Les microchampignons unicellulaires du genre Pneumocystis sont transmis par voie aérienne et pénètrent dans l’alvéole pulmonaire de l’homme et de nombreux mammifères. Si le système immunitaire est déficient, leur prolifération provoque une insuffisance respiratoire grave, souvent fatale. Les personnes concernées par cette pathologie sont principalement les individus séropositifs pour le VIH au stade SIDA mais également les patients recevant un traitement immunosuppresseur en cas de cancers, de greffe d’organes ou de maladies auto-immunes. Du fait de la très forte spécificité d’hôte qui caractérise ces microchampignons, l’étude directe de Pneumocystis jirovecii, l’espèce spécifique de l’homme, reste bien entendu limitée mais la présence d’autres espèces du parasite chez de nombreux mammifères a permis de développer des modèles expérimentaux performants. Néanmoins, la transition dynamique d’un stade parasitaire à l’autre n’a jamais était suivie en temps réel et la forme infectieuse demeure inconnue. Pour examiner ces aspects fondamentaux du cycle biologique de Pneumocystis, la séparation physique des stades parasitaires (formes trophiques ou formes kystiques) constitue l’un des pré-requis indispensable. Dans un premier temps, nous avons mis au point une nouvelle méthode pour obtenir des populations parasitaires totalement pures. L’utilisation d’un cytomètre trieur à haut débit (FACSAria®), suite à un coimmunomarquage spécifique, nous a permis de séparer les formes trophiques des formes kystiques avec une pureté proche de 100 %. Les parasites obtenus demeurant infectieux après inoculation intra-trachéale chez le rat Nude, nous avons pu les utiliser afin de clarifier les mécanismes qui sous-tendent la multiplication et la différenciation de Pneumocystis carinii. Notre but était de mieux comprendre le cycle biologique des organismes du genre Pneumocystis en tentant de répondre aux interrogations suivantes : quel est le ou les modes de multiplication des formes kystiques et trophiques de Pneumocystis ? Quelles sont les voies métaboliques activées chez les formes kystiques et trophiques ? Quels acteurs moléculaires sont impliqués dans le processus de différenciation des formes trophiques en formes kystiques ? Dans un premier temps, nous avons suivi le devenir de chaque stade parasitaire trié d’une part (i) dans le micro-environnement naturel des Pneumocystis, l’alvéole pulmonaire, après inoculation endotrachéale, chez le rat nude, et, d’autre part, (ii) in vitro dans des systèmes de cultures axéniques ou de co-cultures sur cellules épithéliales alvéolaires de rat (lignée cellulaire L2). Nos résultats suggèrent d’une part, que les formes trophiques peuvent, in vitro, se multiplier indépendamment des formes kystiques (sans toutefois permettre une croissance continue de P.carinii) et, d’autre part, que ces formes trophiques pures sont incapables de redonner, in vitro, des formes kystiques contrairement à nos observations chez l’animal. Ainsi, l’échec de la culture pourrait, en partie, être du à l’incapacité des formes trophiques à se différencier en formes kystiques in vitro. Ensuite, nous avons analysé la ploïdie des formes trophiques et kystiques afin de mieux appréhender les modes de multiplication de ces microchampignons, en utilisant un agent intercalant de l’ADN et en comparant le contenu en ADN de Pneumocystis à celui des souches référence haploïdes et diploïdes de Saccharomyces cerevisiae. Deux stratégies complémentaires ont été employées afin de comparer les transcrits exprimés par ces deux populations : (i) l’hybridation sur puces à ADN (en collaboration avec le Pr. Melanie Cushion, Université de Cincinnati, USA) et (ii) les banques soustractives d’ADN complémentaire. Globalement, ces résultats devraient permettre de clarifier les modes de multiplication et le cycle biologique de ces microchampignons opportunistes. / Pneumocystis organisms are atypical and ubiquitous microfungi that proliferate in the lungs of immuno-suppressed mammals, including human beings, thus provoking serious, and often life-threatening pneumonia. Patients suffering from this disease are mainly HIV-positive individuals and patients with primary immunodeficiency, patients receiving immunosuppressive therapies for malignancies, organ transplantations or autoimmune diseases. It is also considered as a worsening factor in respiratory diseases such as infant bronchiolitis and chronic obstructive pulmonary diseases (COPD). Even though Pneumocystis clinical spectrum is widening in the human population, fundamental aspects of its biology remain uncovered. To date, no continuous culture model is available, thus significantly preventing Pneumocystis research progress. Consequently, most Pneumocystis cell biology studies have to rely on competitive animal models while epidemiological studies on P. jirovecii stem from molecular biology data. What is more, dynamic Pneumocystis stage-to-stage transitions has never been followed nor do we know the infectious form. To examine these fundamental aspects of the Pneumocystis life cycle, separation of trophic and cystic forms is required. A reliable high speed sorting system (FACSAria cytometer, Becton Dickinson) was used to set up a new and efficient method of separation of P. carinii life cycle stages. Following specific coimmuostaining of both trophic and cystic forms of Pneumocystis, host cell debris were successfully eliminated and highly pure trophic and cystic form populations were reproducibly separated and collected for further analyses with a purity of 99,6 to 100%. These sorted populations remaining infectious in endotracheally-inoculated Pneumocystis-free Nude rats, they were used to clarify the mechanisms of multiplication and differenciation of P. carinii. Our aim was to better understand the life cycle of Pneumocystis organisms by addressing the following questions: How do the Pneumocystis trophic and cystic forms proliferate? Which are the active metabolic pathways in the trophic or cystic form populations? Which molecular actors are involved in the trophic-to-cystic form differenciation process? First of all, growth kinetics of either pure trophic or cystic forms of P. carinii were followed (i) in the natural Pneumocystis microenvironment (pulmonary alveolus), after endotracheal inoculation of either pure trophic or cystic populations in Pneumocystis-free Nude rats ; (ii) in vitro in an axenic short-term culture model or in co-culture with rat epithelial alveolar cells (L2 cell line). These experiments indicated that trophic forms could multiply in vitro but that they cannot develop into cystic forms, in contrast to what happened in the rat model. The lack of cyst production in vitro may explain the absence of continuous growth of Pneumocystis in this system. Second, ploidy of trophic and cystic forms was analysed to better understand the multiplication process of these micromycetes. A DNA intercalating agent allowed us to measure DNA contents of sorted trophic and cystic forms in comparison with DNA contents of haploid and diploid Saccharomyces cerevisiae reference strains. Trophic forms contain 1, 2, 3 and 4 DNA contents whereas cystic forms contain 8C of DNA. Finally, expression profiles of sorted Pneumocystis cystic or trophic populations were compared using microarray approaches (University of Cincinnati, USA) and subtraction cDNA libraries. All together, these results should shed new light on the intricate modes of multiplication and life cycle of these opportunistic micromycetes.