O timo é um órgão linfoide primário essencial para a manutenção da tolerância central através da seleção e eliminação de células T autoreativas. Precursores de células T, oriundas da medula óssea, chegam ao timo e migram do córtex para região da medula. As células epiteliais medulares tímicas (mTECs) expressam em sua superfície antígenos de tecidos periféricos (em inglês tissue-restricted antigens ou TRAs) que representam autoantígenos de todos os tecidos do corpo. Atuando como um fator de transcrição não clássico em células mTEC, o gene Autoimmune Regulator (Aire) desempenha um papel na expressão dos TRAs, cuja proteína codificada libera a RNA polimerase II (RNA Pol II) ancorada na cromatina e regula a expressão de mRNAs na glândula timo. A função biológica deste gene está ligada à indução de tolerância imunológica central impedindo o aparecimento de doenças autoimunes. Isso é resultado da seleção negativa de timócitos (precursores de células T) autoreativos que interagem fisicamente com as mTECs. Os timócitos autoreativos que reconhecem os TRAs como elementos estranhos são eliminados por apoptose. O co-cultivo de mTECs com timócitos representa um sistema-modelo in vitro adequado para se aproximar da interação celular que ocorre dentro do timo. Os resultados anteriores do nosso laboratório demonstraram que além do controle de mRNA de TRAs, o gene Aire também participa da modulação de miRNAs em mTECs uma vez que estas espécies de RNA são transcritas pela RNA Pol II. Continuando com essa linha de estudos, neste trabalho nós demonstramos pela primeira vez que Aire também modula a expressão de long noncoding RNAs (lncRNAs) em mTECs. Para isto fizemos uso da estratégia da perda de função analisando a expressão dessa espécie de RNA, assim como de mRNAs, em células mTEC Aire +/+ e mTEC Aire nocautes (KO Aire -/-) obtidas pela edição gênica por Crispr-Cas9. O transcriptoma dessas células que passaram ou não por adesão com timócitos, foi então analisado por hibridizações com microarrays. Isso evidenciou que Aire e adesão celular influenciam a expressão tanto de mRNAs como de lncRNAs. A reconstrução de redes de interação lncRNAs-mRNAs possibilitou evidenciar uma nova via de regulação pós-transcricional em células mTEC. / The thymus is a primary lymphoid organ essential for the maintenance of central tolerance through the selection and elimination of autoreactive T cells. Precursors of T cells, originating from the bone marrow, reach the thymus and migrate from the thymic cortex to the medullary region. Thymic medullary epithelial cells (mTECs) express on their surface tissue-restricted antigens (TRAs) that represent autoantigens of all tissues in the body. Acting as a non-classical transcription factor in mTEC cells, the Autoimmune regulator (Aire) gene plays a role in the expression of TRAs, whose encoded protein releases the RNA polymerase II (RNA Pol II) anchored in the chromatin and regulates the expression of mRNAs in the thymus gland. The biological function of this gene is associated to the induction of central immune tolerance preventing the onset of autoimmune diseases. This is a result of negative selection of autoreactive thymocytes (T cell precursors) that interact physically with mTECs. Self-reactive thymocytes that recognize TRAs as foreign elements are eliminated by apoptosis. The co-culture of mTECs with thymocytes represents an appropriate in vitro model system to approximate the cellular interaction that occurs within the thymus. Previous results from our laboratory demonstrated that in addition to the control of TRA mRNAs, Aire also participates in the modulation of miRNAs in mTECs since these RNA species are transcribed by RNA Pol II. Continuing with this line of studies, in this study we demonstrate for the first time that Aire also modulates the expression of long non-coding RNAs (lncRNAs) in mTECs. For this, we used the loss-of-function strategy to analyze the expression of this RNA species, as well as mRNAs in mTEC Aire + / + or Aire knockout mTEC cells (KO Aire - / -) obtained by the gene editing by Crispr-Cas9. The transcriptome of these cells, whether or not adhered to thymocytes, was then analyzed by microarray hybridizations. This demonstrated that Aire and cell adhesion influence the expression of both mRNAs and lncRNAs. The reconstruction of lncRNAs-mRNAs interaction networks made possible to evidence a new post-transcriptional regulation pathway in mTEC cells.

O crosstalk entre timócitos e células epiteliais tímicas é crucial para o desenvolvimento das células T e estabelecimento da tolerância central. Células tímicas epiteliais medulares (mTECs) contribuem para a autotolerância por meio da expressão ectópica de antígenos restritos aos tecidos (TRAs). A expressão de TRAs em mTECs é altamente dependente do gene Autoimmune Regulator (Aire). Por meio do reconhecimento de TRAs com alta afinidade, células T autoreativas são selecionadas negativamente do pool de timócitos em desenvolvimento. Apesar do papel de Aire na indução da tolerância central ser bem conhecido, os mecanismos celulares e moleculares precisos do processo permanecem obscuros. Nesse estudo, hipotetizamos que perturbações na expressão do gene Aire influenciam a adesão entre mTECs e timócitos, o que poderia resultar em um desequilíbrio na imunotolerância a antígenos próprios. Um ensaio funcional realizado com timócitos frescos, extraídos de um timo normal de camundongo e cocultivados com células epiteliais tímicas medulares da linhagem mTEC 3.10, demonstrou que a inibição do gene Aire por meio de RNA de interferência reduziu significativamente a capacidade das mTECs de promover a adesão dos timócitos. Análises por microarray revelaram que o silenciamento do gene Aire nas células mTEC 3.10 causou a modulação de mais de 1000 genes, alguns que codificam TRAs, outros que codificam proteínas envolvidas na adesão celular, como VCAM-1, e também outros que codificam moléculas coestimuladoras como CD80. Esses resultados contribuem para uma melhor compreensão do papel de Aire no controle da adesão mTEC-timócitos, a qual constitui um processo essencial para a seleção negativa de timócitos autoreativos / The crosstalk between thymocytes and thymic epithelial cells is critical for T cell development and the establishment of central tolerance. Medullary thymic epithelial cells (mTECs) contribute to self-tolerance through the ectopic expression of tissuerestricted antigens (TRAs) in the thymus. TRAs expression in mTECs is largely dependent on Autoimmune Regulator (Aire) gene. Through the recognition of TRAs with high affinity, developing autoreactive T cells are negatively select from the pool of developing thymocytes. Although the role of Aire in the induction of central tolerance is well known, the precise cellular and molecular mechanisms remain unclear. In this study, we hypothesize that disturbance in Aire gene expression influences adhesion between mTECs and thymocytes, which could result in an imbalance in immune-tolerance to self-antigens. A functional assay performed with fresh thymocytes dissociated from a normal mouse thymus and co-cultured with a medullary thymic epithelial cell line named mTEC 3.10, demonstrated that Aire RNAi knockdown significantly decreased the ability of mTECs to promote thymocyte adhesion. Microarray analysis revealed that Aire knockdown of the murine mTEC 3.10 cell line led to the modulation of more than 1000 genes, some of them coding for TRAs, others for proteins involved in cell adhesion like VCAM-1 and also for costimulatory molecules like CD80. These results contribute to a better understanding of the role of Aire in the control of mTEC-thymocyte adhesion, which is an essential process for negative selection of autoreactive thymocytes

O crosstalk entre timócitos e células epiteliais tímicas é crucial para o desenvolvimento das células T e estabelecimento da tolerância central. Células tímicas epiteliais medulares (mTECs) contribuem para a autotolerância por meio da expressão ectópica de antígenos restritos aos tecidos (TRAs). A expressão de TRAs em mTECs é altamente dependente do gene Autoimmune Regulator (Aire). Por meio do reconhecimento de TRAs com alta afinidade, células T autoreativas são selecionadas negativamente do pool de timócitos em desenvolvimento. Apesar do papel de Aire na indução da tolerância central ser bem conhecido, os mecanismos celulares e moleculares precisos do processo permanecem obscuros. Nesse estudo, hipotetizamos que perturbações na expressão do gene Aire influenciam a adesão entre mTECs e timócitos, o que poderia resultar em um desequilíbrio na imunotolerância a antígenos próprios. Um ensaio funcional realizado com timócitos frescos, extraídos de um timo normal de camundongo e cocultivados com células epiteliais tímicas medulares da linhagem mTEC 3.10, demonstrou que a inibição do gene Aire por meio de RNA de interferência reduziu significativamente a capacidade das mTECs de promover a adesão dos timócitos. Análises por microarray revelaram que o silenciamento do gene Aire nas células mTEC 3.10 causou a modulação de mais de 1000 genes, alguns que codificam TRAs, outros que codificam proteínas envolvidas na adesão celular, como VCAM-1, e também outros que codificam moléculas coestimuladoras como CD80. Esses resultados contribuem para uma melhor compreensão do papel de Aire no controle da adesão mTEC-timócitos, a qual constitui um processo essencial para a seleção negativa de timócitos autoreativos / The crosstalk between thymocytes and thymic epithelial cells is critical for T cell development and the establishment of central tolerance. Medullary thymic epithelial cells (mTECs) contribute to self-tolerance through the ectopic expression of tissuerestricted antigens (TRAs) in the thymus. TRAs expression in mTECs is largely dependent on Autoimmune Regulator (Aire) gene. Through the recognition of TRAs with high affinity, developing autoreactive T cells are negatively select from the pool of developing thymocytes. Although the role of Aire in the induction of central tolerance is well known, the precise cellular and molecular mechanisms remain unclear. In this study, we hypothesize that disturbance in Aire gene expression influences adhesion between mTECs and thymocytes, which could result in an imbalance in immune-tolerance to self-antigens. A functional assay performed with fresh thymocytes dissociated from a normal mouse thymus and co-cultured with a medullary thymic epithelial cell line named mTEC 3.10, demonstrated that Aire RNAi knockdown significantly decreased the ability of mTECs to promote thymocyte adhesion. Microarray analysis revealed that Aire knockdown of the murine mTEC 3.10 cell line led to the modulation of more than 1000 genes, some of them coding for TRAs, others for proteins involved in cell adhesion like VCAM-1 and also for costimulatory molecules like CD80. These results contribute to a better understanding of the role of Aire in the control of mTEC-thymocyte adhesion, which is an essential process for negative selection of autoreactive thymocytes