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Gastroenteritis aguda por rotavirus en población infantil ingresada en unidades de lactantes de Valencia.Gutiérrez Gimeno, Mª Victoria 24 March 2009 (has links)
Esta tesis doctoral presenta los resultados obtenidos del estudio epidemiológico observacional descriptivo, de corte transversal, con componente de seguimiento prospectivo y multicéntrico sobre la gastroenteritis aguda (GEA) debida a rotavirus realizado en 3 hospitales de la provincia de Valencia representativos de los tres niveles de atención hospitalaria (H. La Fe, H. Dr. Peset, H. Lluís Alcanyís).Además de estudiar la prevalencia de la GEA por rotavirus y la incidencia de GEA nosocomial por rotavirus junto a sus características demográficas, clínicas, genotípicas y económicas también se realizó la determinación de otros virus productores de GEA como adenovirus, astrovirus y calicivirus.La población de estudio incluyó aquellos niños con edades comprendidas entre 1-23 meses ingresados en las unidades de lactantes de los centros participantes durante el periodo de estudio (Octubre-06 a Marzo-07). Se realizó el seguimiento de la población desde el ingreso hasta las 72 horas posteriores al alta y se recogieron los datos pertinentes de todos los pacientes con síntomas de gastroenteritis aguda (GEA= al menos 1 deposición líquidas o 2 semilíquidas en un periodo de 24h), así como una muestra de heces para la determinación en laboratorio centralizado (sección de virus productores de gastroenteritis del Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III) de los diferentes genotipos G y P de rotavirus mediante RT-PCR y de otros virus productores de GEA.Con los resultados incluidos en esta tesis se dispone de más datos para dar respuesta a cuántos casos de rotavirus y otros virus productores de GEA se dan en nuestro entorno, qué genotipos circulan, cuándo se producen, con qué gravedad, cuántos originamos por la hospitalización y cuánto coste económico supone entre otras preguntas importantes y necesarias a la hora de valorar un problema para poder con posterioridad resolverlo. / This doctoral thesis presents the results obtained in an epidemiological descriptive observational and multicenter study in 3 hospitals (H. La Fe, H. Dr. Peset, H. Lluís Alcanyís), with prospective follow-up on acute gastroenteritis (AGE) due to rotavirus. The centres are representative of the three levels of hospital care in the province of Valencia ( Spain).This study estimates the prevalence of rotavirus AGE and the incidence of rotavirus nosocomial AGE, the demographic and clinical characteristics, the circulating genotipes and the economic impact of the disease. At the same time, other viruses which produce AGE, such as Adenovirus, Astrovirus and Calicivirus, are identified.The study population included those children aged between 1-23 months hospitalized in the breast-fed babies units in the participant centres during the study period (October-06 to March-07). The follow-up of the population was performed from the first day of hospitalization until 72 hours after discharge, and the pertinent information was gathered for all the patients with symptoms of acute gastroenteritis (AGE = at least 1 deposition liquid or 2 in a 24h period), as well as a feces sample for the determination of the different genotypes G and P of rotavirus by RT-PCR and other viruses in a centralized laboratory (National Center of Microbiology of the Institute of Health Carlos III).With the results included in this thesis, there is more information to assess how many cases of rotavirus and other viruses producers of AGE are in our environment, what genotypes circulate, when they emerge, with what severity, how many originated in the hospital and how much economic impact is felt. These and other important and necessary questions are addressed in order to contribute to the assessment and resolution of this problem.
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Micropunción estromal anterior en la queratopatía bullosa.Francés Muñoz, Ester 16 December 2005 (has links)
Objetivos: Evaluar los efectos terapéuticos, investigar el mecanismo de acción de la micropunción estromal anterior en pacientes con queratopatía bullosa y realizar una correlación clínico-patológica en los pacientes a los que posteriormente se realice una queratoplastia. Desarrollar un modelo experimental de descompensación corneal en el conejo y estudiar en él, el efecto de la micropunción estromal anterior.Introducción .La queratopatía bullosa es una de las principales indicaciones de queratoplastia penetrante. Se caracteriza por un edema crónico y generalmente irreversible de la córnea. En las formas avanzadas se producen, debido a la deficiente función del endotelio, vesículas subepiteliales macroscópicas como consecuencia del paso de líquido hacia las capas anteriores de la córnea, quedando el fluido atrapado bajo el epitelio que es impermeable. Estas vesículas al romperse producen dolor, fotofobia y sensación de cuerpo extraño.La micropunción estromal anterior, es un procedimiento para paliar los síntomas de los pacientes que se encuentran a la espera de un transplante de córnea o para aquellos pacientes en los que por diversos motivos no está indicada la queratoplastia.Material y métodos: Realizamos la micropunción estromal anterior en 45 ojos de 45 pacientes con queratopatía bullosa. Se documentaron todos los pacientes fotográficamente previa y posteriormente al tratamiento. Se calculó el área de superficie corneal afectada por las bullas y su variación con el tratamiento. Se les realizó un cuestionario acerca del dolor y su sintomatología, antes y después del tratamiento. Se obtuvieron paquimetrías previas y posteriores a la realización de las micropunturas. En los pacientes, a los que con posterioridad se les realizó un transplante de córnea, realizamos el estudio del botón corneal, en especial de la zona de la micropuntura. En el modelo experimental, obtuvimos una descompensación corneal permanente con cloruro de benzalconio en ojos de conejo albino de laboratorio y tras realizarles una micropunción estromal anterior, los sacrificamos a intervalos de tiempo entre la primera semana y el tercer mes para estudiar el proceso evolutivo de cicatrización de la micropuntura.Resultados: La micropunción estromal anterior produce una disminución estadísticamente significativa del área de superficie corneal ocupada por las bullas (p<0.001). El análisis estadístico del cuestionario realizado a los pacientes demuestra una diferencia significativa (p<0.001), en cuanto a la mejoría de todos los parámetros que fueron evaluados: sensación de cuerpo extraño, severidad y duración de los episodios de dolor, fotofobia, requerimiento de analgésicos e insomnio. El espesor corneal se incrementó levemente. El estudio histológico de los 19 botones corneales mostró el epitelio adherido en la totalidad de las muestras aunque el grado de adhesión del epitelio al estroma era variable. En el 68% de los botones existía una adhesión muy firme mientras que en el 31% la adhesión del epitelio al estroma aparecía únicamente en las zonas de la micropunción. El tejido fibroso subepitelial, aparecía localizado en la zona de la micropunción en el 73.6 % de las muestras y en el 26 % aparecía de forma extensa. El estudio histológico en la córnea humana y en el conejo evidencia las proyecciones epiteliales en la zona de la micropunción dando lugar a anclajes temporales.Conclusiones: La micropunción estromal anterior reduce la formación de bullas y alivia el dolor en pacientes con queratopatía bullosa. / Bullous keratopathy is a corneal disease caused by endothelial decompensation secondary to multiple causes as trauma, glaucoma, endothelial dystrophy. The results are stromal edema and formation of epithelial or subepithelial bullae. Patients often suffer from pain, photophobia, epiphora and decreased vision. Penetrating keratoplasty is the treatment of choice for bullous kerathopathy. Patients awaiting keratoplasty, or patients in whom surgery is contraindicated or not eligible due to little or no potential for visual recovery, and patients with symptomatic bullous kerathopathy who have lost the motivation for another surgery after repeated graft failures are usually treated with an anterior stromal puncture to relief pain, photophobia and tearing.The use of anterior stromal puncture to treat recurrent corneal erosion is well documented. To date, the mechanisms to explain how anterior stromal puncture reduces pain and induces subepithelial fibrosis are not clear enough.We report 45 cases of bullous kerathopathy treated with anterior stromal puncture. A penetrating keratoplasty was done after in nineteen patients, as well as the histopathologic study of the corneal button.
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Anatomía funcional del tronco. Valoración dinámica mediante técnicas no invasivas de la región lumbo-pélvica en personas sanas y pacientes con historia de dolor lumbar.Sánchez Zuriaga, Daniel 20 July 2006 (has links)
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO.En la literatura se han utilizado pruebas dinámicas sobre el movimiento de flexoextensióndel tronco para distinguir de manera objetiva entre sujetos sanos y pacientescon dolor lumbar de causa inespecífica. No tenemos constancia de estudio alguno quehaya registrado de manera simultánea los patrones de movimiento lumbo-pélvico y laactividad neuromuscular de la musculatura extensora de la espalda mediante técnicas noinvasivas, y los haya comparado entre distintos grupos de pacientes con dolor lumbar yalteraciones específicas de la anatomía de la región lumbo-pélvica.MATERIAL Y MÉTODOSParticiparon 50 sujetos sin antecedentes de dolor y 50 sujetos con dolor lumbar, de entrelos cuales se obtuvieron los diferentes grupos específicos. Durante ciclos estandarizadosde flexo-extensión del tronco se analizaron, siempre mediante técnicas no invasivas:· el movimiento de la cadera y la columna lumbar, mediante un electrogoniómetro tipoIsotrak que proporciona los grados de flexión.· la actividad eléctrica del músculo erector spinae, mediante un electromiógrafoinalámbrico de superficie tipo MESPEC 4000.Todos los datos registrados estaban sincronizados. Tras procesarlos y normalizarlos, seobtuvieron una serie de variables: actividad mioeléctrica y grados de flexión lumbar yde cadera medios en cada etapa del movimiento; rangos máximos de flexión de tronco,cadera y columna lumbar; tiempos de mantenimiento de la flexión lumbar y de caderapor encima del 90% de su máximo; duración, inicio y final del fenómeno de flexiónrelajacióndel erector espinal; índices de relajación sobre la actividad mioeléctrica de laflexión, la extensión y la flexo-extensión.Se constató la normalidad de las variables mediante el test de Kolmogorov-Smirnov, yla repetibilidad en el día y entre días de las medidas mediante el Coeficiente deCorrelación Intraclase y el Error Estándar de la Medida. Para ello, diez sujetos controlrepitieron las pruebas quince días después. Las diferencias significativas entre losgrupos se obtuvieron mediante los test de t de Student independiente y ANOVA de unfactor, con el test de Bonferroni como prueba post-hoc.RESULTADOSLa mayoría de pacientes mantuvieron el fenómeno de flexión-relajación del músculoerector spinae. Las variables de movimiento de la cadera, en todos los grupos depacientes, fueron similares a las de los sujetos sanos, mientras que la máxima flexióndel raquis lumbar y el tiempo que el raquis lumbar mantiene una flexión mayor del 90%de su máximo fueron menores en todos los grupos de pacientes. En pacientes conhistoria de dolor lumbar inespecífico se observó una alteración del patrón demovimiento lumbar y de la activación del erector spinae: tiempo de relajación muscular,índices de relajación y patrón de actividad mioeléctrica. En pacientes conespondilolistesis, sólo se observaron alteraciones en el patrón de movimiento lumbar,mientras que en pacientes con hernia discal y espondilitis anquilosante, sólo seobservaron alteraciones en la activación del erector spinae.DISCUSIÓNNuestros resultados han mostrado estrategias de movimiento en la flexo-extensión deltronco, específicas de cada alteración anatómica de la región lumbar, y que protegeríanel raquis de las cargas lesivas. Estas estrategias podrían explicarse según la anatomía yneurofisiología de la región lumbo-pélvica, a través del desencadenamiento de reflejosespinales o supraespinales. El estudio de estas estrategias de movimiento, además deaportarnos resultados inéditos en la literatura, puede tener diversas aplicaciones clínicasen campos como el diagnóstico de causas de dolor lumbar, la evaluación de técnicas detratamiento, el seguimiento de la evolución del paciente o la detección de simuladores. / INTRODUCTION: Dynamic tests have been used to distinguish low back pain patientsfrom pain-free subjects. However, we couldn't find studies which compared lumbopelvicmotion and erector spinae activity patterns registered in a non-invasive waybetween different groups of patients with low back pain and specific alterations of thelumbo-pelvic anatomy.MATERIALS AND METHODS: 50 pain-free and 50 low back pain patients, withspecific groups of discal herniation, spondylolisthesis, bilateral sacroiliitis andankylosing spondylitis, were studied.Using non-invasive techniques the patterns of lumbo-pelvic motion andelectromyographic activity of the erector spinae were analyzed during standardizedtrunk flexion-extension cycles. All data were synchronized. Variables: averagemyoelectrical activity and degrees of lumbo-pelvic flexion at each stage of movement;maximum ranges of trunk, hip and spine flexion; time during which the subjects keptlumbar and hip flexion over 90% of their maximum; duration, start and end of erectorspinae relaxation; relaxation indexes of myoelectrical activity at flexion, extension andflexion-extension.Normal distribution and reliability of the variables were confirmed (Kolmogorov-Smirnov test, Intra-class Correlation Coefficient, Standard Error of Measurement).Statistically significant differences were shown by the Student t-test for independentmeasurements and one-factor ANOVA, with Bonferroni test for post-hoc testing.RESULTS: Most patients showed the flexion-relaxation phenomenon of the erectorspinae. Hip motion pattern showed no differences between any of the groups, whereasall patients' maximum ranges of lumbar flexion and times of lumbar flexion over 90%of its maximum in all the patients were lower than controls'. Unspecific low back painpatients showed alterations of lumbar motion and erector spinae activation patterns,whereas spondylolisthesis group showed only alterations of lumbar motion pattern anddiscal herniation and ankylosing spondylitis groups showed only alterations of erectorspinae activation.DISCUSSION: Our results show protective movement strategies during trunk flexionextension,specific of each lumbar anatomy alteration. Such strategies could beexplained according to the anatomy and neurophysiology of the lumbo-pelvic region, bymeans of spinal or supraspinal reflexes. Our method not only brings forwardunpublished data but also could have clinical applications: diagnose of low back paincauses, evaluation of treatment techniques, patients follow-up of simulators detection.
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Trasplante de glía envolvente olfatoria para reparar lesiones crónicas de la médula espinal de ratas adultas: de roedores a primates.Muñoz Quiles, Cintia 03 May 2007 (has links)
El trasplante de glía envolvente olfatoria (OEG) se ha convertido en una de las estrategias experimentales más prometedoras para reparar los diferentes tipos de lesión de la médula espinal de mamíferos. Estas células promueven la recuperación funcional y la regeneración axonal en ratas adultas con lesiones medulares traumáticas de diferente gravedad. En la primera parte de este trabajo nos hemos centrado en el estudio, in vivo, del efecto de la OEG de rata adulta como terapia reparadora en la fase subaguda (un mes post-lesión) y crónica (cuatro meses) de la lesión medular. Puesto que todavía no se ha encontrado ninguna estrategia reparadora que permita mejorar la situación de los pacientes con lesión de la médula espinal, existen muchos pacientes que se encuentran en fase crónica y que necesitan una terapia promotora de la regeneración en su estado. Además, si esta terapia aplicada en fase crónica llegara a su fase clínica, permitiría a los hospitales el poder realizar los trasplantes pasado un periodo y en el momento en que el paciente ya estuviera estabilizado. Por ello es necesario estudiar si las diferentes terapias que han sido aplicadas con éxito en la fase aguda de la lesión en experimentos animales, conservan su efectividad cuando son aplicadas en la fase crónica. Hemos demostrado que la OEG promueve tanto la recuperación funcional de ratas parapléjicas con sección medular completa, como la regeneración axonal de sus neuronas supraespinales, alcanzando el muñón caudal a la lesión, cuando el trasplante se retrasa hasta cuatro meses post-lesión. La recuperación funcional e histológica fue significativamente superior que en los animales no trasplantados, indicando que al menos durante 4 meses después de la lesión, las neuronas lesionadas conservan la capacidad de responder a estrategias promotoras del crecimiento. Además hemos diseñado un método de trazado que nos permite contabilizar todas aquellas neuronas supraespinales que fueron capaces de regenerar su axón a través de la zona de la lesión y de penetrar en el muñón caudal. Mediante esta técnica de trazado hemos detectado regeneración en neuronas del núcleo rojo, rafe, vestibular, de la formación reticular y del locus coeruleus, todos ellos involucrados en la iniciación y el mantenimiento de la postura durante la locomoción voluntaria. El hecho de poder retrasar los trasplantes de OEG hasta 4 meses sin observar pérdidas en su capacidad promotora de la regeneración, garantiza la disponibilidad del tiempo requerido para la extracción del bulbo olfatorio, la puesta en cultivo, propagación y preparación de la OEG para poder aplicar esta terapia de forma autóloga, permitiendo a su vez la estabilización de los pacientes en el caso de su traslado a la clínica. Además hemos diseñado un sistema de estabilización de la columna vertebral mediante puentes fabricados con cemento dental. Estos puentes resultaron ser inocuos, disminuyeron el porcentaje de animales que desarrolló escoliosis y promovieron cierto grado de recuperación funcional espontánea en animales que no recibieron trasplante de OEG. Sin embargo, esta recuperación siempre fue significativamente inferior a la que se observó en animales que recibieron trasplantes de OEG. Finalmente, otro de los objetivos fundamentales de este trabajo ha sido el estudio in vitro de la OEG de primate no-humano, por su mayor proximidad filogenética a los humanos, y su comparación con la de roedor, cuya capacidad promotora de la regeneración ya ha sido demostrada. En este trabajo se han presentado evidencias que muestran por primera vez, que la OEG se puede obtener a partir de bulbos olfatorios de primates adultos mediante bulbectomías unilaterales, y que un solo bulbo olfatorio proporciona suficiente OEG fenotípicamente adecuada para una terapia celular segura, mediante trasplantes autólogos o heterólogos en primates. / Olfactory bulb Ensheathing Glia (OB-OEG) promote functional recovery and histological repair when transplanted immediately after spinal cord injury. We have checked in rats, if OB-OEG transplantation is also efficient when transplanted at subacute and chronic injury stages after complete spinal cord transection. OB-OEG were grafted at either one (subacute) or four (chronic) months post-lesion. During seven months following transplantation, rats from both OEG-transplanted groups presented a significant progressive improvement of motor function in the climbing test, not observed in non-grafted animals. OB-OEG grafts were equally efficient at subacute or chronic stages. Quantitative analysis by peroxidase tracing revealed that, in transplanted animals, axons of brainstem spinal cord-projecting neurons grew beyond the caudal stump border. Axons from neurons located in red nucleus, reticular formation, locus coeruleus, vestibular and raphe nuclei crossed the scar and regenerated distally in the spinal cord. The number of regenerating neurons was significantly higher in every transplanted group (subacute and chronic) than in the non-transplanted one, but transplanted groups did not differ one another. A positive linear correlation was found between the functional recovery of the animals and the number of brainstem regenerating neurons. OB-OEG transplantation can be delayed up to four months. This provides enough time to obtain and grow OEG for autologous use and also for patient stabilization before transplantation. To provide insight into the feasibility of OB-OEG use in human therapy, we studied in other close primates the suitability of these cells for this purpose. We demonstrated that OEG can be obtained from olfactory bulbs of adult macaca monkeys. However, unlike from rodent, primate OB-OEG are non-senescent, exhibit longer lifespan, are less sensitive to culture shock, and preserve for 2.5 months in vitro a phenotype suitable for grafting. One single macaca olfactory bulb gives in short-term enough OEG to guarantee autologous transplantation at the acute stage, and moreover, after long-term cultures may yield 20 thousand million OEG for storage in banks of cells for further use. Therefore, adult olfactory bulbs from macacas constitute a reliable source of OEG for cell therapy, and autologous transplantation of these cells is a viable approach in adult primates.
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Papel del núcleo parabraquial lateral en los circuitos tanto nociceptivo como antinociceptivo de la rataBlasco Ausina, M. Carmen 27 March 2009 (has links)
El avance más importante producido en los últimos años para la comprensión y tratamiento del dolor ha sido el descubrimiento de un sistema neuronal endógeno de analgesia. Basbaum y Fields (1984) elaboraron una hipótesis acerca de cuál sería la estructura de este circuito endógeno de modulación de la información nociceptiva, que estaría formado por la sustancia gris periacueductal, varios núcleos de la porción rostral y ventromedial del bulbo (núcleo del rafe magno), y el asta posterior de la médula espinal. Han sido numerosos los estudios aparecidos en la literatura que han confirmado dicha hipótesis, aunque con la incorporación sucesiva de nuevos centros nerviosos supraespinales al circuito antinociceptivo original: el núcleo central de la amígdala, el núcleo del rafe dorsal, el locus coeruleus, el núcleo cuneiforme, la porción lateral del núcleo parabraquial (LPB), el área A7, el núcleo del tracto solitario, etc. De entre todos ellos, elegimos como objeto de estudio de la presente tesis doctoral la LPB, por ser la estructura central de los denominados circuitos parabraquiales, responsables de los componentes emocional, autonómico y neuroendocrino del dolor, y por estar estratégicamente situado, desde el punto de vista anatómico, para influir tanto en la transmisión como en el control del dolor. Concretamente, decidimos investigar el papel que la LPB podría jugar en el mecanismo de transmisión de estímulos dolorosos distintos, como el somático superficial y el visceral, así como, en el mecanismo de acción de diferentes fármacos analgésicos, como el metamizol y la morfina, utilizando como marcador de actividad neuronal la detección inmunocitoquímica de la proteína Fos, codificada por el proto-oncogén c-fos. De este modo, los objetivos que nos planteamos fueron los siguientes: 1) Evaluar el efecto que sobre la expresión de Fos en la LPB tendría la aplicación de un estímulo nociceptivo tanto somático superficial (test de la formalina) como visceral (test de las contracciones abdominales); 2) Evaluar el efecto que sobre la expresión de Fos en la LPB tendría la aplicación de un estímulo antinociceptivo, tanto opiáceo (10 mg/kg de morfina) como no opiáceo (500 mg/kg de metamizol); 3) Evaluar el efecto que sobre la expresión de Fos en la LPB tendría la aplicación de un estímulo antinociceptivo (morfina o metamizol) de forma previa a la aplicación de un estímulo nociceptivo (somático superficial o visceral). Como animal de experimentación empleamos ratas macho de la cepa Sprague-Dawley. Toda la experimentación se llevó a cabo siguiendo las recomendaciones éticas de Zimmermann (1983) para experimentación sobre dolor en animales conscientes, siendo todo el procedimiento aprobado por el Comité Ético de la Facultad de Medicina y Odontología de la Universitat de València. Del análisis de nuestros resultados podemos concluir que: 1) La LPB participa en el circuito nociceptivo somático superficial, principalmente por medio de los subnúcleos superior (slPB) y dorsal (dlPB); 2) La LPB participa en el circuito nociceptivo visceral, principalmente por medio del subnúcleo externo (elPB); 3) La LPB participa en el mecanismo de acción del metamizol, principalmente por medio de los subnúcleos externo (elPB) y central (clPB); 4) La LPB no participa en el mecanismo de acción de la morfina, al menos mediante la expresión del proto-oncogen c-fos. / One of the most important advances for the comprehension and treatment of the pain has been the discovery of an endogenous circuit of modulation of the nociceptive information. Recently, has been involved to the lateral parabrachial nucleus (LPB) in the above mentioned circuit, though its role in the transmission and / or modulation of the pain is not sufficiently clear. LPB is strategically placed, from the anatomical point of view, to influence both the transmission and the control of the pain. In the present study, we decide to investigate the role that the LPB might play in the mechanism of transmission of painful different stimuli, as the somatic superficial one (test of the formalina) and the visceral one (test of the abdominal contractions), as well as, in the mechanism of action of different analgesic drugs, as the metamizol (500 mg/kg) and the morphine (10 mg/kg), using the immunocytochemical detection of the protein Fos as a marker of neuronal activity. We used male Sprague-Dawley rats as experimental animal. We can conclude from our results that: 1) LPB plays a role in the somatic nociceptive circuit, principally by the superior (slPB) and dorsal (dlPB) subnucli; 2) LPB plays a role in the visceral nociceptive circuit, principally by the external subnucleus (elPB); 3) LPB plays a role in the mechanism of action of the metamizol, principally by the external (elPB) and central (clPB) subnucli; 4) LPB does not play a role in the mechanism of action of the morphine, at least by the expression of the c-fos proto-oncogen.
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Analisis de la expresión de moléculas de adhesión celular en leucemia linfática crónica y otros síndromes linfoproliferativos crónicos con expresión leucémica.Rosell Mas, Ana Isabel 29 November 2002 (has links)
1. Moléculas de adhesión. (MA).Las MA son glicoproteínas que constituyen un conjunto de receptores de membrana encargados de mediar las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular a través de la unión ligando-receptor.Integrinas. Son heterodímeros de membrana de naturaleza proteica, resultado de la unión no covalente entre dos cadenas polipeptídicas  y . Familia de las inmunoglobulinas. Están constituidas por un conjunto de proteínas de membrana, caracterizadas por contener, en secuencia polipeptídica, el dominio de las inmunoglobulinas.Selectinas. Es una familia compuesta de tres proteínas designadas por el prefijo E (endotelio), P (plaquetas) y L (leucocito). Familia del CD44. Los miembros de esta familia están implicados en numerosos procesos biológicos .2. Generalidades de las patologías a estudio.2.1 Leucemia linfática crónica (LLC). Es una neoplasia de linfocitos B activados, de origen monoclonal detenidos en un estadio intermedio de diferenciación. 2.2 Tricoleucemia. Es una proliferación clonal de linfocitos B, post-foliculares.2.3 Linfoma linfoplasmocítico. Es un linfoma no Hodgkin originado a partir de un linfocito B post-folicular y previo a la etapa de célula plasmática. 2.4 Linfoma B esplénico de la zona marginal con linfocitos vellosos. 2.5 Linfoma del Manto. Tiene su origen en el manto folicular. 2.6 Linfoma folicular. Deriva de los linfocitos B del centro germinal del folículo linfoide. 3. Citometría de flujo. Es un método analítico que mide la emisión de fluorescencia y dispersión de la luz, a medida que las células desfilan de una en una, arrastradas por un flujo portador, frente a un sistema de detección. MATERIAL Y METODOS.1.Pacientes. Se incluyeron 123 pacientes diagnosticados de síndrome linfoproliferativo crónico (SLPC) desde Julio-98 hasta Junio-00. Se estudiaron extensiones de sangre periférica, de aspirado de médula ósea y biopsias medulares, además de estudios serológicos. 2.Citometría de flujo. Los anticuerpos monoclonales utilizados al diagnóstico: CD19, CD20, CD5, CD23, CD19/cadenas Kappa, CD19/cadenas Lambda, CD38, CD79, CD103, CD10, CD43, CD22, FMC7, y las MA: CD44, CD49b, CD49d, CD49e, CD62L, CD18, CD54, CD11a, CD11b, CD11c, CD50.3.Material. Instrumentos- Citómetro de flujo EPICS-XL-MCL, estación semiautomatizada de preparación de muestras, centrífuga clínica, contador hematológico y microscopio óptico.Reactivos y productos- Solución salina Optilyse C, solución salina tamponada de fosfatos, medio de separación de células mononucleares Ficoll-Paque, May Grünwald puro, agua tamponada, Giemsa y fluoroesferas Flow-Check.4.Estudio estadístico.Variables estudiadas- datos demográficos, clínicos, hematológicos en sangre periférica y en médula ósea, bioquímicos, del tratamiento (tto) y citométricos de inmunofenotipo de superficie.Métodos utilizados para su análisis- análisis descriptivo univariante, análisis descriptivo bivariante, análisis de supervivencia y análisis multivariante.RESULTADOS.1.Drescripción clínica de los pacientes. Se incluyeron 123 pacientes diagnosticados de SLPC, entre enero-1990 y junio 2001.2.Parámetros clínico-biológicos. Se realizaron estudios analíticos: hemograma y bioquímica. Estadiaje de enfermedad, tipo de infiltración medular, y evolución clínica, así como de la respuesta a tto y tiempo de duración de la misma.3.Resultados del inmunofenotipaje. Se analizaron diferentes anticuerpos monoclonales para el diagnóstico y su frecuencia de positividad.4.Expresión de MA. En el estudio univariante obtuvimos: que existía relación estadísticamente significativa (RES) entre estadios de Binet-Rai IV y valores elevados el CD54 (p=0.05), entre el tiempo de duplicación linfocitaria >12 meses y valores máximos para CD44 (p=0.03), vimos altos recuentos linfocitarios y valores altos para CD44 (p=0.058), bajos recuentos y altos valores para CD18 (p=0.007) y para CD11b (p=0.009), presentaron progresión de enfermedad aquellos con valores superiores para el CD50, CD49e y CD18 (p=0.051, p=0.017, p=0.057), además pudimos establecer RES entre pacientes fallecidos y valores bajos y la negatividad para CD11b (p=0.055) y de CD11c (p=0.001). En el estudio multivariante obtuvimos que la positividad para CD49d y CD54 aumentan el riesgo de precisar tto (p=0.03 y p=0.01) y la posividad para CD62 lo disminuye (p=0.04).DISCURSION.1.Expresión de las MA y las diferentes entidades.a- -Integrinas. Obtuvimos RES entre altos valores de CD18 y no-LLC (p= 0.022) RES entre baja expresión de CD18 y scores altos (p= 0.004)b- 1-Integrinas. El CD49d tiene mayor expresión en el grupo no-LLC frente al grupo LLC (p=0.002) c-Superfamilia de las Inmunoglobulinas. CD54 se expresa más en el grupo de no-LLC que en LLC (p= 0.048), y también RES entre los valores altos de CD54 y scores altos (p= 0.017) d- L-Selectina (CD62L) y CD44. La expresión de CD62 fue significativamente mayor en el grupo de LLC (p=0.004), CD44 es expresada en todos los casos, sin relación con la supervivencia o pronóstico y CD18, CD49d, CD54 son marcadores de no-LLC.2.Correlación entre las MA y los estadíos clínicos.a- -Integrinas, Inmunoglobulinas y Selectina. Si hay RES entre expresión de CD54 y los estadios avanzados de enfermedad. MARCADOR DE MASA TUMORAL.Además en el estudio multivariante, CD62 surge como un marcador independiente de buen pronóstico. BUEN INDICADOR DE ENFERMEDAD POCO AGRESIVA. b-CD44. Está asociada con estadios avanzados de enfermedad, es un indicador de peor pronóstico y supervivencia. 3.MA y factores pronósticos clásicos.a- Patrón de infiltración. No demostramos RES.b- Tiempo de duplicación linfocitaria. Hemos podido demostrar RES entre valores altos de CD44 y el tiempo de duplicación linfocitaria mayor de 12 meses o duplicación inexistente.c- Recuento linfocitario. Existe RES entre alta positividad de CD11b, CD18 y recuentos bajos de linfocitos.4.Progresión.En el estudio univariante se ha demostrado que los pacientes con expresión elevada de CD50, CD49d y CD18 tienen una mayor probabilidad de progresar que los que presentan valores inferiores.5.Relación entre la expresión de las MA, la necesidad de tratamiento y la supervivencia.En el estudio multivariante la expresión de CD49d y de CD54 aumentan la probabilidad de precisar tto citorreductor.CONCLUSIONES.1.-La expresión de las MA en los SLPC de nuestra serie es similar a lo que se describe en la literatura. Así, las LLC expresan con mayor frecuencia CD62 y los otros SLPC característicamente expresaron con mayor frecuencia CD49d, CD18 y CD54, siendo útil este patrón en el diagnóstico diferencial de estas entidades.2.- El CD44, MA expresada con alta intensidad en el 90% de los casos, en nuestras manos sólo se relaciona con un tiempo de duplicación linfocitaria mayor de 12 meses, pero no ha podido ser reconocido como factor de mal pronóstico o de riesgo para tto en el estudio multivariante.3.- CD54, MA poco expresada en las LLC, aparece relacionada con estadios avanzados de la enfermedad, mientras que CD62 es un marcador pronóstico independiente, apareciendo esta MA más expresada en los pacientes con supervivencia prolongada. También la expresión de CD11c actúa como factor protector, incluyendo al paciente como de bajo riesgo de mortalidad.4.- Hemos observado que la presencia de CD54 y CD49d son factores independientes que implican indirectamente una mayor agresividad de la enfermedad, con requerimiento de tto citoreductor, mientras la presencia de CD62 actúa como factor protector, indicando enfermedad menos agresiva (sin necesidades terapéuticas). / OBJECTIVES :1. Determinate the expression of the MA in the different entities being studied.2. Correlate the expression of the MA with clinic stages of LLC, and the classical prognostic factors.4. Establish the prognostic and predictive value of the MA and SLPC.MATERIAL AND METHOD:We included 123 patients diagnostic of SLPC with expressed leukemia diagnostic in H.Dr.Peset, starting the study of MA (CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD50, CD54, CD49c, CD49d, CD49e and CD44) by cytometric flow in July 1998 until June 2001.The statistical method used was univariant and bivariant descriptive analysis and Klapan-Meyer actuarial curves for survival study. The multivariable analysis was done by way of Cox logistical regression.RESULTS:We obtained a better survival in the group of non-treated (p=0.04), as well as a better survival for the group diagnosed LLC compared with other groups of SLPC (p=0.0027), establish SS between the strong expression of CD18, CD49d and CD54 and the group of others (p=0.022, 0.002, 0.048) as well as the low expression of CD18 and the higher positivity of CD62 and LLC (p=0.004, 0.004). We related advanced stages with the expression of CD54 (p=0.05). Finally the univariant analysis relates positive CD50, CD49d and CD18 with a higher probability of improvement. The multivariant analysis also relates positive CD11c and CD62 with a higher survival, positive CD54 and CD49d with high incertitude in determining a treatment and lower incertitude for positive CD62 patients.CONCLUSIONS:1. The LLC expresses with higher frequency CD62, opposed to CD49d, CD54 and CD18 that are more frequent in other SLPC.2. The expression of CD44 in our sample may result from a higher cellular differentiation.3. CD54 seems related to a advanced stage, while the patients with CD62 and CD11c show a higher survival rate, CD62 identifies as an independent prognostic marker.4. The presence of CD54 and CD49d implies higher certainty in determining the treatment, on the contrary positive CD62 will reduce that certainty.
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Venómica. Mecanismos molecular y evolutivos de la diversificación estructural de la familia de las disintegrinas.Juárez Gómez, Paula 08 March 2007 (has links)
La composición proteica de los venenos de serpiente refleja el hecho de que éstos se originaron en etapas tempranas de la evolución de los reptiles escamosos, por reclutamiento y transformación por evolución acelerada de un número reducido de proteínas endógenas. Los venenos de los vipéridos poseen un arsenal de proteínas capaces de degradar la matriz extracelular e interferir en la cascada de coagulación, el sistema hemostático y la reparación de tejidos. Los proteomas de las serpientes Viperinae caracterizados hasta la fecha están constituidos por isoformas de unas pocas familias de proteínas, cuya abundancia relativa presenta gran variación interespecífica. Las proteínas mayoritarias de los venenos de las víboras y serpientes de cascabel se agrupan en enzimas (proteasas dependientes de serina, metaloproteasas dependientes de Zn2+ del grupo de las reprolisinas, isoenzimas del grupo II de fosfolipasas A2, L-amino acido oxidasa) y proteínas sin actividad enzimática (proteínas similares a lectinas dependientes de Ca2+ y disintegrinas). Las disintegrinas (40-100 AAs) son liberadas al veneno por procesamiento proteolítico de las metaloproteasas PII y actúan inhibiendo la adhesión de las integrinas a sus ligandos. Se clasifican en función de su longitud y número de enlaces disulfuro en monoméricas largas (~90 AAs, 7 SS), medias (~70 AAs, 6 SS) y cortas (~ 40 AAs, 4 SS) y diméricas (subunidades de ~ 63 AAs, 2 SS Inter.- y 4 SS intracatenarios). El objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar en el estudio de las bases moleculares de la diversificación estructural y funcional de la familia de las disintegrinas. Partimos de un esquema evolutivo basado en la pérdida sucesiva de enlaces disulfuro ("ingeniería de enlaces disulfuro") y la acumulación de mutaciones ("química combinatorial") en el bucle de inhibición de integrinas. La aplicación de técnicas proteómicas nos ha permitido determinar la composición proteica del veneno crudo de Sistrurus m. barbouri, Echis ocellatus y Bitis arietans. Para ello los venenos se fraccionaron por RP-HPLC y cada una de estas fracciones fue analizada por SDS-PAGE, secuenciación N-terminal, determinación de masa molecular, contenido en cisteínas libres, enlaces disulfuro y huella peptídica por espectrometría de masas MALDI-TOF, además de secuenciación de novo por espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Así pudimos adjudicar cada pico obtenido tras la separación a 10-12 familias de proteínas conocidas. Con el objeto de comparar proteoma y transcriptoma e investigar la posible presencia de intermediarios evolutivos de las familias de disintegrinas no expresados en el veneno se han analizado librerías de ADNc de glándulas de venenos de Bitis arietans (Ba) y Echis ocellatus (Eo). En el caso de Ba identificamos un producto que presenta un dominio tipo disintegrina ECD con 16 cisteínas, conservando el enlace entre las CysXIII-CysXVI, pero que carece del dominio rico en cisteínas típico de las metaloproteasas PIII, lo cual indica que la deleción del dominio rico en Cys ocurrió con anterioridad a la pérdida del enlace disulfuro C13-C16. En Eo amplificamos precursores de disintegrinas diméricas, los cuales pertenecen a la clase "mensajeros cortos" (carecen del dominio metaloproteasa). La existencia de mensajeros que codifican para disintegrina no expresados en el veneno podría indicar la existencia de "fondos de reserva genómicos" de eventual relevancia para la adaptación a ecosistemas cambiantes. Además, mediante el análisis de la organización genómica de disintegrinas de las diferentes familias estructurales, hemos demostrado que la pérdida sucesiva de intrones forma parte de un mecanismo evolutivo de diversificación de las disintegrinas que conlleva una evolución acelerada y una minimización de las estructuras génica y proteica. / Venoms of Viperidae and Crotalidae snakes contain proteins that interfere with the coagulation cascade, the haemostatic system and tissue repair. The general aim of this thesis was elucidate the molecular details of the mechanisms leading to snake venom toxin diversification. We describe the application of the proteomic characterization of Echis ocellatus (Eo), Bitis arietans (Ba) and Sistrurus m. barbouri (Smb) venoms. Their protein composition was analyzed by RP-HPLC and SDS-PAGE of each separated protein fraction. The molecular mass and the number of cysteine residues/disulphide bonds were determined by MALDI-TOF mass spectrometry. Selected protein bands were subjected to in-gel tryptic digestion, peptide mass fingerprinting and de novo sequencing by MS/MS. Our results show that snake venoms are composed of proteins belonging to a few protein families, including enzymes (serine proteinases, Zn2+-dependent PI-PIV metalloproteases, group II phospholipase A2 isoenzymes) and proteins with no enzymatic activity as disintegrins, which are potent antagonist of integrins. To understand the genomic basis of the accelerated evolution of disintegrins we have undertaken the analysis of cDNAs encoding disintegrins from venom gland libraries of Eo and Ba and the genomic organization of disintegrin genes. The cDNA sequences coding for dimeric disintegrins lack the metalloproteinase domain and belong thus to the short-coding class. Analysis of two distinct messengers coding for the short disintegrin ocellatusin strongly argues for a common ancestry of short- and dimeric disintegrin subunits. We also report the cloning and sequence analysis of a novel and unique ECD-disintegrin-like domain from Ba. It contains the 16 cysteine residues that are conserved in all PIII disintegrin-like domains but lacks the cysteine-rich domain. On the other hand, comparison of the exon-intron organization revealed that the evolutionary pathway leading to the diversification of disintegrins also involved the miniminization of the gene organization by the successive removal of introns.
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Estrés oxidativo y expresión de proteínas relacionadas en enfermedades de alto riesgo cardiovascular: estudio especial de la hipertensión arterialEspinosa Ibáñez, Olga 27 April 2007 (has links)
Entre las múltiples y variadas implicaciones fisiopatológicas del Estrés Oxidativo, lostrastornos cardiovasculares son, sin duda, uno de los objetivos prioritarios y motivo deinterés de un gran número de investigadores biomédicos.Uno de los principales factores de riesgo es el desarrollo de una serie de enfermedadesfrecuentes en nuestra población como son la hipertensión arterial y las dislipemias.Éstos trastornos, tienen una vinculación más o menos estrecha, directa o indirecta con elfenómeno que conocemos como estrés oxidativo y los 3 tipos de patologías poseenaumentados los niveles de EO de manera que se potencia el riesgo de aparición de eventoscardiovasculares.Objetivo de este estudio es comparar los niveles de EO en las diferentes patologíascardiovasculares seleccionadas (HTA con y sin Síndrome Metabólico asociado, HF y HFC)midiendo la respuesta de las células mononucleares frente al EO crónico a través de lamedida de los niveles de ARNm de las actividades antioxidantes en cada una de ellas.Dicho estudio comparativo se va a realizar mediante el análisis de los siguientesparámetros oxidativos en orina, plasma y en células circulantes de los grupos seleccionadosy el grupo control:1.- Estudio de los productos de oxidación, marcadores de EO y metabolitos relacionados(GSH, GSSG, 8-oxo-dG nuclear, mitocondrial y urinaria, MDA, proteínas carboniladas yniveles de NO3/NO2 .2.- Determinación de la actividad de los principales sistemas antioxidantes y prooxidante(SOD Cu-Zn y Mn, Cat, GPx, GSR y XO) .3.- Cuantificación de los niveles de ARNm por RT-PCR cuantitativo a tiempo real, de losgenes que codifican dichas actividades enzimáticas, además de OGG1 y G6PDH.CONCLUSIONES· 1) En las tres patologías, HTA, HF y HFC, los resultados obtenidos sugieren que elEO representa un mecanismo común y subyacente en la patogenicidad de dichosprocesos y posiblemente contribuya al desarrollo de complicacionescardiovasculares, si bien, el mecanismo bioquímico-molecular responsable delproceso oxidativo presenta características diferenciales entre ellas, así como laintensidad de respuesta al EO.· 2) Los niveles elevados de EO en estas patologías no dependen exclusivamente deun aumento en su producción ya que existe una menor actividad antioxidante. Ladisminución de los mecanismos antioxidantes se debe principalmente a:- Actividad reducida de los genes antioxidantes y del sistema GSH.- Menores niveles de ARNm, disminuyendo así su capacidad de producir enzimasy sistemas protectores frente a EO.· 3) Los pacientes de HTA sin tratamiento se encuentran peor protegidos frente aEO que los controles, a pesar de la activación de algunos sistemas antioxidantescomo el sistema Tiorredoxina y la enzima Manganeso Superóxido Dismutasa.· 4) Los pacientes de HTA con y sin síndrome metabólico asociado no presentandiferencias significativas entre sí, lo que nos confirma que es la HTA el factorasociado al estrés oxidativo, siendo indiferentes las otras características quedeterminan el diagnóstico de síndrome metabólico.· 6) La hipertensión arterial progresa con una marcada oxidación del materialgenético que se verifica por el aumento en la producción de la base modificada ymutagénica 8-oxo-dG como resultado del estrés oxidativo y de la disminución deenzima reparadora OGG1 en las células mononucleares de los pacientes hipertensos.· 7) De los marcadores analizados, la liberación de 8-oxo-dG en orina es el parámetromás representativo del estrés oxidativo en la hipertensión arterial.· 8) Los tres modelos de EO crónico analizados poseen un aumento en los niveles deEO pero distinta intensidad en su respuesta. Los pacientes se encuentrandesprotegidos frente al EO. / The main aim of this study is to compare the EO levels in some different cardiovasculardiseases, previously selected (control, HTA with and without an associate metabolicsyndrome, HF and HFC), by measuring the response of mononuclear cells against thechronicle EO through the RNAm level in the antioxidant activity of each one.This comparative study is carried out in different groups by the analyse of differentoxidative parameters in urine, plasma and circulated cells.1.- Study of oxidation products , EO markers and related metabolites.2.- Main antioxidant and prooxidant systems activity determination.3.- RNAm level quantification by a real time quantitative RT-PCR.CONCLUSIONS:1.- The results of the three pathologies (HTA, HF and HFC) propose that EO represents acommon and underlying mechanism in their pathologies process and probably itcontributes to develop cardiovascular complications, although the responsiblebiochemistry-molecular mechanism of the oxidative process shows many differentfeatures between them.2.- The high levels of EO in these pathologies do not exclusively depends on an increaseof its production because the oxidant activity is lower.3.- HTA patients without a treatment are worse protected against EO that the controledones, despite of the activation of some antioxidant systems like Tiorredoxine Systemand SOD Mn enzyme.4.- HTA patients with and without the associated metabolic syndrome do not showgreat differences between them, so it confirms that HTA is the associated factor to theoxidative stress.5.- The High blood pressure progresses with a high oxidation of the genetic material,that it is verified by the increase of the production of modify base and mutagenig 8-oxo-dG as a result of oxidative stress and the decrease of repairing enzyme OGG1 inthe mononuclear cells.6.- In analysed markers, the 8-oxo-dG liberation in urine is the most representativeparameter of oxidative stress in high blood pressure.7.- The three EO chronicle models analysed have an increase on EO level but differentintensity in their response so patients are unprotected against EO.
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Activación del eosinófilo en la pancreatitis aguda.Montañana Llorens, Consuelo Concepción 13 March 2008 (has links)
La pancreatitis aguda (PA) es un proceso inflamatorio del páncreas que puede afectartambién a otros órganos más distantes y que puede cursar como una forma leve ocomo una forma grave con aparición de complicaciones locales o sistémicas quepueden conducir al desarrollo de un fallo multiorgánico. En la PA se produce unainflamación local como fenómeno inicial, observándose la acumulación de neutrófilos,macrófagos y mastocitos en el páncreas; en cambio, existe poca información sobre laparticipación del eosinófilo en este proceso.El proceso de hematopoyesis en la médula ósea, así como la atracción y la activacióndel eosinófilo en los tejidos está mediado por citocinas y quimiocinas, moléculasmedidadoras liberadas por los leucocitos, células endoteliales y algunas célulastisulares, siendo la citocina IL-5 el principal factor de diferenciación y la quimiocinaeotaxina el factor quimiotrayente más selectivo del esonófilo.Nuestro estudio se propone evaluar la participación del eosinófilo en la pancreatitisaguda mediante el análisis de eotaxina e IL-5, citocinas implicadas en ladiferenciación, activación y migración del eosinófilo, a lo largo de la evolución de lapancreatitis aguda.Nuestros resultados muestran que el número de eosinófilos en sangre se incrementaprogresivamente desde el día del ingreso hasta el mes del episodio agudo, aunque nosupera los límites considerados normales. La concentración de IL-5 en suero seincrementa en los primeros días, recuperando el valor control a los 5 días del ingreso,comportamiento similar al de otras citocinas proinflamatorias, lo cual podría indicar queefectivamente se está produciendo una activación de la hematopoyesis del eosinófiloen el momento agudo. Sin embargo, la concentración de eotaxina se mantiene similaral control hasta pasados 2 días del ingreso, momento en el que inicia su incremento,que es máximo al mes del episodio agudo. Estos resultados sugieren la activación deleosinófilo en el tejido y su papel inmunoregulador en el proceso inflamatorio de lapancreatitis aguda. / Acute Pancreatitis (AP) is a pancreas inflammatory process that can affect to otherdistant organ. AP exhibits a wide variability in its severity, in most cases the course isfairly benign (mild AP) while in others it may progress to a more severe form (severeAP) with local complications or systemic -inflammatory response which can led tomultiple organ dysfunction syndrome. Local inflammatory response is an early event inAP and has been revealed neutrophils, macrophages and mast cells infiltrated inpancreas; however, there is no information about eosinophil participation in thisprocess.Eosinophil development from the bone marrow, trafficking into tissues and activationare mediated by a regulated process involving cytokines and chemokines, chemicalmediators secreted from leukocytes, endotelial cell and tissue resident cells. IL-5cytokine is the most selective for eosinophils differentiation and eotaxin has aselectively chemoattractant activity that regulates eosinophil trafficking.There are no studies about eosinophils role in inflammatory process of acutepancreatitis. Our study try to evaluate eosinophil responsability through the eosinophilsnumber quantification and eotaxin and IL-5 determination, cytokines involved indifferentiation, activation and survival eosinophil.Results show a progresive increase in eosinophils number from inclusion to monthfrom acute onset, whereas eosinophils number remain in normal range. Serum IL-5concentration increases at day 1 to 4, and become in normal values at day 5 after theinclusion, similar fact to other proinflammatory cytokines. This results are in line witheosinophil hematopoiesis activation in early phase. However, eotaxin concnetration issimilar to control from day 1 to day 2, and increases from day 4 to month. This resultssuggest eosinophil activation in tissue and an inmunoregulatory role in inflammatoryprocess of acute pancreatitis.
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Toxicidad "in vitro" en granulocitos de sangre periferica: Aplicación de la citometría de flujo al estudio de las alteraciones inmunitarias en el ejercicio.Blasco Lafarga, Nieves Maria 14 January 1999 (has links)
El desarrollo de modelos de toxicidad in vitro es de gran interés en los campos de la Farmacología y la Toxicología bioquímicas tanto para la detección inicial de fenómenos fármaco-tóxicos, como para el estudio de los mecanismos moleculares implicados. Los granulocitos de sangre periférica desempeñan un papel esencial en la inmunidad inespecífica con funciones que implican a la membrana plasmática, las mitocondrias y los lisosomas. Las funciones bioquímicas de los granulocitos de sangre periférica son muy sensibles a los cambios metabólicos en el indivíduo entero y se relacionan con la presencia de diferentes mediadores fisiológicos o moléculas tóxicas circulantes. La citometría de flujo es una técnica muy útil para el análisis multiparamétrico de células individuales y la detección de alteraciones estructurales y funcionales. Por sus características estructurales, los granulocitos son identificados fácilmente por citometría de flujo, permitiendo su análisis específico, sin necesidad de etapas de purificación. Es evidente el beneficio que el ejercicio físico supone sobre prácticamente todos los aspectos de la salud y se han realizado estudios que demuestran que el ejercicio es un regulador de la función inmunológica. Aunque aún existen aspectos poco claros en cuanto a su influencia sobre el sistema inmune, parece existir relación entre la intensidad y duración del ejercicio, y la magnitud y dirección de los cambios en los contajes y porcentajes de los leucocitos circulantes en sangre. Lo mismo sucede con la función aunque las alteraciones funcionales no están relacionadas con los cambios numéricos. El presente trabajo evalúa la utilidad de los granulocitos de sangre periférica como célula diana para el desarrollo de modelos de alteración funcional "in vitro" que pudieran ser aplicados a la detección de efectos tóxicos, así como al estudio de los mecanismos funcionales implicados en situaciones fisiopatológicas que afecten al Sistema Inmunitario. También se plantea aplicar la capacidad analítica de la citometría de flujo multiparamétrica para el análisis funcional de los granulocitos y la comparación de sus respuestas con la de otras células inmunitarias en los modelos de toxicidad a desarrollar. Se plantea así mismo aplicar los aspectos metodológicos desarrollados al estudio del posible papel del estrés oxidativo en las alteraciones funcionales inducidas en los granulocitos y otras células inmunitarias por el ejercicio físico de alta intensidad.Los objetivos planteados se abordan a través de un estudio integrado, mediante citometría de flujo (EPICS Elite) para el estudio de suspensiones de leucocitos de sangre periférica, obtenidas tras la depleción de hematíes por sedimentación sobre Ficoll-Histopaque y separación celular por "cell sorting". Los granulocitos son identificados y preseleccionados por sus cacterísticas morfológicas, mediante análisis de la dispersión frontal y lateral de luz. Una primera fase in vivo analiza muestras procedentes de indivíduos sometidos a un esfuerzo físico de alta intensidad. El posible papel del estrés oxidativo en las alteraciones funcionales de los granulocitos observadas in vivo, se estudia en una segunda fase en un modelo in vitro de exposición controlada a concentraciones subletales de agentes pro-oxidantes, solubles (como el peróxido de hidrógeno (H2O2)) y de membrana (como el peróxido de tert-butilo (tBOOH)). En las suspensiones de leucocitos aislados se determina el Potencial de Membrana Mitocondrial (PMM, con Rhodamina 123), la generación de H2O2- y Superóxido (con Dihydrodiclorofluoresceina (DHDCF) e Hydroethidina (HE)) y los niveles de Glutation (GSH con Naranja de Mercurio), así como la expresión de CD69 y CD25. La expresión de las β2-integrinas CD18, CD11a, CD11b y CD11c, se han determinado en condiciones basales y tras estimulación con PMA o FMLP. En ambos modelos se analiza la distribución, estado de activación, respuesta mitogénica y generación de especies reactivas de oxígeno en las diferentes subpoblaciones leucocitarias. Los estudios citométricos sobre el modelo in vitro aborda fundamentalmente los fenómenos de expresión de moléculas de adhesión de la familia de las integrinas, en condiciones basales y tras estimulación quimiotáctica o activación de la protein kinasa C, por la especial relevancia de dichas moléculas en la funcionalidad de los granulocitos y su papel en los fenómenos de interacción de los mismos con otras células implicadas en las alteraciones funcionales inducidas por el ejercicio físico intenso.Las determinaciones demuestran que el ejercicio físico intenso induce una disminución en el porcentaje de linfocitos T citotóxicos, linfocitos T inductores de cooperación y células Natural Killer, aumentando el porcentaje de linfocitos T inductores de supresión. En este modelo se produce un incremento de las células T que expresan el receptor de Interleukina-2, acompañado de una mayor capacidad de respuesta a la activación mitogénica in vitro. Sin embargo, dichas células utilizan con menos eficacia la Interleukina-2 exógena, sugiriendo la existencia de interferencias con el mecanismo de transducción de la señal de activación. Además la incubación in vitro con dosis no letales de prooxidantes exógenos induce un estrés oxidativo intracelular en los leucocitos, pero no provoca la activación de los linfocitos. Los prooxidantes exógenos, en general, incrementan la expresión espontánea de moléculas de adhesión, los niveles intracelulares de especies reactivas de oxígeno y modifican la sobreexpresión inducida por estímulos quimiotácticos o activadores de la protein kinasa C en granulocitos y monocitos, lo que sugiere la existencia de un posible estrés oxidativo en dichas células y por tanto de un desequilibrio entre prooxidantes y antioxidantes que puede participar en las alteraciones de la función inmunitaria específica e innata. Los granulocitos han respondido de forma más sensible y consistente que los monocitos a la acción in vitro de los oxidantes exógenos. Por último, la utilización de la citometría de flujo multiparamétrica para determinar la funcionalidad de los granulocitos, células fáciles de estudiar selectivamente, podría representar una aproximación de interés para la detección y análisis de fenómenos de citotoxicidad que afecten al Sistema Inmunitario. / AIMS: To evaluate the utility of whole blood granulocytes as useful cells in the development of in vitro models of functional disturbance in order to detect toxic effects, to study the functional mechanisms of the Inmunitary System and to determine by flow cytometry (CMF) the in vitro effects of oxidative stress on the functional status of leukocytes in whole blood, assessed by analysis of mitochondrial function, intracellular prooxidants, early- and late activation markers and cell adhesion molecules. METHODS: Whole blood samples were in vivo processed by CMF after a high intensity physical exertion and in vitro incubated with sublethal concentrations of soluble (H2O2) and membrane (t-Butyl hydroperoxyde) prooxidants. Mitochondrial membrane potential (MMP, with Rhodamine 123), H2O2- and superoxide generation (with dihydrodiclorofluorescein (DHDCF) and hydroethidine) and glutathione levels (GSH with Mercury Orange) were determined in isolated leukocytes suspensions. CD69 and CD25 expression was determined in whole blood leukocytes. β2-integrins (CD18, CD11a, CD11b and CD11c) were determined in basal conditions and following cell stimulation with PMA or FMLP. All the analysis were performed with an EPICS XL flow cytometer.RESULTS: High intensity physical exertion modified lymphocyte subpopulations with different functional implication and also the activation state of these cells, and increased metabolic activity, basal integrin expression and H2O2 intracellular levels in granulocytes and monocytes. Extracellular prooxidants induced in all leukocytes significant increase of intracellular oxidants and MMP and decreased cell GSH. There were no changes in the distribution of lymphocyte subpopulations. CD69 and CD25 were not affected. The effects on β2-integrins were complex and more significant in granulocytes: in general, low-concentration of prooxidants enhanced basal integrin expression, while higher concentrations tended to decreased the expression. Also, oxidative stress decreased the sttimulatory effect of FMLP and PMA, specially in the granulocyte subpopulations. In all cases, CD11b and CD11c were the most affected molecules by prooxidants.CONCLUSIONS: The effect of intense physical exercise increase T-cells with an IL-2 receptor and more responsive to the mitogenic activation, but used less effectively exogenous IL-2. In intense physical exercise occur functional changes in granulocytes which are evident by increased metabolic activity, basal integrin expression and intracellular levels of reactive oxygen species. Exogenous prooxidants in vitro induce intracellular oxidative stress and have complex effects on the expression of β2-integrins in leukocytes, specially in granulocytes. The use of flow cytometry to determine the functionality of granulocytes could be of interest to detect and study cytotoxicity events that affect the Inmune System.
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