Le vieillissement de l'organisme prédispose à de nombreuses pathologies chroniques telles que l'insuffisance cardiaque (IC). Des études récentes ont montré que l'accumulation de cellules sénescentes dans les organes au cours du vieillissement est associée à l'apparition de ces pathologies. La sénescence cellulaire a initialement été décrite comme un arrêt stable du cycle cellulaire permettant de limiter la prolifération des cellules dont l'ADN est endommagé. Ce processus s'accompagne de profondes modifications de la fonction cellulaire, avec notamment l'acquisition d'un phénotype sécrétoire associé à la sénescence. La sénescence peut être induite par un raccourcissement des télomères ou par l'exposition à des signaux de stress, tels que le stress oxydant ou l'irradiation, qui entrainent l'activation de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN et l'expression des gènes suppresseurs de tumeurs (p16INK4a, p21CIP1, p53). Ces inhibiteurs du cycle cellulaire sont classiquement utilisés comme marqueur de sénescence car leur expression augmente de manière ubiquitaire au cours du vieillissement. Toutefois, ces marqueurs ne sont pas spécifiques du tissu concerné et un des objectifs de ma thèse a été d'identifier de nouveaux marqueurs de sénescence tissu-spécifiques qui pourraient caractériser un vieillissement cardiaque pathologique. Le vieillissement cardiaque se caractérise par une hypertrophie des cardiomyocytes, une sensibilité accrue au stress et une prédisposition à l'IC. Les cardiomyocytes étant des cellules post-mitotiques, les mécanismes de sénescence mis en jeu, les marqueurs associés et leur rôle potentiel dans l'IC demeurent à l'heure actuelle peu caractérisés. Au cours de ce travail de thèse nous avons donc entrepris : 1) d'étudier le rôle des télomères et des dysfonctions mitochondriales dans l'induction de la sénescence du cardiomyocyte et 2) d'identifier des marqueurs spécifiques. Nous avons tout d'abord montré que les cardiomyocytes de souris âgées expriment les marqueurs classiques de la sénescence comme p16INK4a, p53 et p21CIP1. Concernant les mécanismes inducteurs, nous avons étudié l'implication des dommages télomériques (telomere associated foci, TAF). Au cours du vieillissement, nous avons observé une augmentation du nombre de TAFs par cardiomyocytes en association avec l'hypertrophie. De plus, l'induction de TAFs in vitro est suffisante à l'activation de la voie de sénescence p53/p21CIP1 et l'hypertrophie dans une lignée de cardiomyoblastes H9c2. La formation des TAFs est augmentée chez des souris avec une dysfonction mitochondriale et est associée à l'activation des voies p53/p21CIP1. Par ailleurs, les cardiomyocytes âgés présentent une dérégulation des gènes impliqués dans la biologie mitochondriale pouvant rendre compte de l'augmentation des TAFs. Par l'analyse haut débit du transcriptome (RNAseq) nous avons identifié six nouveaux gènes qui sont surexprimés dans les cardiomyocytes sénescents (Prom2, Kcnk1, Pah, Edn3, Gdf15, Tgfb2). La comparaison d'expression de ces gènes dans le cœur avec d'autres tissus et avec le stroma cardiaque lors vieillissement a permis de confirmer la spécificité d'expression de ces marqueurs au niveau des cardiomyocytes. Nous avons validé cette signature dans deux modèles in vitro de sénescence induite par le stress et démontré que l'expression de certains de ces marqueurs est dépendante de la voie p53. De plus, l'expression de Prom2 est associée à l'hypertrophie des cardiomyocytes. En conclusion, nous avons démontré, qu'avec le vieillissement, les cardiomyocytes présentent un programme de sénescence associé à une dysfonction mitochondriale et une augmentation des TAFs. Cette sénescence se caractérise par l'activation des voies classiques de sénescence (p16INK4, p53/p21CIP1), une hypertrophie et l'acquisition d'une signature spécifique. Ces marqueurs offrent de nouvelles perspectives dans la compréhension de la sénescence cardiaque et dans son implication potentielle dans l'IC. / Ageing of the organism is associated with several chronic pathologies such as heart failure (HF). Recent studies have demonstrated the link between the accumulation of senescent cells during ageing and age-associated diseases. Cellular senescence, originally defined as a stable cell cycle arrest, acts as a tumorigenic repressor by limiting the proliferation of DNA damaged cells. Despite this protective effect, senescence is characterized by deep remodeling of cell biology which drives functional disorders, such as the acquisition of a senescence-associated secretory phenotype (SASP). Senescence can be induced by telomeric attrition and by exposition to cellular stress signals such as oxidative stress or irradiation, which induce telomeric damage, activation of the DNA Damage Response (DDR) and increased expression of antitumoral genes (p16INK4a, p21CIP1, p53). These genes are classically used as markers of senescence because their expression increases in several tissues during ageing but they are not tissue-specific. Therefore, At the cardiac level, ageing is characterized by cardiomyocytes hypertrophy, increased sensitivity to stress and highest risk of developing HF. Cardiomyocytes are post- mitotic cells and the senescence inductor mechanisms, specifics markers and their role in HF remains poorly understood. This thesis project is articulated around two aims, 1/ studying the role of telomeric damages and mitochondrial dysfunction in triggering cardiomyocyte senescence and 2/ identification of specifics markers. Fisrtly, we shown that aged cardiomyocytes overexpress classic markers of senescence such as p16INK4a, p53 et p21CIP1. Concerning the inductors mechanisms, we studied the implication of telomeric damages (telomere associated foci, TAF). During ageing, we found an increased number of TAFs per cardiomyocytes and their association with hypertrophy. Moreover, TAF- induction in cardiac H9c2 in vitro activated the p53/p21 pathway and induced senescence. These data confirmed the role of TAFs in cardiomyocyte senescence induction. Furthermore, aged cardiomyocytes exhibit a global alteration of genes involved in mitochondrial biology, oxidative stress and metabolism in aged cardiomyocytes that could play a prominent role in TAF accumulation with ageing. In a second part of the study, by using a next generation sequencing method (RNA-seq) we identified 6 new genes highly expressed in senescent cardiomyocytes (Prom2, Kcnk1, Pah, Edn3, Gdf15 and Tgfb2). Expression comparison with other senescent organs and cardiac stromal cells confirmed these new genes as cardiomyocyte specific. Thanks to an in vitro approach, we validate this signature by using different models of stress-induced senescence in cardiac H9c2 cells and demonstrated the implication of the p53 in the regulation of some of these genes. Moreover, Prom2 expression is associated with cardiomyocytes hypertrophy. In conclusion, we demonstrated that, with ageing, cardiomyocytes display a senescence phenotype associated with mitochondrial dysfunction and TAFs. This process is characterized by classic markers (p16INK4, p53/p21CIP1), hypertrophy and new identified signature. These new markers offer innovative perspectives in the understanding and the identification of the cardiac senescence and their potential deleterious role in heart failure.

Les champignons mycorhizien à arbuscules (CMA) sont des organismes pouvant établir des symbioses avec 80% des plantes terrestres. Les avantages d'une telle symbiose sont de plus en plus caractérisés et exploités en agriculture. Par contre, jusqu'à maintenant, il n'existe aucun outil permettant à la fois l'identification et la quantification de ces champignons dans le sol de façon fiable et rapide. Un tel outil permettrait, entre autres, de mieux comprendre les dynamiques des populations des endomycorhizes dans le sol. Pour les producteurs d'inoculum mycorhiziens, cela permettrait également d'établir un suivi de leurs produits en champs et d'avoir un contrôle de qualité de plus sur leurs inoculants. C'est ce que nous avons tenté de développer au sein du laboratoire du Dr. Hijri. Depuis environ une trentaine d'années, des outils d'identification et/ou de quantification ont été développés en utilisant les profiles d'acides gras, les isozymes, les anticorps et finalement l'ADN nucléaire. À ce jour, ces méthodes d’identification et de quantification sont soit coûteuses, soit imprécises. Qui plus est, aucune méthode ne permet à la fois la quantification et l’identification de souches particulières de CMA. L’ADN mitochondrial ne présente pas le même polymorphisme de séquence que celui qui rend l’ADN nucléaire impropre à la quantification. C'est pourquoi nous avons analysé les séquences d’ADN mitochondrial et sélectionné les régions caractéristiques de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA). C’est à partir de ces régions que nous avons développé des marqueurs moléculaires sous forme de sondes et d’amorces TaqMan permettant de quantifier le nombre de mitochondries de chacune de ces espèces dans un échantillon d’ADN. Nous avons ensuite tenté de déterminer une unité de quantification des CMA, soit un nombre de mitochondries par spore. C’est alors que nous avons réalisé que la méthode de préparation des échantillons de spores ainsi que la méthode d’extraction d’ADN avaient des effets significatifs sur l’unité de quantification de base. Nous avons donc optimisé ces protocoles, avant d’en e tester l’application sur des échantillons de sol et de racines ayant été inoculés avec chacune des deux espèces cibles. À ce stade, cet outil est toujours semi-quantificatif, mais il permet 9 l’identification précise de deux espèces de CMA compétentes dans des milieux saturés en phosphore inorganique. Ces résultats , en plus d’être prometteurs, ont permis d’augmenter les connaissances méthodologiques reliées à la quantification des CMA dans le sol, et suggèrent qu’à cause de leurs morphologies différentes, l’élaboration d’un protocole de quantification standardisé pour toutes les espèces de CMA demeure un objectif complexe, qui demande de nouvelles études in vivo. / Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) are able to form symbiosis with approximately 80% of plant species, including most important corps. This symbiosis is known as Arbuscular Mycorrhiza which has been largely used in agriculture to promote plant growth by enhancing minerals uptake and protecting plants against biotic and abiotic stresses. Despite the ecological and economical importance of this symbiosis, specific markers for spore quantification of commercial AMF strains by quantitative real-time PCR (qPCR) are extremely limited and none has been rigorously validated for quality control of manufactured products such as biofertilizers. Most of the existing AMF markers developed either for AMF identification or for AMF quantification purposes are based on either morphological characters, on Fatty Acids Methyl Esters (FAME) profiles, on specific isozymes or antibodies, or on nuclear DNA. It has been shown that mitochondrial (mt) genomes are conserved among AMF species. This allowed us to use mt genomes in order to develop efficient isolate-specfic markers. Using the alignments of 11 complete AMF mt genomes, a qPCR assay using a hydrolysis probes designed in the single copy cox3-rnl intergenic region was tested and validated to specifically and accurately quantify the spores of the model R. irregularis isolate DAOM197198 and another probe was designed in nad1-cox2 intergene specific to Glomus cerebriforme. The specificity tests performed, using standard PCR and qPCR, clearly showed that the primers specifically amplified the isolate DAOM-197198 or Glomus cerebriforme DAOM220722. Quantification assays were successfully undertaken on unknown samples in liquid suspensions, commercial solid formulations and soil samples to show the accuracy and reproducibility of the assays. This study provides a powerful molecular toolkit specifically designed to quantify spores of the model AMF isolate Glomus cerebriforme DAOM220722. The latter could be applied to other AMF taxa and will be useful to research institutions and governmental and industrial laboratories running routine quality control of AMF-based products.