O comércio mundial de enzimas industriais estava estimado em 2.3 bilhões de dólares entre detergentes (U$ 789 milhões), aplicações alimentícias (U$ 634 milhões), agricultura (U$ 237 milhões), entre outros. Neste contexto, as enzimas lipolíticas estão atraindo enorme atenção devido ao seu potencial biotecnológico, visto que estas podem catalisar múltiplas reações (hidrólise, acidólise, interesterificação e glicerólise). Enzimas lipolíticas de origem microbiana são economicamente atrativas por serem biodegradáveis, atuarem normalmente em condições brandas, e serem quimio-seletivas propiciando à indústria farmacêutica a obtenção de drogas com efeito colateral reduzido. Neste projeto, quatro genes potenciais codificadores de esterases/lipases, advindos de uma biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel, foram clonados em vetores de expressão e expressos em Escherichia coli BL21 (DE3), e as proteínas correspondentes foram submetidas a ensaios funcionais e estruturais. / The global trade of industrial enzymes is estimated at 2.3 billion U.S. dollars, divided mainly between detergents (US$ 789 million), food applications (US$ 634 million), and agriculture (US$ 237 million). Within this trade, lipolytic enzymes have attracted enormous attention because of their biotechnological potential as catalysts of multiple reaction types (including hydrolysis, acidolysis, interesterification and glycerolysis). Lipolytic enzymes of microbial origin are economically attractive because they are easily biodegradable, usually act in mild conditions, and are chemo-selective, providing the pharmaceutical industry a method for obtaining drugs with reduced side effects. In this project, four individual genes encoding putative esterases/lipases identified in a metagenomic library obtained from a microbe consortium isolated from diesel oil-contaminated soil were cloned into expression vectors and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3), and their corresponding recombinant proteins were used for functional and structural studies.

O comércio mundial de enzimas industriais estava estimado em 2.3 bilhões de dólares entre detergentes (U$ 789 milhões), aplicações alimentícias (U$ 634 milhões), agricultura (U$ 237 milhões), entre outros. Neste contexto, as enzimas lipolíticas estão atraindo enorme atenção devido ao seu potencial biotecnológico, visto que estas podem catalisar múltiplas reações (hidrólise, acidólise, interesterificação e glicerólise). Enzimas lipolíticas de origem microbiana são economicamente atrativas por serem biodegradáveis, atuarem normalmente em condições brandas, e serem quimio-seletivas propiciando à indústria farmacêutica a obtenção de drogas com efeito colateral reduzido. Neste projeto, quatro genes potenciais codificadores de esterases/lipases, advindos de uma biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel, foram clonados em vetores de expressão e expressos em Escherichia coli BL21 (DE3), e as proteínas correspondentes foram submetidas a ensaios funcionais e estruturais. / The global trade of industrial enzymes is estimated at 2.3 billion U.S. dollars, divided mainly between detergents (US$ 789 million), food applications (US$ 634 million), and agriculture (US$ 237 million). Within this trade, lipolytic enzymes have attracted enormous attention because of their biotechnological potential as catalysts of multiple reaction types (including hydrolysis, acidolysis, interesterification and glycerolysis). Lipolytic enzymes of microbial origin are economically attractive because they are easily biodegradable, usually act in mild conditions, and are chemo-selective, providing the pharmaceutical industry a method for obtaining drugs with reduced side effects. In this project, four individual genes encoding putative esterases/lipases identified in a metagenomic library obtained from a microbe consortium isolated from diesel oil-contaminated soil were cloned into expression vectors and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3), and their corresponding recombinant proteins were used for functional and structural studies.

Duas enzimas do clone PL14.H10 de biblioteca metagenômica de consórcio microbiano degradador de óleo diesel, EST3, da família IV, e EST5, da família V das enzimas lipolíticas, foram caracterizadas. Os modelos estruturais mostraram cap-domínio e grande cavidade interna. A EST3 hidrolisou pNP-ésteres de até 12 carbonos, com Kcat/Km para pNP-acetato foi 1533,27 s-1.mM-1. Já a EST5 hidrolisou pNP-ésteres de 2 a 14 átomos de carbono, com maior atividade em pNP-valerato, e Kcat/Km de 1732,3 s-1.mM-1. Ambas apresentaram o fenômeno da ativação térmica. A atividade máxima da EST5 se deu a 45°C e em pH 7,5. A EST3 exibiu atividade máxima em pH 6,0, a 41°C. A atividade das enzimas aumentou na presença de quase todos os íons testados, e a EST5 quase não foi influenciada por detergentes. Foram relativamente estáveis em solventes orgânicos. Um dos cristais da proteína EST5 difratou a 2,311 Å e espera-se resolver a estrutura desta proteína. Os resultados deste trabalho revelaram interessantes características da EST3 e EST5 para possíveis aplicações biotecnológicas. / Two enzymes of PL14.H10 clone from a metagenomic fosmid library from a microbial consortium specialized for diesel oil degradation, EST3, from family IV, and EST5, from the V of lipolytic enzymes were characterized. Structural models showed cap-domain and large internal cavity. EST3 hydrolyzed pNP-esters of up to 12 carbons, with Kcat/Km in pNP-acetate of 1533.27 s-1.mM-1. EST5 hydrolyzed pNP-esters from 2 to 14 carbon atoms, with greater activity on pNP-valerate, and Kcat/Km of 1732.3 s-1.mM-1. Both showed the thermal activation phenomenon. EST5 activity was optimal at 45°C and pH 7.5. EST3 exhibited maximum activity at pH 6.0, 41°C. The esterases activity increased in the presence of almost all ions tested, and EST5 was not influenced by detergents. They were relatively stable in organic solvents. One of the crystals of EST5 protein diffracted at 2.311 Å and is expected to solve the structure of this protein. The results of this study revealed interesting features of the EST3 and EST5 proteins for possible biotechnological applications.

Duas enzimas do clone PL14.H10 de biblioteca metagenômica de consórcio microbiano degradador de óleo diesel, EST3, da família IV, e EST5, da família V das enzimas lipolíticas, foram caracterizadas. Os modelos estruturais mostraram cap-domínio e grande cavidade interna. A EST3 hidrolisou pNP-ésteres de até 12 carbonos, com Kcat/Km para pNP-acetato foi 1533,27 s-1.mM-1. Já a EST5 hidrolisou pNP-ésteres de 2 a 14 átomos de carbono, com maior atividade em pNP-valerato, e Kcat/Km de 1732,3 s-1.mM-1. Ambas apresentaram o fenômeno da ativação térmica. A atividade máxima da EST5 se deu a 45°C e em pH 7,5. A EST3 exibiu atividade máxima em pH 6,0, a 41°C. A atividade das enzimas aumentou na presença de quase todos os íons testados, e a EST5 quase não foi influenciada por detergentes. Foram relativamente estáveis em solventes orgânicos. Um dos cristais da proteína EST5 difratou a 2,311 Å e espera-se resolver a estrutura desta proteína. Os resultados deste trabalho revelaram interessantes características da EST3 e EST5 para possíveis aplicações biotecnológicas. / Two enzymes of PL14.H10 clone from a metagenomic fosmid library from a microbial consortium specialized for diesel oil degradation, EST3, from family IV, and EST5, from the V of lipolytic enzymes were characterized. Structural models showed cap-domain and large internal cavity. EST3 hydrolyzed pNP-esters of up to 12 carbons, with Kcat/Km in pNP-acetate of 1533.27 s-1.mM-1. EST5 hydrolyzed pNP-esters from 2 to 14 carbon atoms, with greater activity on pNP-valerate, and Kcat/Km of 1732.3 s-1.mM-1. Both showed the thermal activation phenomenon. EST5 activity was optimal at 45°C and pH 7.5. EST3 exhibited maximum activity at pH 6.0, 41°C. The esterases activity increased in the presence of almost all ions tested, and EST5 was not influenced by detergents. They were relatively stable in organic solvents. One of the crystals of EST5 protein diffracted at 2.311 Å and is expected to solve the structure of this protein. The results of this study revealed interesting features of the EST3 and EST5 proteins for possible biotechnological applications.