Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-25T15:26:20Z No. of bitstreams: 1 Armando_de_Menezes_Neto.pdf: 3814357 bytes, checksum: 6fdde9d3852e34ff90fb510ffa3e7cc3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T15:26:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Armando_de_Menezes_Neto.pdf: 3814357 bytes, checksum: 6fdde9d3852e34ff90fb510ffa3e7cc3 (MD5) Previous issue date: 2008 / Durante o ciclo de vida dos parasitos causadores da malária, uma das fases cruciais é o desenvolvimento sexual e a conseqüente invasão do epitélio intestinal do hospedeiro invertebrado. Proteínas dos estágios do ciclo esporogônico podem ser alvos para vacinas Bloqueadoras de Transmissão (TBVs). Uma das proteínas micronemais que já demonstrou ser um alvo promissor para a inibição do desenvolvimento de oocistos e, portanto, da transmissão, é a WARP (von Willebrand Factor A Domain Related Protein), uma proteína secretada, aparentemente envolvida com a adesão e locomoção dos parasitos. Estudos recentes demonstraram que WARP é sujeita à repressão traducional em macrogametócitos de P. berghei, com o seu mRNA sendo silenciado pela proteína DOZI através da formação de uma ribonucleoproteína. Os objetivos deste estudo foram i) Analisar o perfil de expressão da proteína WARP nos estágios sexuais de P. gallinaceum, ii) Comparar o perfil de transcrição de WARP, durante o desenvolvimento sexual, com perfis de alguns genes relacionados à regulação da expressão ou à invasão epitelial, e iii) Avaliar o potencial da proteína WARP como um candidato à vacina através da análise do seu padrão de expressão. O domínio vWA de PfWARP foi produzido como uma proteína recombinante que foi usada para a produção de anticorpos policlonais. Foram realizados experimentos de microscopia confocal usando estes anticorpos para se detectar WARP em estágios sexuais cultivados de P. gallinaceum. RT-PCR foi usada para detectar WARP e os outros genes estudados a partir de amostras de sangue contendo gametócitos e a partir de intestinos de Aedes fluviatilis infectados, coletados até 24 horas após a alimentação. A proteína WARP pode ser detectada desde os estágios iniciais do desenvolvimento de oocinetos, em zigotos recém-fertilizados, até as formas maduras alongadas. Em zigotos, sua expressão parece ser intra-vesicular e localizada na periferia citoplasmática, próxima à membrana celular, e em oocinetos maduros, WARP apresenta uma distribuição granular com concentração focal na região apical, corroborando sua localização micronemal. Seu transcrito foi detectado, por RT-PCR, em gametócitos de P. gallinaceum. Ainda, o transcrito para a proteína PgDOZI também foi detectado em gametócitos, indicando que a repressão traducional possa ser um mecanismo de regulação gênica também nesta espécie, e que WARP seja, provavelmente, um de seus alvos de regulação. Esta é a primeira vez que a proteína WARP é detectada tão prematuramente durante o desenvolvimento de oocinetos e a primeira evidência de expressão dos genes DOZI, α-Tubulina e MAOP em P. gallinaceum. / During the life cycle of malaria parasites, one of the most crucial phases is the sexual development and the consequential midgut invasion of the invertebrate host. Proteins from stages of sporogonic cycle could be target for Transmission Blocking Vaccines (TBVs). One of the micronemal proteins that has already been shown as a promising target for inhibiting oocysts development, and therefore transmission, is the von Willebrand Factor A Related Protein (WARP), a secreted ookinete protein thought to be involved in parasite adhesion and locomotion. Recent studies have demonstrated that WARP is subjected to repressed translation in macrogametocytes of P. berghei, with its mRNA being silenced by the DOZI protein through the formation of a ribonucleoprotein. The goals of this study were i) to analyze the expression profile of the WARP protein during sexual stages of P. gallinaceum, ii) to compare WARP’s transcription profile, during sexual development, with other genes involved in regulation of expression or midgut invasion, and iii) to evaluate the potential deployment of the WARP protein as a vaccine candidate based on its expression pattern. The vWA domain from PfWARP was produced as a recombinant protein that was used to raise polyclonal antibodies. Confocal microscopy was carried out using these antibodies to detect WARP in cultured Plasmodium gallinaceum sexual stages. RT-PCR was used to detect WARP and the other studied genes from samples of blood containing gametocytes and from infected midguts of Aedes fluviatilis mosquitoes up to 24 hours post feeding. The WARP protein can be detected since the early stages of ookinete development, in newly fertilized zygotes, up to the mature palmate-shaped forms. In zygotes it appears to have an intra-vesicular expression and to be located in the cytoplasm’s periphery in close proximity to the cellular membrane, and in the mature ookinetes, WARP presents an intracellular granular distribution with focal concentration towards the apical end, corroborating its micronemal localization. Its transcript was detected in P. gallinaceum gametocytes by using RT-PCR. Also, the transcript for the PgDOZI protein was detected in gametocytes, indicating that repressed translation might be a gene expression regulating mechanism for this species also, and that WARP might be one of the targets. This is the first time that the protein WARP is detected so early in ookinete development, and it is the first evidence for the expression of DOZI, α-Tubulin and MAOP in P. gallinaceum.