Th.--Pharm.--Paris 5, 1982. N°: 80.

No description available.

En 1971, Le Dr. Américain Judah Folkman a publié une hypothèse selon laquelle la croissance tumorale dépendait de l'angiogenèse. Le défit des recherches actuelles est de trouver un moyen pour affamer la tumeur en inhibant son angiogenèse. L'angiogenèse est un processus physiologique complexe qui fait intervenir de nombreux récepteurs, parmi lesquels se trouve le récepteur du mannose-6-phosphate / Insulin-like growth factor II (RM6P/IGFII). Le but de ce travail a donc consisté en la synthèse de nano-objets mannosylés et de nouveaux analogues du Mannose-6-Phosphate (M6P) puis en l'évaluation de leur activité angiogénique par la méthode de la « CAM » sur des embryons de poulet et dans le modèle des explants d'aorte de rat. Dans un premier temps des nanoparticules d'or ont été préparées, fonctionnalisées avec les dérivés du M6P ayant montré des résultats intéressants au cours de travaux antérieurs réalisés au sein du laboratoire. Par la suite des analogues originaux tels que un borate, un acide boronique, un pyrophosphate, un pyrophosphonate ainsi que l'analogue rétroisotère du M6P ont été synthétisés. D'autre part, il a été montré que le RM6P/IGFII pouvait lier deux molécules de M6P ou une molécule d'oligosaccharide diphosphorylée par monomère. De ce fait, des molécules bidentées, des composés de type bolaforme et des trisaccharides difonctionnalisés ont été élaborés puis leur activité biologique a été valuée. / In 1971, the American Dr. Judah Folkman published the hypothesis : tumor growth depends on angiogenesis. The challenge of current research is to find a way to starve tumors by inhibiting angiogenesis. Angiogenesis is a complex physiological process that involves many receptors, among which is the receptor for mannose-6-phosphate / Insulin-like growth factor II (RM6P/IGF-II). The aim of this work was the synthesis of mannosyl nano-devices and new analogues of Mannose-6-Phosphate (M6P). Evaluation of their angiogenic activity was made by the 'CAM essay' on embryo of chicken and in the model of the explantations of rat's aorta. First, gold nanoparticles functionnalized with M6P analogues were prepared. Those analogues have been chosen among the most interesting candidates as described previously in our laboratory. Secondly, original analogues such as a borate, a boronic acid, a pyrophosphate, a pyrophosphonate as well as the retroisotere analogue of the M6P were synthetized. The RM6P/IGFII can bind two molecules of M6P or a diphosphoryled oligosaccharide molecule by monomer (receptor). Therefore, bidentate molecules, difunctionnalized bolaform compounds and difunctionnalized trisaccharides were synthesized and their biological activity evaluated.

Le récepteur cation-indépendant du mannose-6-phosphate (CI-RM6P) est une glycoprotéine transmembranaire impliquée dans de nombreux processus biologiques comme le transport des enzymes lysosomales vers les lysosomes et aussi dans le phénomène connu comme l’angiogenèse. Les analogues du M6P se sont avérés être des effecteurs de l’angiogenèse tumorale. La synthèse des nouveaux dérives bidentés, fonctionnalisés avec des analogues du M6P, ouvre la voie à une nouvelle méthode pour isoler le CI-RM6P.Ces “antennes biologiques” seront ainsi utilisées pour étudier leurs affinités vis-à-vis du CI-RM6P. En perspective, une nouvelle classe de dérivés de Sepharose, fonctionnalisée par nos ligands bidentés, vont être générée pour leurs emplois dans les traditionnels techniques de purifications des protéines. / The cation-indipendent mannose-6-phosphate receptor (CI-MPR) is a trans membrane glycoprotein implicated in numerous biological processes such as the transporting of the lysosomal enzymes to the lysosomes and in the phenomenon known as angiogenesis.The analogues of M6P have proven themselves to be effectors of tumour angiogenesis.The synthesis new bidentates derivatives, functionalised with analogues derivatives of M6P, opens the way to a new method to isolate the CI-MPR.These “biological antennae” will be used to study binding affinity with the receptor CI-MPR. In prospective, a new class of Sepharose derivatives, functionalised with ours bidentates ligands, will be generated to be used in the traditional technique of purifying proteins.

L'un des défis des recherches actuelles réside dans l'élaboration d'outils pharmacologiques capables de juguler la croissance tumorale en ciblant spécifiquement son angiogenèse. L'angiogenèse est un processus physiologique complexe qui fait intervenir de nombreux récepteurs, parmi lesquels se trouve le récepteur du mannose 6-phosphate/insulin like growth factor II (M6-P/IGFII). Des travaux antérieurs effectués au laboratoire ont montré que des molécules analogues du M6P sont des effecteurs d'angiogenèse mais qu'au cours de leur administration, ces composés sont facilement éliminés car trop hydrophiles. Afin d'obtenir des analogues du M6P plus lipophiles nous avons remplacé le méthyle en position anomère par d'autres chaines plus longues. Nous présentons, au cours de cette thèse, la synthèse d'analogues du mannose 6-phosphate et l'évaluation de leur activité angiogénique par la méthode « CAM». / One of the challenges of the current research is to develop pharmacological tools able to curb tumor growth by specifically targeting the angiogenesis. Angiogenesis is a complex physiological process that involves a large number of receptors, among which the mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II (M6-P/IGF-II) receptor. Previous work conducted in the laboratory has shown that analogues of M6P are effectors of angiogenesis but during administration, these compounds are easily removed due to their hydrophilicity. To increase the lipophilicity of the M6P analogues, we replaced the methyl in position anomeric by other longer chains.We present in this manuscript, the synthesis of mannose 6-phosphate analogues and the evaluation of their angiogenesis activity by the “CAM assay”.

Candida albicans est une levure saprophyte présente dans la flore digestive humaine. Elle peut néanmoins devenir pathogène chez des individus immunodéficients et causer des infections sévères associées à de forts taux de mortalité. La paroi de C. albicans, en contact avec l’hôte, contient des β-1,2 oligomannosides (β-Man) liés à de multiples molécules pariétales telles que le phospholipomannane (PLM) ou le phosphopeptidomannane (PPM). Ces β-Man sont présents dans les espèces les plus pathogènes de Candida (principalement C. albicans, mais également C. glabrata et C. tropicalis) et sont considérés comme des facteurs de virulence. L’identification d’une famille de 9 gènes codant pour des β-mannosyltransférases (CaBmt) a permis une meilleure compréhension du rôle de 6 de ces enzymes. Des études de génétique inverse ont montré que la β-1,2-mannosylation du PPM était assurée par les enzymes CaBmt1 à 4, tandis que CaBmt5 et 6 étaient impliquées dans celle du PLM. Une première enzyme responsable de l’initiation de la β-mannosylation du PPM, CaBmt1, a donc été caractérisée dans l’équipe grâce à l’étude de l’activité d’une forme recombinante soluble.L’objectif de cette thèse est de caractériser l’activité et la structure de CaBmt3, l’enzyme qui initie la polymérisation des β-Man suite à l’action de CaBmt1, pour mieux comprendre le mécanisme catalytique des β-1,2-mannosyltransférases. Ainsi, nous avons précisément identifié le substrat accepteur de CaBmt3 et défini ses paramètres enzymatiques. Par une approche combinant la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS), la modélisation moléculaire in silico et la mutagenèse dirigée de protéines recombinantes, nous proposons un modèle structural et catalytique de CaBmt3 qui pourrait être étendu à l’ensemble de la famille. En parallèle, nous avons montré que des iminosucres mono- et multivalents étaient capables de moduler l’activité des β-mannosyltransférases. Enfin, nous avons amorcé le travail sur une dernière enzyme, CaBmt4, qui est susceptible de polymériser le β-Man initié par CaBmt1 et CaBmt3. Pour conclure, ces travaux offrent une meilleure compréhension de la β-mannosylation du PPM de C. albicans. Ces études fonctionnelles, couplées aux avancées structurales, pourraient conduire à l’élaboration d’inhibiteurs de CaBmt et développer ainsi de nouvelles approches thérapeutiques contre les candidoses invasives. / Candida albicans is a saprophytic yeast of human gastro-intestinal tract. It can however become pathogenic in immunocompromised individuals and cause severe infections associated with high mortality rates. The cell wall of C. albicans, in contact with the host, contains β-1,2 oligomannosides (β-Man) linked to several parietal molecules such as phospholipomannan (PLM) and phosphopeptidomannan (PPM). These β-Man are found in the most pathogenic Candida species (primarily C. albicans, but also in non-albicans species such as C. glabrata and C. tropicalis) and are considered as virulence factors. The identification of a family of 9 genes coding for β-mannosyltransferases (CaBmt) led to a better understanding of the role of 6 of these enzymes. Reverse genetics studies showed that CaBmt1-4 were responsible for the β-1,2-mannosylation of PPM, whereas CaBmt5-6 were involved in the β-1,2-mannosylation of PLM. A first enzyme responsible for the initiation of the PPM’s β-mannosylation, CaBmt1, was characterized in the lab by studying the activity of its recombinant soluble form.The goal of this thesis is to characterize both activity and structure of CaBmt3, the enzyme initiating β-Man polymerization following CaBmt1’s activity, in order to further the understanding of β-1,2-mannosyltransferases catalytic mechanism. Thus, we precisely identified CaBmt3 acceptor substrate and characterized its enzymatic parameters. Combining small angle X-ray diffraction (SAXS), in silico molecular modelization and site-directed mutagenesis of recombinant proteins, we propose a structural and catalytic model of CaBmt3 which could be extended to the whole family. In parallel, we showed that mono- and multivalent iminosugars were able to modulate β-mannosyltransferases activity. Finally, we started to work on one last enzyme, CaBmt4, which could potentially polymerize the β-Man initiated by CaBmt1 and CaBmt3.In conclusion, the synthesis of these investigations offers a better understanding of the β-mannosylation processes occurring on the PPM of C. albicans. Functional studies, in conjunction with structural advances could ultimately lead to the development of CaBmt inhibitors in order to design new therapeutic approaches for the management of invasive candidiasis.

La maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique de l’intestin qui peut être expliquée par une dysbiose et une dérégulation de la réponse immunitaire. La mannose-binding lectin (MBL), récepteur lectinique et les Toll-like récepteurs jouent un rôle crucial dans la défense contre les pathogènes et dans le développement de la réponse inflammatoire. Ils peuvent reconnaitre de nombreux micro-organismes dont Candida albicans. Cette levure commensale est un immunogène des anticorps anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA), anticorps utilisés dans le diagnostic de la MC. Une association entre un déficit en MBL et des taux élevés d’ASCA a été montrée chez les patients atteints de MC. Ce déficit en MBL est fréquemment associé à un phénotype sévère de la maladie. Le récepteur TLR2, associé à TLR1 ou à TLR6, est également impliqué dans la reconnaissance de C. albicans et le maintien de la barrière intestinale. L’objectif de ce projet a été d’étudier le rôle de la MBL et des récepteurs TLR2/TLR1/TLR6 dans l’homéostasie intestinale et l’élimination de C. albicans du tube digestif. Pour cela, nous avons exploré, les effets de la MBL et des TLR sur la colonisation intestinale à C. albicans et l’inflammation intestinale. Par ailleurs, nous avons déterminé, chez l’homme, l’influence des polymorphismes du gène MBL2 sur la modulation de l’activité et des taux de MBL au cours de la MC.A l’aide d’un modèle murin, nous avons mis en évidence l’expression de MBL-A et de MBL-C par les cellules épithéliales intestinales et leur implication dans l’homéostasie intestinale. Un déficit en MBL favorise la colonisation par C. albicans et une dissémination de la levure, en présence d’une colite chimio-induite. Les récepteurs TLR1 et TLR2 participent également dans la défense contre la colonisation par C. albicans, sans pour autant que leurs déficits n’entrainent de dissémination de la levure. A l’inverse, le récepteur TLR6 favorise la colonisation par C. albicans. La MBL et les récepteurs TLR1/TLR2/TLR6 régulent aussi l’expression des cytokines pro-inflammatoires impliquées dans les réponses Th1 et Th17. Ces résultats expérimentaux ont incité à envisager la poursuite de notre travail en approfondissant l’étude clinique sur des variations quantitatives et qualitatives de la MBL chez les patients atteints de MC et leur lien éventuel avec la persistance de l’inflammation intestinale. L’étude sur la cohorte de patients MC a montré que le gène MBL2 était associé à un déficit quantitatif en MBL et un déficit qualitatif du complexe MBL-MASP chez les sujets sains et les patients. Ce polymorphisme est également associé à des taux élevés d’ASCA chez les patients MC (p<0.05) de la maladie et il est fréquemment associé aux formes sévères de la maladie. De plus, le variant rs2066844 du gène NOD2, variant associé à la MC, est significativement corrélé à une diminution de l’activité fonctionnelle du complexe MBL-MASP, sans diminution quantitative des taux de MBL.Ces données montrent, pour la première fois, la production intestinale de MBL, qui est modulée par la colonisation par C. albicans. Elles confirment le rôle de la MBL et des récepteurs TLR dans l’homéostasie intestinale et dans la défense contre C. albicans. De plus, l’étude clinique sur la cohorte de patients MC révèle un défaut d’activité fonctionnelle du complexe MBL-MASP chez les patients MC ayant des polymorphismes des gènes MBL2 et NOD2, pouvant mener à un phénotype sévère de la maladie. Ces études expérimentales et cliniques apportent des nouvelles données sur le lien entre les récepteurs de l’immunité innée et la maladie de Crohn ainsi que la colonisation/infection fongique et ouvrent des nouvelles perspectives sur le lien entre la persistance de la colonisation fongique et le déficit quantitatif/qualitatif de la MBL chez les patients MC. / Crohn’s disease (CD) is an inflammatory bowel disease characterized by a dysregulation of the inflammatory response caused by dysbiosis and immune system disorders. Mannose Binding Lectin (MBL) and Toll like receptors (TLR) are involved in recognition of microorganisms and inflammatory response. They can recognize different patterns on the surface of the pathogens including Candida albicans. This pathogenic yeast is an immunogen for anti-Saccharomyces cerevisiae antibody (ASCA), diagnostic marker of CD. An association between MBL-deficiency and ASCA is observed in CD, and this MBL deficiency is frequently associated with a severe clinical phenotype of CD. In addition to MBL, TLR2, which forms heterodimers with either TLR1 or TLR6, have a major role in the innate immune defense against C. albicans and promotes intestinal homeostasis. In this project, we studied the role of MBL, TLR1, TLR2, and TLR6 in intestinal homeostasis and elimination of C. albicans in the intestinal tract. In the first part this study; we assessed the effect of either MBL or TLR deficiencies on C. albicans colonization and intestinal inflammation in a murine model. In the second part of this study, we assessed the role of MBL polymorphisms in the modulation of MBL level and activity in CD patients.In murin model, we showed that MBL is locally produced by the epithelial cells in response to C. albicans sensing and to intestinal inflammation and this lectin is required for the intestinal homeostasis. MBL-deficient mice had a higher level of colonization than wild-type mice. DSS-induced colitis promoted a high C. albicans colonization and dissemination to the kidneys and lungs of MBL-deficient mice. MBL-deficient mice exhibited reduced expression of Il-1β and IL-6 and elevated expression of IL-17, IL-23, dectin-1 and TLR-4. In terms of mice deficient in TLRs, DSS treatment and C. albicans oral challenge induced greater weight loss, worse clinical signs of inflammation, higher histopathologic scores, and increased mortality rates in TLR1-/- and TLR2-/- mice when compared to TLR6-/- and wild-type mice. Cytokine expression (TNF, IL-1β, IL-10, and IL-17A) was significantly increased in TLR1-/- and TLR2-/- mice, while they were decreased in TLR6-/- mice. In addition to the experimental studies, we observed in the clinical cohort of CD patients that MBL2 variant rs5030737 (codon 52) was associated with a low level of MBL that leads to impaired MBL-MASP functional activities in both CD patients and healthy subjects. Furthermore, this variant was also associated with a higher level of ASCA in CD patients (p<0.05). Increased ASCA levels were found in CD patients with stricture formation and penetrating disease complications, 42% and 21% respectively. Besides, we observed that NOD2 variant rs2066844, associated with susceptibility to CD, is significantly correlated with the impairment of the functional activity of MBL-MASP complex.Overall, this study emphasizes the role of MBL and TLR in intestinal homeostasis and host defense against C. albicans and shows for the first time that MBL could be produced locally in the intestinal epithelial cells in response to C. albicans sensing. In terms of the clinical study, we observed that CD patients with a severe clinical phenotype have an impairment in MBL-MASP functional activity, and that this defect is associated with MBL2 and NOD2 polymorphisms These experimental studies contribute to understand the link between innate immunity receptors, Crohn’s disease and fungal colonization/infection. Finally, this study leads to new objectives which are to study the link between intestinal microbiota and MBL variation in Crohn’s disease patients.

L’angiogenèse, est le garant de l’intégrité vasculaire, grâce à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir des préexistants. Cette néovascularisation est régulée par des facteurs angiogéniques. Plusieurs stimuli participent au déséquilibre de la balance angiogénique, une vascularisation anormale en résulte. L’intérêt des thérapies actuelles est de restaurer une vascularisation normale, par ciblage des facteurs impliqués dans le processus angiogénique. Il fut démontré que le RM6P-CI est partie prenante dans ce mécanisme. Il a la particularité d’interagir avec plusieurs ligands, dont le M6P et ses dérivées.Il est question de savoir si le M6A, un dérivé isostère du M6P, se lie au RM6P-CI. Pour cela, le test CAM légèrement modifié, a été réapproprié pour confirmer premièrement l’activité pro-angiogénique du M6A. Deuxièmement la technique de cytométrie en flux est utilisée pour mettre en évidence l’interaction entre le M6A et le RM6P-CI. / Angiogenesis is the protector of vascular integrity, through the formation of new blood vessels from pre-existing vessels. The angiogenesis is regulated by the angiogenic factors. Several stimuli are involved in the angiogenic balance’s destabilization, which produces an unusual vascularization. The interest of conventional and targeted therapies is to restore a normal vascularization, by targeting all the factors which are involved in the angiogenic process. It has been demonstrated that the CI-M6PR is involved in this mechanism. This receptor has the distinction of having more binding sites, so a variety of ligands, including the M6P and its analogs. During this study we want to know if the M6P, isostere analog of M6P, interacts with the CI-M6PR. For this, we reappropriated the assay CAM, slightly modified, to confirm at first the pro-angiogenic activity of M6A. In a second step we will use the flow cytometry technique to highlight the interaction between the M6A and CI- M6PR.

An increase in attachment of SRBCs to Procambarus clarkii hemocytes has been shown after the crayfish were injected with a live or killed Pseudomonas strain RS2b. The increase in attachment occurred at 8 hours post injection and peaked at 24 hours for both experimental groups. The population of hemocytes with receptors for LPS and mannose also increased at 8 hours post injection and peaked at 24 hours for both experimental groups. At 96 hours post injection the number of receptor bearing hemocytes and hemocytes bound to SRBCs began to decrease to the level of the control for both groups. The protein concentration of hemolymph from the experimental groups remained stable at 8 and 24 hours post injection and increased at 96 hours. The correlation of the protein concentration increase at 96 hours with the decrease of receptor bearing hemocytes may be due to the degranulation of the receptor bearing hemocytes.

Tuberculosis (TB) is an important cause of morbidity and mortality worldwide. The high incidence is still found in Taiwan. There is strong evidence that host genes influence individual susceptibility to tuberculosis. Young children, like immunocompromised patients, once infected are at increased risk for TB disease and progression to extrapulmonary disease. Thus far, to identify the genes responsible for the variation in the human susceptibility/resistance to TB has remained elusive. Mannose-binding lectin (MBL) activates the complement system in an antibody-independent manner, enhances complement-mediated phagocytosis, and plays an important role in innate immunity in the regulation of inflammatory cytokine release by monocytes. It is one of the molecules that have been suggested to have a link to human susceptibility or protection against infection. According to some studies (mostly conducted in adult populations) , low levels of MBL associated with variant alleles at the promoter and exon 1 regions of MBL protect against tuberculosis. Other investigators instead claim that protection against the disease is associated with high levels of MBL. In this study we aimed to investigate the relationships between the susceptibility to TB and MBL gene polymorphisms in children with cervical mycobacterial lymphadenitis infected by M. tuberculosis.139 case patients with cervical mycobacterial lymphadenitis and 102 unrelated healthy control subjects were tested by real-time PCR for polymorphisms at the promoter and the exon 1 regions of the MBL gene. Diagnosis of mycobacterial lymphadenitis infected by M. tuberculosis, based on findings of pathological examination of the lymph nodes, was confirmed by acid-fast stain and TB PCR.The frequency of A allele was significantly higher in TB+ patients compared with TB- controls (82.7% vs 72.6%; odds ratio 1.813; p=0.007). The frequency of high-producer MBL2 genotypes (A/A) was higher in TB+ patients than in TB- subjects (70.5% vs 45.1%, odds ratio 2.91, p<0.001), while patients carried the B alleles (A/B and B/B) that have decreased levels of MBL was inversely associated with mycobacterial infectivity (29.5% vs 54.9%; odds ratio 2.910; p<0.001). The frequencies of MBL promoter -550 genotypes also revealed a significant difference between TB+ and TB- groups (p = 0.046), but in contrast, with significantly higher frequency of L/L genotype (of low MBL level) in TB+ patients (34.5% vs 21.6%; odds ratio 1.918; p=0.029). The frequencies of MBL promoter -221 genotypes (X and Y) was similar in TB+ and TB- groups.This study supports the conclusion that MBL can protect or predispose the host to tuberculosis, depending on the host¡¦s haplotype pair.