Le cancer de l'ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. L'absence de symptômes aux stades précoces de la maladie serait en grande partie responsable de ce faible taux de survie. Comme pour tous les cancers, l'indépendance aux signaux de croissance, l'insensibilité aux signaux inhibiteurs de croissance, la résistance à l'apoptose, l'immortalisation des cellules, l'angiogénèse, l'invasion et la formation de métastase sont des facteurs qui peuvent favoriser la formation et la progression d'un cancer de l'ovaire. La majorité des cancers de l'ovaire exprimerait l'antigène tumoral CA125. On connait actuellement très peu de choses sur les fonctions et les rôles de cette protéine qui fait partie de la famille des mucines. Cependant, des études rapportées par d'autres groupes de recherche ont démontré que certaines mucines peuvent jouer des rôles importants dans le développement et la progression de différents cancers. Des résultats préalablement obtenus par notre laboratoire indiquent que l'expression de cette protéine favoriserait la tumorigénicité des cellules à différents niveaux. Afin d'approfondir nos connaissances sur les fonctions de CA125, des populations stables de cellules exprimant la portion carboxy terminale de la protéine ont été générées dans différentes cultures cellulaires. Les effets du domaine carboxy terminal de CA125 sur la transformation cellulaire, les caractéristiques associées à la tumorigénicité, les jonctions cellulaires et les différentes composantes du cytosquelette ont été analysés. Les résultats ont démontré que, chez la lignée cancéreuse de l'ovaire SKOV-3, le domaine carboxy terminal de CA125 favorise l'indépendance des cellules aux signaux de croissance, l'insensibilité aux signaux inhibiteurs de croissance et la résistance à différents agents génotoxiques utilisés en chimiothérapie. Des expériences effectuées chez les souris indiquent également que les effets du domaine carboxy terminal de CA125 chez les SKOV-3 augmentent grandement leur tumorigénicité. Ainsi, les résultats obtenus avec la lignée SKOV-3 semble [i.e. semblent] indiquer que CA125 pourrait agir comme un oncogène tel que démontré chez d'autres mucines. Les effets du domaine carboxy terminal de CA125 sur différentes cellules non-transformées immortalisées ou non ont ensuite été évalués. Globalement, les effets observés chez la lignée SKOV-3 n'ont pas été observés chez les cellules non-transformées analysées.Le domaine carboxy terminal de la protéine n'a pas non plus été en mesure de transformer les différentes cellules étudiées. Cependant, chez la majorité des populations exprimant le domaine carboxy terminal un allongement de la morphologie des cellules a été observé. Ce changement de morphologie semble indiquer que l'expression de la portion carboxy terminale de CA125 favorise l'induction d'une transition épithélio-mésenchymateuse. Pour conclure, bien que le domaine carboxy terminal semble favoriser fortement la tumorigénicité des cellules cancéreuses SKOV-3 aucun effet important n'a été remarqué chez les différentes cellules non-transformées analysées. Il est possible que cette absence de phénotype chez les cellules non-transformées découle du fait que les populations contrôles servant de base de comparaison auraient effectuées [i.e. effectué] une transition épithélio-mésenchymateuse en réponse aux conditions de culture cellulaire. Également, les effets du domaine carboxy terminal de CA125 seraient peut être [i.e. peut-être] dépendant [i.e. dépendants] de l'expression d'oncogènes supplémentaires exprimés chez les SKOV-3.

Le cancer de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus mortel. La mortalité associée à ce cancer est en en grande partie relié au diagnostic tardif de la maladie. Malgré l’évolution des traitements durant les 30 dernières années, le cancer de l'ovaire reste difficile à traiter et à dépister. Pendant les premiers événements de la transformation tumorale et dans les stades ultérieurs de la progression du carcinome ovarien, il se produit plusieurs changements. Les caractéristiques épithéliales des cellules seront favorisées, l’expression de N-cadhérine sera favorisée et le profil d’expression de plusieurs protéines sera influencé. Notamment l’expression des mucines, dont l’apparition de l’expression de la mucine MUC16. MUC16 (CA125) est une glycoprotéine de type mucine qui est surexprimée dans 80 % des cancers ovariens épithéliaux (CEO) et par les cellules de la surface de l’ovaire transformé. Cependant, elle n’est pas exprimée dans l’épithélium des ovaires normaux. Puisque les cellules épithéliales de l’ovaire ne l’expriment pas, il est logique de se demander si son expression ne confère pas un avantage aux cellules cancéreuses or, on connaît très peu de son rôle dans la pathogenèse des CEO. Des résultats préalablement obtenus par notre laboratoire indiquent que la partie C-terminale de MUC16 joue un rôle important dans la migration, l’invasion, le processus métastatique et dans la tumorigénèse. Ces observations suggèrent un rôle précoce de MUC16 dans la pathogenèse du CEO. Toutefois, son rôle précis dans la transformation cellulaire n’a pas été établi. Afin d’approfondir nos connaissances sur les fonctions de MUC16 dans la transformation cellulaire, la partie C-terminale de MUC16 (MUC16-CTD) a été exprimée de façon stable dans un modèle classique utilisé afin de déterminer le potentiel ontogénique d’une protéine, soit les fibroblastes de souris NIH3T3 et dans les cellules ovariennes de la surface épithéliale (OSE) immortalisées par la télomérase. Des clones indépendants ont été sélectionnés et l’expression de MUC16-CTD a été validée. Par la suite, nous avons procédé à des essais standards de transformation, soit la formation de foyers en conditions adhérées et non-adhérées, la prolifération cellulaire en présence de concentrations faibles et normales de sérum et la formation de tumeurs sous-cutanées. Des clones stables ont été obtenus et évalués pour l’expression de MUC16-CTD. Deux clones indépendants ont été sélectionnés (CTD1 et CTD2) et l’expression de MUC16-CTD a été validée par immunobuvardage, PCR et immunofluorescence. Les cellules exprimant MUC16-CTD ont formé significativement plus de foyers en conditions adhérées et non-adhérées. On a aussi observé une augmentation de la prolifération dans les cellules exprimant MUC16-CTD en conditions normales et appauvries de sérum. Finalement, nous avons observé la formation de tumeurs sous-cutanées dans les souris NUDE. En conclusion, ces résultats suggèrent que MUC16-CTD est suffisant pour induire la transformation des cellules NIH3T3 et des cellules OSE immortalisées.

The cancer antigen 125 (CA125) is a cell-surface mucin which is over-expressed by the majority of ovarian cancers. However, its biology and the role it plays in ovarian cancer is largely unknown, although other cell-surface mucins have been shown to play a role in apoptosis, cell growth and tumour immune evasion. To analyse the function of CA125 in ovarian cancer, we initially knocked down the expression of CA125 using RNA interference. Knocking down CA125 expression using in vitro transcribed short interfering RNAs (siRNAs) induced a potent cell death response, which has been well characterised in the literature as an induction of an interferon response and resulting in cell apoptosis. Subsequently, using the short hairpin RNA expression vector, pSUPER, which has been shown to knock down genes with high efficiency with reduced off-target affects, we generated stable sub-lines of the ovarian cancer cell line, OVCAR-3, which had been transfected with pSUPER constructs targeting CA125. Intriguingly, these sub-lines had a range of abnormal mitotic events and nuclear defects. However, there was no clear association with the level of CA125 knock down. This could be either due to clonal selection from the parent OVCAR-3 cell line or in addition to CA125 knock down, additional genetic changes are required to occur to favour a state of survival. Similar to the in vitro data, xenografts of the sub-clones into SCID mice generated inconclusive results as to whether CA125 knock down contributes to tumour growth, invasion and metastasis in vivo. More recently, we have been able to achieve high levels of short-term CA125 knock down using synthetic siRNAs designed to reduce off-target affects. These preliminary in vitro and in vivo experiments conducted with pSUPER sub-lines should be repeated using synthetic siRNAs to confirm the role of CA125 in this context. Given the role which the cytoplasmic tail of cell-surface mucins plays in its function, we generated a polyclonal antibody recognising the CA125 cytoplasmic tail, designated M16.1. Immunofluorescence imaging of CA125 in ovarian cancer cell lines, OVCAR-3 and PEO-1, using the OC125 extracellular domain antibody indicated cell-surface localisaton of CA125. However, in addition to the cell-surface localisation, the M16.1 antibody localised to the cell cytoplasm, indicating cleavage and release of the CA125 cytoplasmic tail into the cytosol. Additionally, M16.1 co-localised with α-tubulin at perinuclear sites and to areas resembling microtubule organising centres. However, M16.1 did not co-localise with γ-tubulin at the centrosome, indicating association with non-centrosomal microtubules. Furthermore, depolymerisation of microtubules on ice for 1 hour resulted in loss of diffuse cytoplasmic M16.1 staining but co-localisation between M16.1 and α-tubulin at non-centrosomal sites remained. Intriguingly, when microtubules were allowed to reform at 37oC in PEO-1 cells which had CA125 knocked down by synthetic siRNAs, the ability to reform radial asters was impaired, possibly indicating the CA125 cytoplasmic tail involvement in anchoring microtubules to non-centrosomal sites. Furthermore, we also cloned a portion of CA125 encompassing the cytoplasmic tail, transmembrane domain and 9 tandem repeats. When this construct was transfected into COS-1 cells, the CA125 cytoplasmic tail localised to microtubule bundles during metaphase. Mitotic involvement of the endogenous CA125 cytoplasmic tail was confrmed in OVCAR-3 and PEO-1 cells using M16.1. Given this association and also the results from the pSUPER sub-lines with CA125 knockdown, CA125 may be involved in controlling the fidelity of mitosis, which is grossly altered during tumourigenesis. More recently, it was identified that galectin-1 (Gal-1), an S-type lectin, is a ligand for CA125. Gal-1 is a potent inducer of T cell apoptosis and has been implicated as playing a major role in immune evasion for cancer cells. Consequently, we analysed the expression of CA125 and Gal-1 in ovarian cancer and confirmed the two molecules were expressed concurrently at the mRNA level by RT-PCR. Moreover, immunofluorescence studies also confirmed that CA125 and Gal-1 interacted with each other at the cell-surface of 27/87 cells, an ovarian cancer cell-line. Therefore, we hypothesised that CA125 presents Gal-1 to the immune system, which then induces T cell apoptosis and allows the tumour to escape the immune system. However, CA125 did not protect tumour cells from recognition or killing by T cells, which was shown by no differences in IFN-γ secretion or tumour lysis by cytotoxic T cells using influenza peptide pulsed pSUPER sub-lines with CA125 knockdown. The work described in this thesis suggests that CA125 plays a major role in the aetiology and progression of ovarian cancer through its actions on mitosis, microtubule organisation and immune evasion.