Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2005. / Title from first page of PDF file. Document formatted into pages; contains xv, 176 p.; also includes graphics Includes bibliographical references (p. 167-176). Available online via OhioLINK's ETD Center

La fonction d'une protéine est ultimement déterminée par sa structure tridimensionnelle. La compréhension complète de la fonction d'une protéine implique donc la connaissance de sa structure. Le grand nombre de projet de séquençage de génome résulte en plusieurs dizaines de milliers de séquences de protéines pour lesquelles il n'existe aucune information fonctionnelle. La protéomique structurale implique l'étude de la structure tridimensionnelle de toutes les protéines d'un protéome. Comme la détermination de la structure d'une protéine est un processus laborieux, la protéomique structurale est un des plus grands défis scientifiques du 21e siècle. Malgré cela, plusieurs projets de protéomique structurale ont récemment débuté à travers le monde. Ce mémoire présente une étude qui s'inscrit dans le cadre d'un de ces projets à grande échelle, la protéomique structurale de Methanobacterium thermoautotrophicum. À l'aide de la résonance magnétique nucléaire, la structure tridimensionnelle de MTH187, une protéine de Methanobacterium thermoautotrophicum, a été déterminée. MTH187 est classifié comme ayant une séquence conservée, et sa fonction est inconnue. La structure de MTH187 révèle que cette protéine de 111 acides aminés est composée de six hélices ? de 10 à 14 résidus. Par homologie structurale, il a été possible de classifier MTH187 parmi une famille structurale de type ± HEAT repeat ¿. Les protéines de cette famille possèdent une fonction de reconnaissance protéines-protéines.

Anaerobic fermentation has been an established technology ever since man started treating sewage. Recently this process has received increased attention because of its inherent ability to produce methane gas, which apart from solar energy, is the cleanest, most non-polluting source of energy. Methanobacterium thermoautotrophicum, a thermophilic bacterium, grows on CO(,2) as a source of carbon as well as electron acceptor, using hydrogen as an electron donor. Labeling studies carried out with ('14)C have shown a presence of partial reductive TCA cycle. In this work, the enzyme fumarate reductase, which belongs to this cycle, has been purified to homogeneity using various separation techniques. In keeping with the thermophilic character of the organism, fumarate reductase is extremely heat resistant. Incubation at 75(DEGREES)C for 24 hours led to an increase in purification. In contrast, the enzyme was found to be very sensitive to oxygen. The crude extract, when exposed to air, lost half of its activity within 20 minutes. Reducing agents were helpful in protecting against loss of enzymatic activity provided that a strict anaerobic atmosphere was maintained. For this reason, the entire purification was performed inside a Freter-type anaerobic chamber using reducing agents. The molecular weight of the native fumarate reductase, as determined by Sephacryl S-300 gel exclusion chromatography, was found to be approximately 80,000. SDS polyacrylamide gel electrophoresis data suggested that the enzyme is a tetramer. Treatment with sulfhydyl reagents as well as Cu('++) caused loss in fumarate reductase activity, indicating that the enzyme contains at least one sulfhydryl group which is important to its activity. The UV/Visible spectrum of fumarate reductase did not reveal the presence of a flavin moiety as a cofactor. Both UV/Visible and fluorescence spectra of fumarate reductase from M. thermoautotrophicum instead, indicated the presence of an unusual cofactor, which could be similar to either tetrahydromethanopterin or F(,420).

Thesis (Ph. D.)--Auburn University, 2008. / Abstract. Vita. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2005. / Title from first page of PDF file. Document formatted into pages; contains xiv, 200 p.; also includes graphics (some col.). Includes bibliographical references (p. 167-197). Available online via OhioLINK's ETD Center

La réduction d'émission des gaz à effet de serre devient actuellement une priorité mondiale. À cet égard, CC^Solution inc. a développé une technologie qui pourrait permettre aux industriels de réduire leurs émissions de CO2 (principal gaz à effet de serre) grâce à l'action d'un catalyseur biologique, soit une métallo-(Zn)-enzyme immobilisée à l'intérieur d'un bioréacteur et capable d'hydrater le CO2 en HCO3". Or il s'avère que la température des effluents gazeux industriels est souvent très élevée, ce qui est incompatible avec l'enzyme actuellement utilisée qui serait rapidement dégradée. Cependant, il existe des micro-organismes vivants à hautes températures (thermophiles) qui produisent des enzymes adaptées et donc fonctionnelles dans de telles conditions. Methanobacterium thermoautotrophicum en est un bel exemple puisqu'on la retrouve dans les sources thermales où la température avoisine 70° C et qu'elle synthétise une enzyme, l'anhydrase carbonique (MTCA), capable d'hydrater le CO2. Le projet avait pour but la production d'une anhydrase carbonique thermostable, active sous une forme immobilisée et donc capable d'hydrater le CO2 en HCO3" dans un bioréacteur destiné à la réduction du dioxyde de carbone dans un environnement ouvert ou fermé. Ce projet se divisait en trois étapes : le clonage du gène de MTCA à partir de l'ADN génomique de M. thermoautotrophicum, la purification de MTCA par chromatographie échangeuse d'ions, la mise à l'échelle des étapes de production de MTCA et l'étude de l'immobilisation de MTCA selon deux méthodes. La première méthode d'immobilisation consistait à la liaison covalente sur fibre de coton à l'aide de glutaraldéhyde, l'autre à la séquestration dans un réseau poreux de silice à partir de tetramethoxysilane (TMOS). La séquestration dans un réseau poreux de silice s'est avérée plus efficace que la liaison covalente sur fibre de coton pour la récupération d'activité post-immobilisation et a donc été choisie pour subir les essais sur la résistance thermique. En ce qui a trait à la séquestration, un mélange typique d'alkoxysilane (TMOS-H2O-HCI), aussi appelé sol-gel, a été utilisé. L'optimisation des paramètres de maturation du sol-gel a permis de conserver une activité relative d'hydratation du CO2 allant jusqu'à 25 % de l'activité initiale de l'enzyme libre en solution. La vitesse de consolidation du réseau de silice serait un facteur capital pour la conservation de l'activité post-immobilisation. Un même lot de sol-gel enrichi en MTCA a été soumis à des cycles répétés d'essais d'hydratation du CO2. Une diminution appréciable de 50% d'activité fut observée suite au premier essai, mais cette diminution tend à s'atténuer lors des cycles subséquents. L'impact de la silanisation sur la résistance thermale de MTCA a également été étudié. La séquestration de MTCA dans un réseau de silice a permis d'augmenter d'environ 15° C la plage d'activité de l'enzyme pour atteindre 85° C et ce, comparativement à la forme libre en solution, suite à un traitement à la chaleur de 15 min. Cet effet serait dû à la formation d'une cage de silice autour de l'enzyme menant une consolidation des structures tertiaires et quaternaires. La séquestration d'anhydrases carboniques dans un réseau poreux de silice s'est avérée une avenue fort prometteuse pour le développement futur de procédés enzymatiques d'hydratation du CO2 à hautes températures.