Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2016-04-08T14:32:02Z No. of bitstreams: 1 2016_ DianeSthefanyLimadeOliveira de Oliveira_Parcial.pdf: 1744191 bytes, checksum: 382c2ce584da379d2523648c0325de31 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-15T12:20:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_ DianeSthefanyLimadeOliveira de Oliveira_Parcial.pdf: 1744191 bytes, checksum: 382c2ce584da379d2523648c0325de31 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-15T12:20:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_ DianeSthefanyLimadeOliveira de Oliveira_Parcial.pdf: 1744191 bytes, checksum: 382c2ce584da379d2523648c0325de31 (MD5) / É estimado que ocorram 625 mil mortes por ano no mundo por meningite criptococócica, a maioria indivíduos infectados por HIV. Cryptococcusneoformans é o responsável pela maioria dessas mortes. Visto que tratamento da criptococose com antifúngicos convencionais tem se mostrado menos eficaz do que o ideal, anticorpos monoclonais contra a cápsula do fungo foram desenvolvidos nas últimas três décadas com objetivo de criar novas ferramentas terapêuticas. No entanto, ao tratar camundongos com diferentes isotipos de anticorpos, diferentes respostas protetoras foram observadas. Por exemplo, tratamento com anticorpo monoclonal 3E5 IgG1 de camundongos infectados com C. neoformans resultou em aumento da sobrevida, enquanto os animais tratados com anticorpo de região variável idêntica mas com isotipo IgG3 apresentaram resposta agravante de doença. Ensaios de ligação ao antígeno por imunofluorescência mostraram que os padrões de ligação destes dois isotipos de 3E5 à cápsula são diferentes, o que pôs em questão o conceito clássico de que a ligação ao antígeno é exclusivamente determinada pelas porções variáveis do anticorpo. Além destas diferenças de ligação ao antígeno, diversos estudos publicados a partir da década de 1980 sugerem que o isotipoIgG3 interage com um receptor de Fc na superfície de macrófagos que é diferente dos que se ligam aos outros isotipos, o que também poderia explicar diferenças na proteção conferida pelos anticorpos 3E5 de diferentes isotipos de IgG. Tendo em vista a importância terapêutica de se conhecer adequadamente os mecanismos pelos quais um mesmo anticorpo IgG pode ser protetor ou não, dependendo de seu isotipo, este trabalho teve por objetivos produzir novos anticorpos monoclonais recombinantes, avaliar seu padrão de ligação ao antígeno e sua capacidade de mediar fagocitose por receptores de Fc. Dois pares de anticorpos IgG1 e IgG3 foram produzidos por meio de expressão heteróloga em células de mamífero. O primeiro par deriva do anticorpo monoclonal 2H1, anticorpo contra a cápsula de C. neoformans cuja estrutura cristalográfica já foi resolvida. O segundo par deriva do anticorpo 4-4-20, que reconhece o hapteno FITC, e foi gerado a fim de avaliar se a resposta efetora mediada por receptores é exclusiva de anticorpos contra C. neoformans. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve dos anticorpos foram gerados por síntese química e clonadas em vetores para expressão de IgG1 e IgG3 murinos, que foram então transfectados em células CHO e NSO. As condições de transfecção e purificação foram otimizadas e resultaram na produção de lotes dos anticorpos suficientes para testes funcionais. A ligação dos anticorpos a células de C. neoformans foi testada por imunofluorescência indireta e sua capacidade de mediar fagocitose testada com macrófagos J774 e células CHO-K1. Os anticorpos 2H1 apresentaram padrão de fluorescência semelhante aos de 3E5, com padrão de ligação a células de C. neoformans anular para IgG1 e puntiforme para IgG3. Os dois isotipos de anticorpos 2H1 e 4-4-20 foram também funcionais em testes de fagocitose por macrófagos. Os anticorpos de isotipoIgG1 mostraram dependência exclusiva dos receptores Fcγ, enquanto que 2H1-IgG3 foi capaz de mediar fagocitose mesmo com esses receptores bloqueados. Portanto, os anticorpos recombinantes produzidos foram funcionais e permitiram a realização de experimentos importantes, que evidenciaram que a cadeia pesada pode alterar a ligação do anticorpo ao antígeno e comprovaram que o isotipoIgG3 pode mediar fagocitose por meio de um receptor desconhecido. / It is estimated there are 625,000 deaths worldwide per year caused by cryptococcalmeningitis, the most affects people infected by HIV. Cryptococcusneoformans is responsible for the majority of these deaths. Since treatment of cryptococcos is using conventional antifungal has been less effective than ideal, monoclonal antibodies against fungus capsule were developed in the last three decades in order to create new therapeutic tools. However, treating mice with different isotypes of antibody were observed different protective responses. For example, treatment of C. neoformans infected mice with monoclonal antibody 3E5 IgG1 resulted in increased survival, where as the disease was aggravated in animal streated with IgG3 antibody of identical variable region. Immunofluorescence as say showed that the binding patterns of these two 3E5 isotypes are diferentes tothe capsule, which became questionable the classical concept of the antigen binding that defines it is exclusively determined by antibody variable region. In addition to these antigen binding differences, many studies published in 1980s suggest that the IgG3 isotype interacts with an Fc receptor on the surface of macro phages differently from other isotypes, which could also explain differences in protection provided by the 3E5 antibodies of different IgG isotypes. Considering the therapeutic importance of properly knowing the mechanisms by which the same IgG antibody may be protective or not, depending on the irisotype, this study aimed to produce new recombinant monoclonal antibodies, assessing its binding standard antigen and its ability to mediate phagocytosis by Fcreceptors. Two pairs of IgG1and IgG3 antibodies were produced by heterologous expression in mammalian cells. The first pair was derived from monoclonal antibody 2H1, the antibody against C. neoformans capsule who secrystal structure has been resolved. The second pair was derived from the 4-4-20 antibody that recognizes the hapten FITC and was generated to evaluate whether receptor-mediate deffector response isunique to antibodies againstC. neoformans. The heavy and light chains variable domains of the antibodies were generated by chemical synthesis and cloned into expression vectors for IgG1and IgG3 murine, then they were transfected into CHO and NSO cells. The transfection and purification conditions were optimized and led to the batch production of antibodies until it was sufficient for functional testing. The binding of the antibodiestoC. Neoformans cells was tested by indirect immunofluorescence and its ability to mediate phagocytosisby J774 macrophagesand CHO-K1 cells. The 2H1 antibody showed binding pattern similar tothat for 3E5, showing annular and punctuate pattern for IgG1and IgG3 respectively. Both 2H1 and 4-4-20 antibodies were also functional on phagocytes is assay by macrophages. The IgG1 isotype showed exclusive dependence on Fcγ receptor, whereas 2H1 IgG3 was able to mediate phagocytes is even when this receptor was blocked. Therefore, the produced recombinant antibodies were functional and allowed th eattainmen to fimportant experiments which showed that heavy chain canal terantibody binding to the antigen and that IgG3isotype can mediate phagocytosis through an unknown receptor.