La règlementation européenne requiert l’évaluation de la reprotoxicité des ingrédients cosmétiques sans avoir recours aux tests sur les organismes définis par la directive européenne sur les animaux utilisés à des fins scientifiques. Pour cribler par exclusion des substances chimiques, l’industrie cosmétique a besoin de développer une méthode alternative à l’expérimentation animale prédictive et spécifique à l’identification d’agents tératogènes (substances entraînant au cours du développement embryonnaire et de manière définitive des malformations physiques et/ou fonctionnelles). Pour cela, le poisson zèbre, le poisson médaka et l’amphibien xénope aux stades embryonnaires ont été évalués sur une liste de 43 substances de référence. Le médaka a été sélectionné pour la fiabilité de son approvisionnement, la robustesse de ses stades embryonnaires lors des manipulations, ainsi que pour les performances du test l’utilisant. De plus, ce test permet de détecter les agents tératogènes les plus puissants, près de la moitié des 26 substances tératogènes de notre liste. Son taux de spécificité est fixé à 100% pour identifier correctement les 17 substances négatives dont l’absence d’effets tératogènes chez l’homme ou un organisme modèle mammifère, est avérée. Néanmoins, les performances de ce test pourraient être améliorées par son automatisation et par l’intégration de la quantification de nouveaux paramètres pour l’identification de malformations fonctionnelles. Enfin, pour prédire l’innocuité d’une substance chimique chez l’Homme, le test prédictif de tératogénicité utilisant les embryons de médaka doit être intégré dans une stratégie globale d’évaluation de la tératogénicité. / European legislation requires the assessment of reproductive toxicity of cosmetic ingredients without using tests on the organisms defined by the European directive on animals used for scientific purposes. To screen by excluding chemicals, cosmetics industry needs to develop an alternative method to animal testing, which needs to be predictive and specific in identifying teratogen agents (during embryonic development substances causing definitive physical and / or functional defects). For this, zebrafish, medaka fish and Xenopus amphibian at embryonic stages were assessed on a list of 43 reference substances. Medaka has been selected to the reliability of its supply, the robustness of its embryonic stages during handling, as well as for performance of its test. In addition, this test can detect the most potent teratogen agents, nearly half of the 26 teratogens of our list. Its specificity rate is set at 100% for correctly identifying 17 negative substances for which the absence of teratogenic effects is proved in humans or mammalian model organism. However, the performance of this test may be improved by its automation and integration of new quantification parameters for the identification of functional defects. Finally, to predict the safety of a chemical in humans, the predictive teratogenicity test using medaka embryos must be integrated into a comprehensive strategy for assessing the teratogenicity.

Orientador: Rafael Henrique Nóbrega / Resumo: A decisão se a gônada indiferenciada irá se desenvolver em um testículo ou um ovário é uma etapa crítica na diferenciação sexual dos vertebrados. Este processo consiste em uma complexa cascata gênica que culmina na diferenciação das células somáticas presente na gônada indiferenciada. Neste sentido, o hormônio anti-Mülleriano é um importante efetor nesta decisão. Estudos com o peixe medaka mutante hotei, no qual o receptor do Amh tipo 2 (amhrII) é mutado, mostram elevado índice gonadossomático, e reversão sexual de macho para fêmea. Com base nestas informações, acredita-se que o Amh possa regular o número de células germinativas e diretamente ou indiretamente este fato pode influenciar na decisão da gônada bipotencial em se tornar um testículo ou ovário. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi de se avaliar a sinalização do Amh durante a diferenciação sexual no medaka. Para tanto, estudos de perda de função gênica foram empregados, no qual o gene amh foi deletado através do sistema CRISPR/Cas9. Também foi avaliada a expressão dos genes que atuam na janela de diferenciação sexual por RT-qPCR. Inicialmente, identificamos dois tipos de mutação nos animais heterozigotos (amh (-/+) da F1. A mutação mais interessante foi a deleção de 759 pares de base entre os exons 6 e 7 que compreende parte dos domínios Amh_N e TGF-β. Na geração F2, os mutantes homozigotos amh (-/-) machos XY apresentaram 100% de reversão sexual para fêmeas fenotípicas. Além disso os animais amh (-/-) ap... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The decision whether the undifferentiated gonad will develop in a testicle or an ovary is a critical step in the sexual differentiation of vertebrates. This process consists of a complex genetic cascade that culminates in the differentiation of the somatic cells present in the undifferentiated gonad. In this context, the anti-Müllerian hormone is an important effector in this decision. Studies with the medaka hotei fish, in which the Amh type 2 receptor (amhrII) is mutated, show high gonadosomatic index, and sexual reversion from male to female. Based on this information, it is postulated that the Amh regulates the number of germ cells, and directly or indirectly this fact may influence the decision of the bipotential gonad to become a testicle or ovary. Therefore, the objective of the present study was to evaluate the signaling of Amh during sexual differentiation in medaka. For that, studies of loss of gene function were employed, in which the amh gene was deleted through the CRISPR / Cas9 system. We also evaluated the expression of genes that act in the window of sexual differentiation by RT-qPCR. We initially identified two types of mutation in F1 heterozygous (amh -/+) animals. The most interesting mutation was the deletion of 759 base pairs between exons 6 and 7 which comprises part of the Amh_N and TGF-β domains. In the F2 generation, the homozygous amh (-/-) mutants XY males presented 100% of sexual reversion. In addition, the amh (-/-) animals presented gonadal hyper... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Comment la taille d'un organisme est-elle régulée au cours du développement embryonnaire ? Quels sont les mécanismes génétiques à l'origine de l'arrêt de la prolifération pendant la croissance d'un organisme pluricellulaire ? Afin d'identifier des acteurs de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement, mon travail s’est orienté sur l’étude de gènes suppresseurs de tumeurs pendant la croissance du toit optique (TO) du médaka Oryzias latipes. Le TO, structure dorsale du cerveau moyen des Vertébrés, est un modèle particulièrement adapté à l’étude de la régulation de la prolifération. Trois zones de la marge vers le centre du TO sont discernables : une zone périphérique de prolifération, une zone intermédiaire de cellules sortant du cycle cellulaire et une zone centrale de cellules différenciées. Un crible d'expression par hybridation In Situ a été réalisé et a permis d'identifier 28 gènes exprimés dans le TO, suggérant leur implication dans le contrôle de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement. Dans le but de caractériser in vivo la fonction de gènes issus de ce crible, le gène BTG1 (B-cell Translocation Gene 1) et les membres de sa famille, ont été étudiés au cours du développement du médaka. J’ai mené des expériences fonctionnelles sur BTG1, permettant de mettre en évidence son rôle central pour la morphogenèse du système nerveux central. De plus, une autre partie de mon travail s’est penchée sur l’étude de l’expression des membres de la voie de signalisation Hippo, bien connue et caractérisée chez la drosophile et les Mammifères pour son rôle dans le contrôle de la taille des organes via une régulation de l’arrêt de la prolifération. A l’issu de notre travail, une fonction de la voie de signalisation Hippo dans la formation du TO et des somites a pu être mise en évidence au cours du développement du médaka. / How is an organisms’ size regulated during embryonic development? What are the genetic mechanisms that control the proliferation arrest during multicellular organisms growth? In order to identify a cell cycle exit developmental actor genes, I have analysed the role of tumor suppressor genes (TSGs) in the optic tectum (OT) of the medaka Oryzias latipes. This structure is particularly suited for this kind of studies because, during its morphogenesis, there is a strict correlation between the position of a cell and its degree of differentiation. 3 zones can be easily distinguished from the border to the center: a marginal zone made of proliferative cells, an intermediate zone in which cells exit the cycle, and a central zone made of postmitotic cells. Using this criterium, I have performed an in situ hybridization expression screen on 150 TSGs on medaka embryos. The expression patterns of 28 TSGs in the OT suggest their implication in the OT proliferation arrest mechanisms. I focused my study on the BTG1 gene, implicated in many cancers, and for which few developmental data are available. A functional analysis on developing medaka embryos has been performed and permitted to highlight the essential role of BTG1 in central nervous system morphogenesis. Furthermore, I performed an expression study on Hippo signalling pathway components. Hippo pathway is well caracterised for its organ size control function in drosophila and Mammals. Our results show that this pathway could act in OT formation and somitogenesis in medaka fish.