La régénération osseuse guidée (ROG) est une technique couramment utilisée pour la régénération de perte de substance osseuse. Elle repose sur l’utilisation d’une membrane jouant un rôle de « barrière » en isolant le défaut osseux. Afin de pallier les limites des membranes actuellement utilisées, des recherches récentes tentent de développer de nouvelles membranes dites « bio-actives ». Du fait de ses propriétés biologiques, la membrane amniotique humaine (MAH) pourrait être une alternative aux membranes conventionnellement utilisées pour la ROG. L’objectif principal de ce travail était de déterminer les meilleures conditions d’utilisation de la MAH pour la régénération de pertes de substances osseuses. Dans une première partie expérimentale, l’influence des faces de la MAH appliquées au contact du défaut ainsi que l’effet de la cryopréservation ont été étudiés. Dans une seconde partie expérimentale, une nouvelle méthode de décellularisation de la MAH, simple et reproductible a été développée. Dans une troisième partie expérimentale, la réparation osseuse de défauts de taille non-critiques et critiques a été évaluée en présence de la MAH préservée selon différentes méthodes. Les résultats ont montré que ni les cellules souches contenues dans la MAH, ni la face appliquée au contact du défaut n’avaient d’influence sur la régénération osseuse. La MAH décellularisée/lyophilisée semblait être la méthode de préservation la plus prometteuse en vue de son utilisation en régénération osseuse. / Guided bone regeneration (GBR) is commonly used to repair damaged bone. GBR is based on the application of a membrane which will act as a physical barrier to isolate the intended bone-healing space. The development of bioactive membranes has been suggested to overcome some limitations of the currently used membrane. Due to its biological properties, the human amniotic membrane (HAM) is a new biological membrane option for GBR. This study aimed at investigating the most suitable conditions to use HAM for GBR. First, the influence of both HAM sides and the impact of cryopreservation were studied. Then, a new decellularization process of HAM, that is simple and reproducible, has been developed. In a third part, bone regeneration of non-critical and critical sized defects depending on the preservation method of HAM was assessed in rodents. Results showed that neither stem cells found in HAM, nor the HAM layer used to cover the defect had an influence on its potential for bone regeneration. The most promising results were achieved with the decellularized/lyophilized HAM for the field of bone regeneration.

La greffe de Membrane Amniotique Humaine (MAH) permet la cicatrisation des ulcères pré-perforants de la cornée et de sauver un nombre significatif d'yeux victimes de brûlures chimiques. La MAH est un matériel biologique, son utilisation pour le traitement des maladies de la surface oculaire donne de bons résultats en raison de sa capacité à réduire l'inflammation et promouvoir une épithélialisation rapide. Pour son utilisation en clinique, la MAH doit bien évidemment être stérile, mais aussi facile à transporter du centre préleveur au centre greffeur, et stockable longtemps et facilement. Actuellement en routine à la banque de tissus de Rouen, la membrane amniotique est séparée de l’amnios puis dénudée de leur couche spongieuse. Par la suite cette membrane est conservée par cryopréservation (congélation à –80°C) ce qui complique potentiellement l’acheminement des membranes. Par conséquent, dans le cadre de cette étude avec la Banque Normande de Cornées du CHU de Rouen nous avons développé la lyophilisation des MAH pour faciliter son utilisation et sa distribution. L’étude du mapping de la MAH permettra également de déterminer si le taux de facteurs de croissance est homogène dans la MAH ou s’il dépend sa distance par rapport au cordon ombilical. L’étude de la biocompatibilité in vivo d’un deuxième matériau composé de collagène nous permet également d’envisager une alternative pour une implantation du stroma. Nos analyses protéiques (ELISA et Label-free) des MAH la lyophilisées ne montrent pas de différence significative en terme de quantité et de qualité protéique. L’approche protéomique est complétée par l’analyse de la capacité des cellules épithéliales de cornée humaines (CEC) à se multiplier sur la membrane amniotique lyophilisée in vitro. Nous n’avons pas observé de différence entre la croissance des cellules épithéliales sur la MAH lyophilisée ou congelée. L’analyse du total de protéines extraites montre également que la lyophilisation ne dégrade pas les MAH au niveau protéique.Au niveau structurel les résultats de la microscopie électronique ont montré que la structure du stroma de la MAH est impactée par la lyophilisation. La greffe des MAH a été réalisée sur les ulcères cornéens chez le lapin. Au cours de l’expérimentation les lapins n’ont pas montré de signe d’inflammation, les analyses histologiques ont mis en évidence l’épithélialisation de la surface oculaire. Ce projet est en collaboration avec l‘association ophtalmo sans frontière pour qu’à terme le développement de l’utilisation clinique des MAHL répondant notamment à des besoins humanitaires (Cameroun). Notre étude de la cartographie de la MAH a également montré qu’une variabilité en termes de quantité de protéine existe entre les différents donneurs. Dans cette étude nous avons également montré que la couche spongieuse est une source de facteurs de croissance importante dans le processus de cicatrisation des ulcères cornéens. / The Human Amniotic Membrane (HAM) graft allows the healing of corneal ulcers and rescues a significant number of eyes with chemical burn. HAM is a biological material, its use for the treatment of ocular surface diseases gives good results because of its ability to reduce inflammation and promote rapid epithelialization. For its clinical use, the HAM must of course be sterile, but also easy to transport from the sampling center to the transplant center, and easily storable and for a long time. Currently on routine in the tissue bank of Rouen, the amniotic membrane is separated from the amnion and denuded of its spongy layer. Subsequently this membrane is stored by cryopreservation (freezing at -80 ° C) which potentially complicates the delivery of membranes. Consequently, as part of this study with the Banque Normande de Cornées of Rouen University Hospital, we have developed freeze-drying of HAM to facilitate its use and distribution. The HAM mapping study will also determine whether the level of growth factors is homogeneous in the HAM or whether it depends on its distance from the umbilical cord. The study of the in vivo biocompatibility of a second material composed of collagen also allows us to consider an alternative for implantation at the level of the stroma. Our protein analyzes (ELISA and Label-free) of freeze-dried HAM do not show any significant difference in terms of quantity and protein quality. The proteomic approach is complemented by the analysis of the ability of human corneal epithelial cells (CECs) to multiply on the freeze-dried amniotic membrane in vitro. We did not observe any difference between the epithelial cells growths on freeze-dried or frozen HAM. The analysis of the extracted protein total also shows that freeze-drying does not degrade the HAM at the protein level. At the structural level the electron microscopy results showed that the structure of the MAH stroma is impacted by freeze-drying. The MAH transplant performed on corneal ulcers in rabbits was performed. During the experiment the rabbits did not show any sign of inflammation, the histological analyzes highlighted the epithelialization of the ocular surface.This project is in collaboration with OSF association for the development of the clinical use of MAHL responding in particular to humanitarian needs (Cameroon). Our study of HAM mapping also showed that variability in terms of amount of protein exists between different donors. We have also shown that the spongy layer is an important source of important growth factor in the healing process of corneal ulcers.