-abutting cell surface in this location. Signals from fibrillar collagen I contribute to regulating the polarised distribution of MT1-MMP. How such signals are transmitted and influence polarised trafficking is however not understood. In this study, I found that inhibition of the collagen receptor DDR1 disturbed the apicobasal distribution of MT1-MMP in MDCK cells. In 3D environments, DDR1 inhibition blocked MT1-MMP-dependent tubulogenesis of epithelial cells, which instead formed compact, multi-layered aggregates. Furthermore, polarisation of the epithelial cell membrane into an apical and a basal domain failed in absence of DDR1 signalling, suggesting that DDR1 affects establishment of epithelial polarity. In support of this, the effects of DDR1 signalling on apicobasal polarity were not limited to MT1-MMP- dependent morphogenesis, but also proved essential for polarisation of cells during 3D morphogenesis that did not require ECM degradation. An investigation of signalling downstream of DDR1 in establishment of apicobasal polarity revealed this to involve modulation of cytoskeletal tension. Inhibition of DDR1 in 2D culture of MDCK cells thus increased ROCK-dependent phosphorylation of MLC along cell-cell junctions, suggesting that DDR1 can suppress ROCK activity. Importantly, the ROCK-suppressing function of DDR1 contributed to establishment of polarity in MDCK cells in 3D matrices, where inhibition of ROCK activity rescued the formation of polarised cysts in absence of DDR1 signalling. The role of DDR1 in epithelial organisation was reflected in the epithelium of the mammary gland of lactating DDR1-null mice, which had smaller alveoli with a diffuse distribution of basement membrane components compared to wild type mice. Furthermore, DDR1 inhibition attenuated formation of milk-producing mammospheres during lactogenic differentiation of mammary epithelial cells in vitro in a ROCK- dependent manner. This suggests that the ROCK-suppressing function of DDR1 observed in MDCK cells is important for morphogenesis of other epithelial cell types as well. Overall, this study suggests that DDR1 signalling contributes to epithelial polarisation and morphogenesis in a manner involving regulation of cytoskeletal organisation, at least partly through regulation of ROCK activity.

Coronaviruses (CoVs) comprise a family of enveloped viruses that cause respiratory disease in humans, including CoV disease 2019 (COVID-19), caused by severe-acute respiratory syndrome CoV-2 (SARS-CoV-2). For CoV infection to occur, the CoV spike (S) protein must mediate fusion between the viral and host membranes. This entry process can also be repurposed during infection to promote cell-to-cell fusion, further contributing to viral spread. To trigger fusion, S must bind its cognate receptor and be cleaved by host proteases. Identifying cellular proteases capable of triggering CoV fusion is critical to understand CoV entry, tropism, and cell-cell spread, however the range of proteases capable of promoting CoV fusion has not been fully explored. Here, using fusion and entry assays, I provide evidence implicating matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) as a fusion trigger for SARS-CoV-2 and HCoV-229E. Additionally, I show MMP-9 expression is upregulated during CoV infection, highlighting its potential relevance as a CoV triggering factor.

La prévalence de la maladie asthmatique est en constante augmentation à travers le monde. Au cours de la vie dun asthmatique, la fonction pulmonaire diminue plus fortement comparativement aux sujets normaux. Ceci est lié à linflammation et au remodelage des voies aériennes. Les caractéristiques principales du remodelage bronchique consistent en des dommages épithéliaux, une hyperplasie des cellules musculaires lisses, une hyperplasie glandulaire, et une fibrose sous-épithéliale incluant un dépôt de collagène dans la lamina reticularis de lépithélium bronchique. Les traitements actuels de lasthme ne sont pas efficaces dans le contrôle du remodelage bronchique et ne permettent pas de contrôler efficacement la maladie dun point de vue clinique. Pour cette raison, le développement de nouveaux agents thérapeutiques semble nécessaire afin de permettre un contrôle de linflammation aigue, de lhyperréactivité et du remodelage bronchiques. Dans ce travail, nous avons dans un premier temps, mis au point un modèle murin permettant létude de la réponse inflammatoire aigue mais également du remodelage bronchique. Grâce au développement de ce modèle murin, nous avons pu détecter par analyse transcriptomique de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour la maladie asthmatique telles que lAgr2, le Cd209e, le Col6 et le C1qa. Dautres gènes préalablement décrits comme surexprimés dans lasthme ont également été étudiés afin de valider notre modèle (MMP-12, Fcgr2b, Ccl8, chi3l3 et Arg1). Suite à cela, nous avons décidé dinvestiguer le rôle de la MMP-12 dans la pathologie asthmatique car bien que ce gène soit connu pour être surexprimé dans la maladie, son rôle exact dans la pathologie asthmatique nétait pas encore clair. La MMP-12, également appelée métalloélastase du macrophage, est une pro-enzyme de 54 kDa qui est clivée en deux formes actives de 45 kDa et de 22 kDa. Elle est exprimée principalement par les macrophages alvéolaires mais également par les cellules épithéliales bronchiques, les cellules dendritiques et les cellules musculaires lisses. Le substrat principal de cette enzyme est lélastine qui représente environ 2.5% du poids sec des poumons. En plus de son activité élastolytique, la MMP-12 peut dégrader dautres composants de la matrice extracellulaire comme le collagène de type IV, la fibronectine, la laminine, la vitronectine, les protéoglycans, etc. Elle a également la capacité dactiver la pro-MMP-2 et la pro-MMP-3 qui peuvent à leur tour activer la pro-MMP-9 et la pro-MMP-1. Cette cascade protéolytique explique comment la MMP-12 peut provoquer une dégradation exagérée dune grande variété de composant de la matrice extracellulaire. La MMP-12 est également capable de dégrader dautres substrats non liés à la matrice extracellulaire. Une régulation anormale de lexpression de la MMP-12 est rencontrée dans différentes pathologies telles que les maladies inflammatoires de la peau, lanévrisme de laorte, le cancer et lemphysème pulmonaire. Afin détudier plus avant le rôle de la MMP-12 dans linflammation allergique et dans le remodelage bronchique, nous avons appliqué notre modèle murin à des souris déficientes pour le gène de la MMP-12 ainsi quaux souris wild-type correspondantes. A la fin de chaque protocole expérimental, la résistance bronchique mesurée à laide du système Flexivent est moins importante chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène lorsquon les compare aux souris de type sauvage correspondantes. Les pourcentages déosinophiles présents dans le lavage bronchoalvéolaire des souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène sont significativement moins importants que ceux présents chez les souris de type sauvage correspondantes et ce quelque soit le temps dexposition. Les mêmes différences ont été observées pour le score inflammatoire et pour linfiltration des éosinophiles au sein des parois bronchiques. Le pourcentage de cellules caliciformes présentes dans lépithélium bronchique est significativement moins important chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène durant 1 et 5 semaines comparativement aux souris de type sauvage correspondantes mais plus aucune différence na pu être observée après 10 semaines dexposition. Le nombre de mastocyte est significativement moins important chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène durant 5 et 10 semaines comparativement aux souris sauvages correspondantes. Aucune différence na pu être observée après 1 semaine dexposition. Enfin, lépaisseur de la couche de muscle lisse est significativement moins importante chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lovalbumine durant 5 et 10 semaines comparativement aux souris de type sauvage correspondantes. Suite à ces résultats, nous avons montré que le MMP-12 était une cible thérapeutique potentielle pour lasthme. Nous avons également montré que les principales modifications dues au déficit de ce gène survenaient dès la première semaine dexposition. Nous avons donc décidé de tester les effets de linstillation dun siRNA ciblant la MMP-12 dans notre modèle murin dinflammation aigue. Un western blot et une PCR spécifiques de la MMP-12 ont été réalisés afin de sassurer que le siRNA permettait bien de diminuer lexpression de ce gène. Linstillation de siRNA ciblant la MMP-12 entraine bien une diminution de lexpression de ce gène tant au niveau de lARNm quau niveau protéique. Le pourcentage déosinophiles présents dans le lavage bronchoalvéolaire des souris exposées à lallergène ayant été instillées avec le siRNA ciblant la MMP-12 est significativement diminué par rapport à celui des souris exposées à lallergène ayant été instillées avec du PBS ou avec un siRNA scramble. De plus, cette diminution dépend de la dose de siRNA utilisée. Les mêmes observations ont pu être réalisées en ce qui concerne linfiltration des éosinophiles au sein des parois bronchiques ainsi que pour le pourcentage de cellules à mucus présentes dans lépithélium bronchique. Linstillation du siRNA chez les souris exposées à lallergène entraine une diminution du score inflammatoire par rapport aux souris ayant été instillées avec du PBS ou avec le siRNA scramble mais cette diminution semble moins dépendre de la dose de siRNA utilisé. Les niveaux dexpression de CCL-11 et de lIL-13 mesurés par ELISA sont diminués suite au traitement avec le siRNA ciblant lARNm de la MMP-12 comparativement aux souris contrôles. De même, les niveaux dexpression du TNF-α et de larginase I mesurés par western blot sont diminués après linstillation du siRNA ciblant la MMP-12. Au terme de ce travail, nous pouvons donc conclure que le MMP-12 joue un rôle important dans la pathologie asthmatique et que ladministration de siRNA ciblant ce gène permet de diminuer linflammation à éosinophiles ainsi que lhyperplasie des cellules à mucus. Ceci permet de penser que la MMP-12 est une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour le traitement de lasthme.

Salivary duct carcinoma (SDC) is an uncommon neoplasm showing extensive local invasion and metastasis. Histologically it exhibits ductal differentiation without myoepithelial participation and resembles intraductal and invasive ductal carcinoma of the breast. This study investigates the incidence of intraductal disease within invasive SDC and characterizes the expression of CK19, COX-2, MMP-2, 9 and 11 in intraductal and invasive SDC. 21 conventional SDC, 8 SDC arising as carcinoma ex-pleomorphic adenoma (CaExPA), 2 pure low-grade intraductal SDC, 1 pure high-grade intraductal SDC and 1 intraductal SDC with de-differentiation were studied. The presence of intraductal tumor in SDC is relatively common (52.4%) but is not a prominent component. SDC tumor cells were strongly positive for CK19 and COX-2. MMP-2 and 9 expression showed no significant pattern. MMP-11 was expressed by fibroblasts surrounding invasive tumor and was significantly associated with lymph node positivity (p=0.02).

Salivary duct carcinoma (SDC) is an uncommon neoplasm showing extensive local invasion and metastasis. Histologically it exhibits ductal differentiation without myoepithelial participation and resembles intraductal and invasive ductal carcinoma of the breast. This study investigates the incidence of intraductal disease within invasive SDC and characterizes the expression of CK19, COX-2, MMP-2, 9 and 11 in intraductal and invasive SDC. 21 conventional SDC, 8 SDC arising as carcinoma ex-pleomorphic adenoma (CaExPA), 2 pure low-grade intraductal SDC, 1 pure high-grade intraductal SDC and 1 intraductal SDC with de-differentiation were studied. The presence of intraductal tumor in SDC is relatively common (52.4%) but is not a prominent component. SDC tumor cells were strongly positive for CK19 and COX-2. MMP-2 and 9 expression showed no significant pattern. MMP-11 was expressed by fibroblasts surrounding invasive tumor and was significantly associated with lymph node positivity (p=0.02).

Le RXP470.1 est l’un des premiers inhibiteurs puissants de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc impliquée dans de nombreuses pathologies comme l’athéroclérose et la bronchopneumopathie obstructive chronique (BPCO). Pour comprendre les bases moléculaires contrôlant l’interaction de cet inhibiteur avec sa cible, des approches pluridisciplinaires associant des relations structure-activité, avec des études de cristallographie de complexes enzymes inhibiteurs et d’études de microcalorimétrie, décrivant les contributions enthalpiques et entropiques impliquées dans la formation des complexes, ont été réalisées dans ce travail de thèse. Les affinités de trois analogues du RXP470.1 ont été tout d’abord déterminées. Puis quatre structures cristallographiques de complexes enzyme/inhibiteur décrivant le mode d’interaction duRXP470.1 et de ces trois analogues ont été obtenues avec des résolutions de 1.15 Å, 1.50 Å, 1.50Å et 1.30 Å, respectivement. Parallèlement les études de microcalorimétrie ont été menées pour étudier les facteurs énergétiques contrôlant l’interaction du RXP470.1 avec la MMP-12. Les résultats indiquent que la présence d’une chaîne latérale très longue et hydrophobe en position P1’de l’inhibiteur s’insérant dans la cavité S1’ de la MMP-12 est essentielle à la très bonne affinité de cet inhibiteur pour la MMP-12. Cette interaction met essentiellement en jeu un effet entropique très important de - 4 kcal/mol. L’interaction du RXP470.1 est aussi essentiellement dirigée par une forte augmentation d’entropie (-TDS= -10 kal/mol) et une composante enthalpique beaucoup plus faible (DH= -2.5 kcal/mol), et ce malgré l’observation dans le cristal de nombreuses interactions entre l’inhibiteur et le site actif de la MMP-12. L’étude de microcalorimétrie met aussi en lumière la prise d’un proton au cours de la formation du complexe enzyme inhibiteur impliquant deux résidus chargés négativement en solution, le résidu catalytique Glu219 et le groupe phosphoryle chélatant du zinc dans l’inhibiteur. Cette étude révèle aussi que si le groupe phosphoryle est considéré comme un chélatant faible de l’atome de zinc, il impose néanmoins des contraintes directionnelles très importantes qui ont un impact sur le positionnement des autres parties de l’inhibiteur dans le site actif de l’enzyme. Ce dernier effet pourrait expliquer pourquoi un certain nombre d’interactions entre l’inhibiteur et l’enzyme ne sont pas optimisées et pourquoi la variation d’enthalpie pour former le complexe reste relativement faible. Cette étude ouvre maintenant la voie à d’autres études en plaçant au centre des futurs travaux le rôle du groupe chélatant dans la conception des inhibiteurs de MMP, ainsi de nouveaux inhibiteurs puissants et sélectifs d’autres MMP devraient voir le jour grâce à ce travail et aux résultats obtenus. / RXP470.1 is one of the first highly potent and selective inhibitor of MMP-12, a zinc protease involved in several human diseases such as atherosclerosis and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). To understand the molecular determinants controlling the interaction of RXP470.1 with MMP-12 active site, a multidisciplinary approach combining structure-activity data, crystallography and microcalorimetry have been performed on RXP470.1 and its three analogues. The affinities of the three RXP470.1 analogues have been determined. Then, fourcrystal structures of MMP-12 in interaction with these inhibitors have beendetermined at high resolution, 1.15 Å, 1.50 Å, 1.50 Å et 1.30 Å, respectively. These data have indicated that the presence of a long hydrophobic side chain in the P1’ position of the RXP470.1, which enters deeply inside the S1’ cavity of MMP-12, is playing a key role in the inhibitor affinity. The contribution of this side chain is mostly entropic (-TDS - 4 kcal/mol). The interaction of RXP470.1 with MMP-12 is also mostly driven by a sizeable entropy increase (-TDS= -10 kal/mol) and a more modest enthalpy contribution (DH= -2.5 kcal/mol), despite the observation in the crystal structure of several contacts between inhibitor and MMP-12 active site. Furthermore, this study reveals that the binding of RXP470.1 to MMP-12 is linked to a proton uptake involving two negatively charged residues, the catalytic Glu219 and the phosphoryl group of the inhibitor. Furthermore, despite that the phosphoryl group is considered as a weak zincbinding group, this study highlights that the interactions of this group with the active site zinc atom involved strong directionality between these two groups. This effect has strong impact on the positioning of the other parts of the inhibitor in the MMP-12 active site. This last effect could be responsible for the modest enthalpy increase associated with the binding of RXP470.1 to MMP-12, by preventing the optimization of several interactions between the inhibitor and the enzyme. The results indicate that the role of the zinc-binding group should be better consider in the future. Finally this study opens a new vision in this field and should allow the design of new selective inhibitors of other MMPs.

Chez les mammifères, le foie se développe à partir d’une région de l’endoderme ventral antérieur. Les hépatoblastes, qui constituent le bourgeon hépatique primordial, prolifèrent et traversent la lame basale qui les sépare du septum transverse, de manière à envahir ce dernier. Ils se différencient ensuite en hépatocytes et en cholangiocytes en interagissant avec des cellules mésenchymateuses et endothéliales. Les hépatocytes s'organisent progressivement en travées, achèvent leur différenciation et remplissent les fonctions métaboliques du foie, alors que les cholangiocytes délimitent les canaux biliaires. Le développement du foie est orchestré par un réseau de facteurs de transcription et de signaux intercellulaires. Les facteurs de transcription HNF-6 et OC-2, qui appartiennent à la famille Onecut, interviennent dans la différenciation des hépatoblastes en hépatocytes ou cholangiocytes, dans la maturation hépatocytaire et dans la morphogenèse biliaire. Toutefois, leurs fonctions au stade initial du développement du foie n’ont pas encore été élucidées. Au cours de cette thèse, nous avons caractérisé le rôle d’HNF-6 et OC-2 dans le développement précoce du foie par l'étude du phénotype de souris transgéniques déficientes pour ces deux facteurs. Nous avons découvert qu’HNF-6 et OC-2 sont requis transitoirement pour la migration des hépatoblastes hors du bourgeon primordial, et qu’ils participent à un réseau de gènes contrôlant l’adhérence et la migration des hépatoblastes. En effet, ils stimulent l’expression de l’ostéopontine et inhibent celle de la thombospondine-4 et l’E-cadhérine, trois protéines impliquées dans l’adhérence et la migration cellulaires. Nous avons complété notre travail en portant notre attention sur les mécanismes effecteurs de la migration des hépatoblastes. Nous avons plus particulièrement étudié le rôle des métalloprotéinases matricielles (MMP) et identifié celles qui sont exprimées dans le bourgeon hépatique et le mésenchyme du septum transverse au moment de l’initiation de la migration des hépatoblastes. Au moyen d'une nouvelle méthode de culture d'explants de foie embryonnaire, nous avons démontré que les MMPs sont essentielles à la migration des hépatoblastes. En conclusion, la présente thèse identifie une nouvelle fonction pour les facteurs de transcription HNF-6 et OC-2 et révèle le rôle des MMPs dans la migration des hépatoblastes. Elle complète notre compréhension des mécanismes régulateurs et effecteurs du développement du foie.

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