Le principal objectif de ce travail est le développement, l'application et la validation de nouveaux traceurs hydrogéologiques sur la base de signatures spectrales spécifiques des matières organiques dissoutes (MOD) et du suivi de leur évolution dans les hydrosystèmes karstiques méditerranéens. Pour cela, de nombreuses analyses hydrodynamiques et hydrochimiques ont été réalisées, et plusieurs méthodes de caractérisation de la MOD ont été utilisées. Le travail s'est alors fondé sur l'étude de différents niveaux du bassin expérimental de la Fontaine de Vaucluse (sol, épikarst et zone non saturée), grâce à un accès privilégié rendu possible par le Laboratoire Souterrain à Bas Bruit de Rustrel-Pays d'Apt (Vaucluse, France). Un bon traceur hydrogéologique requiert des caractéristiques particulières (solubilité dans l'eau, stabilité, tendance faible à l'adsorption, limite de détection faible et des variations bien identifiables). Les composés organiques correspondant le mieux à ces critères sont des substances dérivées de la décomposition de la lignine. Leurs différentes caractéristiques et leurs faibles concentrations dans l'hydrosystème poussent à utiliser des modes de détection suffisamment sensibles tels que la spectrométrie de fluorescence et la Résonance Paramagnétique Électronique (RPE). L’application conjointe des analyses en RPE et en spectrofluorimétrie sur les lixiviats de sols et les eaux souterraines du LSBB permet de proposer deux protocoles de traçages hydrogéologiques. Le premier concerne la détermination des zones superficielles de sol appartenant au bassin d’alimentation des écoulements suivis. Le second, s'appuyant notamment sur l'évolution et la dynamique des MOD dans l'hydrosystème, correspond au développement de traceurs quantitatifs du temps de transit de l'eau pouvant s’appliquer de manière évènementielle par le marquage d’une période particulière de leur variation, ou en continu permettant ainsi le suivi des variations du temps de transit. Enfin, le rapprochement des résultats obtenus par ces nouveaux traceurs organiques avec ceux d'un traceur isotopique (l'oxygène 18) a permis de tester la validité des calculs du temps de transit, mais aussi de démontrer leur complémentarité / The aim of this study is to develop, apply and validate new hydrogeological tracers, based on specific spectral fingerprints of Dissolved Organic Matter (DOM), and a monitoring of their evolution in Mediterranean karstic hydrosystems. Many hydrodynamic and hydrochemical analyses were made, and several DOM characterization methods were used. The basis of this work is therefore the study of different levels of Fontaine de Vaucluse experimental basin (soil, epikarst and unsaturated zone), thanks to a privileged access : the Low-Noise Underground Laboratory of Rustrel - Pays d’Apt (Vaucluse, France). Good hydrogeological tracers require specific characteristics (water solubility, stability, a low tendency to adsorption, a low detection limit and identifiable variations). Organic compounds, corresponding to these criterions at best, are lignin-derived compounds. Their different characteristics and their low concentrations in the hydrosystem drive us to use sensitive enough detection methods, such as fluorescence spectrometry and Electronic Paramagnetic Resonance (EPR). Linked application of EPR and spectrofluorimetric analyses of leachate soil and LSBB groundwater allow to develop two hydrogeological tracing protocols. The first one concerns the determination of upper soil zone, which belongs to monitoring flow catchment area. The second one, using the evolution and the dynamics of DOM in the hydrosystem, corresponds to the development of transit time qualitative tracers, which apply either in an event-driven way by the marking of specific period of their variations, or continuously allowing the monitoring of transit time variations. Finally, the comparison between the results obtained by these new organic tracers and by an isotopic tracer (18 Oxygen) allows to validate transit time calculations and prove their complementarity