In recent years, on-site analysis has garnered increased interest from the scientific community. The development of smaller, more sophisticated analytical instruments, and the establishment of new environmental regulations have encouraged the application of new methodologies for field analysis. Prominent advantages of on-site analysis include elimination of error sources due to sample transportation and matrix modification, considerable reduction in analysis time, and more accurate and precise analytical results. Several techniques suitable for on-site analysis, which integrate sampling and sample preparation in one step, have demonstrated high versatility and throughput in field applications. This research was focused on the application and evaluation of three microextraction techniques: solid phase microextraction (SPME), needle trap devices (NTD) and membrane extraction with sorbent interface (MESI), which were then coupled with various portable instruments for on-site analysis of different systems. Additionally, the conducted project involved the development of an approach using ion mobility spectrometry detection (IMS) coupled with a miniaturized gas chromatograph (GC) as a powerful system for field analysis. This proposed GC-IMS exhibited satisfactory performance in terms of retention time (inter-day variation < 3%) and response stability (intra and inter-day relative standard deviations (RSDs) < 10 %). Moreover, when coupled with NTD, it showed limits of detection comparable to those provided by conventional benchtop instruments. Other portable GC instruments employed in this project included flame ionization and mass spectrometry detection. Three different sample systems were investigated using SPME and NTD together with these portable instruments: emissions of a pine branch, breath samples, and indoor pollutants in a polymer synthesis laboratory. Consequently, the feasibility of using SPME and NTD for determination of free and total concentrations was investigated. Finally, MESI was successfully coupled with the newly proposed GC-IMS system, and its functionality was evaluated by analyzing acetone in breath samples.

In recent years, on-site analysis has garnered increased interest from the scientific community. The development of smaller, more sophisticated analytical instruments, and the establishment of new environmental regulations have encouraged the application of new methodologies for field analysis. Prominent advantages of on-site analysis include elimination of error sources due to sample transportation and matrix modification, considerable reduction in analysis time, and more accurate and precise analytical results. Several techniques suitable for on-site analysis, which integrate sampling and sample preparation in one step, have demonstrated high versatility and throughput in field applications. This research was focused on the application and evaluation of three microextraction techniques: solid phase microextraction (SPME), needle trap devices (NTD) and membrane extraction with sorbent interface (MESI), which were then coupled with various portable instruments for on-site analysis of different systems. Additionally, the conducted project involved the development of an approach using ion mobility spectrometry detection (IMS) coupled with a miniaturized gas chromatograph (GC) as a powerful system for field analysis. This proposed GC-IMS exhibited satisfactory performance in terms of retention time (inter-day variation < 3%) and response stability (intra and inter-day relative standard deviations (RSDs) < 10 %). Moreover, when coupled with NTD, it showed limits of detection comparable to those provided by conventional benchtop instruments. Other portable GC instruments employed in this project included flame ionization and mass spectrometry detection. Three different sample systems were investigated using SPME and NTD together with these portable instruments: emissions of a pine branch, breath samples, and indoor pollutants in a polymer synthesis laboratory. Consequently, the feasibility of using SPME and NTD for determination of free and total concentrations was investigated. Finally, MESI was successfully coupled with the newly proposed GC-IMS system, and its functionality was evaluated by analyzing acetone in breath samples.

A necessidade de metodologias adequadas para análise de fármacos e seus metabólitos em matrizes biológicas complexas levaram a um crescente interesse no desenvolvimento de novas técnicas de preparação de amostras, particularmente as técnicas de microextração, por serem altamente seletivas e requererem o consumo mínimo de solventes orgânicos. Aliado a esses avanços, o emprego de modernas e eficientes tecnologias analíticas, como a eletroforese capilar (CE) e a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS-MS), tem resultado em um considerável avanço em qualidade nas metodologias analíticas disponíveis para bioanálises. Dentro desse cenário, destaca-se a utilização dessas técnicas para o desenvolvimento de metodologias enantiosseletivas, permitindo quantificar os enantiômeros de fármacos administrados como racematos. Sendo assim, propusemos o desenvolvimento e a validação de metodologias enantiosseletivas para a análise dos enantiômeros da mirtazapina (MRT) e de seus principais metabólitos em plasma e urina, utilizando a CE e a LC-MS-MS. Para a preparação das amostras foram empregadas a microextração em fase sólida (SPME) e a microextração em fase líquida (LPME). No primeiro método desenvolvido, a LPME foi utilizada para extrair os analitos das amostras de plasma (1 mL), previamente diluídas, alcalinizadas com 3,0 mL de uma solução tampão fosfato 0,5 mol L-1 (pH 8) e adicionadas de 15% (m/v) de cloreto de sódio. Éter n-hexílico e uma solução de ácido acético 0,01 moL L-1 foram utilizados como solvente extrator e fase aceptora, respectivamente. As análises cromatográficas foram feitas em uma coluna Chiralpak AD-RH, empregando acetonitrila:metanol:etanol (98:1:1, v/v/v) mais 0,2% de dietilamina como fase móvel, na vazão de 1 mL min-1. A detecção dos analitos foi conduzida por LC-MS-MS usando um analisador triplo-quadrupolo e ionização por eletrospray positivo. Nessas condições, foram obtidas recuperações de 18,3 a 45,5%, resposta linear na faixa de concentração de 1,25-125 ng mL-1 e limite de quantificação (LQ) de 1,25 ng mL-1 para todos os enantiômeros avaliados. Posteriormente, a CE e a LPME foram utilizadas para a análise da MRT e seus principais metabólitos em urina. Antes da extração, amostras de urina (1 mL) foram submetidas a hidrólise enzimática a 37 ºC por 16 horas. Então, a enzima foi precipitada com ácido tricloroacético, o pH foi ajustado para 8 com uma solução tampão fosfato 0,5 mol L-1 (pH 11) e 10% de NaCl também foi adicionado. Em seguida as amostras foram submetidas a extração de forma similar aquela realizada para as amostras de plasma. As análises eletroforéticas foram obtidas em uma solução tampão fosfato 50 mmol L-1 (pH 2,5) contendo 0,55% (m/v) de carboximetil-b-ciclodextrina (CM-b-CD). O método foi linear na faixa de concentração de 62,5-2500 ng mL-1 para cada enantiômero da MRT e 8-hidroximirtazapina (8-OHM) e 62,5-1250 ng mL-1 para cada enantiômero da desmetilmirtazapina (DMR). O LQ foi 62,5 ng mL-1 para todos os enantiômeros. A SPME também foi utilizada no desenvolvimento de um método para a determinação simultânea do fármaco e seus metabólitos em urina usando CE e LC-MS-MS. Os analitos de interesse foram transferidos da solução aquosa hidrolisada para uma fibra de polidimetilsiloxano-divinilbenzeno (PMDS-DVB) e então foram desorvidos em metanol. As recuperações médias foram de 12 % para os enantiômeros da MRT, 3,8 % para a DMR e 0,72 % para a 8-OHM. O método foi linear na faixa de concentração de 62,5-2500 ng mL-1 com adequado LQ (62,5 ng mL-1) para todos os enantiômeros. A precisão e exatidão foram menores que 15% para todos os métodos desenvolvidos. Além disso, os métodos foram adequadamente aplicados em estudos preliminares de determinação dos enantiômeros da MRT, 8-OHM e DMR em amostras de plasma e urina obtidos após a administração oral de uma dose única de rac-MRT a voluntários sadios. / The need for appropriate methodology for the analysis of drugs and their metabolites in complex biological matrices led to a growing interest in developing new techniques for sample preparation, particularly microextraction techniques because they are highly selective and require a minimum consumption of organic solvents. Allied to these developments, the employment of modern and efficient analytical technologies, such as capillary electrophoresis (CE) and high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS-MS), has resulted in a considerable improvement in quality in the analytical methodologies available for bioanalysis. In this context, it is worth to mention the use of such techniques to develop enantioselective methodologies, allowing the quantification of the enantiomers of drugs administered as racemates. Therefore, we proposed the development and validation of enantioselective methodologies for the analysis of the enantiomers of mirtazapine (MRT) and of its main metabolites in plasma and urine, using the CE and LC-MS-MS. Solid phase microextraction (SPME) and liquid phase microextraction (LPME) were used for sample preparation. In the first method, LPME was used to extract the analytes from plasma samples (1 ml), previously diluted, alkalinized with 3.0 mL 0.5 mol L-1 pH 8 phosphate buffer solution and supplemented with 15% (w/v) sodium chloride. N-hexyl ether and 0.01 mol L-1 acetic acid solution were used as solvent extractor and acceptor phase, respectively. The analyses were carried out on a CHIRALPAK AD-RH column and acetonitrile: methanol: ethanol (98:1:1, v / v / v) plus 0.2% of diethylamine was used as mobile phase, at a flow rate of 1 mL min-1. The detection was performed by LC-MS-MS equipped with a triple-quadrupole analyzer and ionization by eletrospray positive. Under these conditions, recoveries were from 18.3 to 45.5%; linear response over the 1,25-125 ng ml-1 concentration range and limit of quantification (LOQ) of 1.25 ng ml-1 for all enantiomers evaluated were obtained. CE and LPME were also used for the analysis of MRT and its main metabolites in urine. Before the extraction, urine samples (1 mL) were submitted to enzymatic hydrolysis at 37 ºC for 16 hours, the enzyme was precipitated with trichloroacetic acid, the pH was adjusted to 8 with 0.5 mol L-1 phosphate buffer solution (pH 11) and 10% (w/v) sodium chloride was further added. Then, the LPME extraction was performed according to the procedure previously developed. The electrophoretic analyses were carried out in 50 mmol L-1 phosphate buffer solution (pH 2.5) containing 0.55% (w/v) carboxymethyl-b-cyclodextrin (CM-b-CD). The method was linear over the concentration range of 62.5-2500 ng mL-1 for each MRT and 8-OHM enantiomer and 62.5-1250 ng mL-1 for each DMR enantiomer. The quantification limit (LOQ) was 62.5 ng mL-1 for all the enantiomers. A SPME method was also developed for the simultaneous enantioselective determination of MRT and its metabolites in urine using CE and LC-MS-MS. The target analytes were transferred from the hydrolyzed aqueous solution to the polydimetylsiloxane-divinylbenzene (PMDS-DVB) fiber coating and then desorbed in methanol. The means recoveries were 12 % for the enantiomers of MRT, 3.8 % for DMR and 0.72 % for 8-OHM. The method was linear over the concentration range of 62.5-2500 ng mL-1 with suitable LOQ (62.5 ng mL-1) for all the enantiomers. The precision and accuracy were lower than 15% for all developed methods. Moreover, the methods were successfully employed for the determination of MRT, 8-OHM and DMR enantiomers in plasma and urine samples obtained after oral administration of a single dose of rac-MRT to healthy volunteers.

A necessidade de metodologias adequadas para análise de fármacos e seus metabólitos em matrizes biológicas complexas levaram a um crescente interesse no desenvolvimento de novas técnicas de preparação de amostras, particularmente as técnicas de microextração, por serem altamente seletivas e requererem o consumo mínimo de solventes orgânicos. Aliado a esses avanços, o emprego de modernas e eficientes tecnologias analíticas, como a eletroforese capilar (CE) e a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS-MS), tem resultado em um considerável avanço em qualidade nas metodologias analíticas disponíveis para bioanálises. Dentro desse cenário, destaca-se a utilização dessas técnicas para o desenvolvimento de metodologias enantiosseletivas, permitindo quantificar os enantiômeros de fármacos administrados como racematos. Sendo assim, propusemos o desenvolvimento e a validação de metodologias enantiosseletivas para a análise dos enantiômeros da mirtazapina (MRT) e de seus principais metabólitos em plasma e urina, utilizando a CE e a LC-MS-MS. Para a preparação das amostras foram empregadas a microextração em fase sólida (SPME) e a microextração em fase líquida (LPME). No primeiro método desenvolvido, a LPME foi utilizada para extrair os analitos das amostras de plasma (1 mL), previamente diluídas, alcalinizadas com 3,0 mL de uma solução tampão fosfato 0,5 mol L-1 (pH 8) e adicionadas de 15% (m/v) de cloreto de sódio. Éter n-hexílico e uma solução de ácido acético 0,01 moL L-1 foram utilizados como solvente extrator e fase aceptora, respectivamente. As análises cromatográficas foram feitas em uma coluna Chiralpak AD-RH, empregando acetonitrila:metanol:etanol (98:1:1, v/v/v) mais 0,2% de dietilamina como fase móvel, na vazão de 1 mL min-1. A detecção dos analitos foi conduzida por LC-MS-MS usando um analisador triplo-quadrupolo e ionização por eletrospray positivo. Nessas condições, foram obtidas recuperações de 18,3 a 45,5%, resposta linear na faixa de concentração de 1,25-125 ng mL-1 e limite de quantificação (LQ) de 1,25 ng mL-1 para todos os enantiômeros avaliados. Posteriormente, a CE e a LPME foram utilizadas para a análise da MRT e seus principais metabólitos em urina. Antes da extração, amostras de urina (1 mL) foram submetidas a hidrólise enzimática a 37 ºC por 16 horas. Então, a enzima foi precipitada com ácido tricloroacético, o pH foi ajustado para 8 com uma solução tampão fosfato 0,5 mol L-1 (pH 11) e 10% de NaCl também foi adicionado. Em seguida as amostras foram submetidas a extração de forma similar aquela realizada para as amostras de plasma. As análises eletroforéticas foram obtidas em uma solução tampão fosfato 50 mmol L-1 (pH 2,5) contendo 0,55% (m/v) de carboximetil-b-ciclodextrina (CM-b-CD). O método foi linear na faixa de concentração de 62,5-2500 ng mL-1 para cada enantiômero da MRT e 8-hidroximirtazapina (8-OHM) e 62,5-1250 ng mL-1 para cada enantiômero da desmetilmirtazapina (DMR). O LQ foi 62,5 ng mL-1 para todos os enantiômeros. A SPME também foi utilizada no desenvolvimento de um método para a determinação simultânea do fármaco e seus metabólitos em urina usando CE e LC-MS-MS. Os analitos de interesse foram transferidos da solução aquosa hidrolisada para uma fibra de polidimetilsiloxano-divinilbenzeno (PMDS-DVB) e então foram desorvidos em metanol. As recuperações médias foram de 12 % para os enantiômeros da MRT, 3,8 % para a DMR e 0,72 % para a 8-OHM. O método foi linear na faixa de concentração de 62,5-2500 ng mL-1 com adequado LQ (62,5 ng mL-1) para todos os enantiômeros. A precisão e exatidão foram menores que 15% para todos os métodos desenvolvidos. Além disso, os métodos foram adequadamente aplicados em estudos preliminares de determinação dos enantiômeros da MRT, 8-OHM e DMR em amostras de plasma e urina obtidos após a administração oral de uma dose única de rac-MRT a voluntários sadios. / The need for appropriate methodology for the analysis of drugs and their metabolites in complex biological matrices led to a growing interest in developing new techniques for sample preparation, particularly microextraction techniques because they are highly selective and require a minimum consumption of organic solvents. Allied to these developments, the employment of modern and efficient analytical technologies, such as capillary electrophoresis (CE) and high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS-MS), has resulted in a considerable improvement in quality in the analytical methodologies available for bioanalysis. In this context, it is worth to mention the use of such techniques to develop enantioselective methodologies, allowing the quantification of the enantiomers of drugs administered as racemates. Therefore, we proposed the development and validation of enantioselective methodologies for the analysis of the enantiomers of mirtazapine (MRT) and of its main metabolites in plasma and urine, using the CE and LC-MS-MS. Solid phase microextraction (SPME) and liquid phase microextraction (LPME) were used for sample preparation. In the first method, LPME was used to extract the analytes from plasma samples (1 ml), previously diluted, alkalinized with 3.0 mL 0.5 mol L-1 pH 8 phosphate buffer solution and supplemented with 15% (w/v) sodium chloride. N-hexyl ether and 0.01 mol L-1 acetic acid solution were used as solvent extractor and acceptor phase, respectively. The analyses were carried out on a CHIRALPAK AD-RH column and acetonitrile: methanol: ethanol (98:1:1, v / v / v) plus 0.2% of diethylamine was used as mobile phase, at a flow rate of 1 mL min-1. The detection was performed by LC-MS-MS equipped with a triple-quadrupole analyzer and ionization by eletrospray positive. Under these conditions, recoveries were from 18.3 to 45.5%; linear response over the 1,25-125 ng ml-1 concentration range and limit of quantification (LOQ) of 1.25 ng ml-1 for all enantiomers evaluated were obtained. CE and LPME were also used for the analysis of MRT and its main metabolites in urine. Before the extraction, urine samples (1 mL) were submitted to enzymatic hydrolysis at 37 ºC for 16 hours, the enzyme was precipitated with trichloroacetic acid, the pH was adjusted to 8 with 0.5 mol L-1 phosphate buffer solution (pH 11) and 10% (w/v) sodium chloride was further added. Then, the LPME extraction was performed according to the procedure previously developed. The electrophoretic analyses were carried out in 50 mmol L-1 phosphate buffer solution (pH 2.5) containing 0.55% (w/v) carboxymethyl-b-cyclodextrin (CM-b-CD). The method was linear over the concentration range of 62.5-2500 ng mL-1 for each MRT and 8-OHM enantiomer and 62.5-1250 ng mL-1 for each DMR enantiomer. The quantification limit (LOQ) was 62.5 ng mL-1 for all the enantiomers. A SPME method was also developed for the simultaneous enantioselective determination of MRT and its metabolites in urine using CE and LC-MS-MS. The target analytes were transferred from the hydrolyzed aqueous solution to the polydimetylsiloxane-divinylbenzene (PMDS-DVB) fiber coating and then desorbed in methanol. The means recoveries were 12 % for the enantiomers of MRT, 3.8 % for DMR and 0.72 % for 8-OHM. The method was linear over the concentration range of 62.5-2500 ng mL-1 with suitable LOQ (62.5 ng mL-1) for all the enantiomers. The precision and accuracy were lower than 15% for all developed methods. Moreover, the methods were successfully employed for the determination of MRT, 8-OHM and DMR enantiomers in plasma and urine samples obtained after oral administration of a single dose of rac-MRT to healthy volunteers.

Neste trabalho, a microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca (HF-LPME), a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) e a microextração em fase sólida na configuração de um filme delgado (SPME/TFME) foram empregadas como técnicas de microextração para a preparação de amostras microssomais no estudo de metabolismo in vitro de fármacos quirais com diferentes características ácido-base. Para análise empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detector por absorção no UV e a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS-MS). O fármaco neutro isradipina (ISR) foi o primeiro a ser abordado. Um método estereosseletivo empregando HFLPME- HPLC foi desenvolvido para a determinação dos enantiômeros da ISR e seu principal metabólito (um derivado piridínico da isradipina - PDI) em fração microssomal isolada de fígado de ratos. Os analitos foram extraídos de 1 mL de meio microssomal utilizando o procedimento HF-LPME na configuração duas fases, tendo o solvente acetato de hexila como fase aceptora. Pela primeira vez, o PDI e os enantiômeros da ISR foram resolvidos numa mesma corrida cromatográfica. Para esta separação foi utilizada uma coluna Chiralpak AD® e hexano:2-propanol:etanol (94/04/02, v/v/v) como fase móvel, na vazão de 1,5 mL min-1. A ISR e o PDI foram detectados em 325 nm e o padrão interno, oxibutinina, foi detectado em 225 nm. A validação do método mostrou valores de recuperação de 23% para o PDI e 19% para cada enantiômero da ISR, 50 ng mL-1 como limite de quantificação (LOQ) para todos os analitos e linearidade entre 50-5000 ng mL-1 e 50-2500 ng mL-1 para o PDI e cada enantiômero da ISR, respectivamente. O método desenvolvido e validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro, utilizando microssomas hepáticos de ratos, mostrando que o (+)-(S)-ISR foi preferencialmente metabolizado. Do mesmo modo que para a ISR, um método analítico empregando HF-LPME-HPLC no modo três-fases foi desenvolvido para a análise estereosseletiva concomitante do bufuralol (BF) e dos seus principais metabólitos 1\'- oxobufuralol (1\'-Oxo-BF) e 1\'-hidroxibufuralol (1\'-OH-BF) em preparações microssomais. As análises por HPLC foram conduzidas empregando uma coluna Chiralcel OD-H® com fase móvel composta por hexano:2-propanol:metanol:dietilamina (97,5/2,0/0,5/0,5, v/v/v/v), na vazão de 1,5 mL min-1 e detecção em 248 nm e 273 nm. As condições otimizadas da HFLPME foram: n-octanol como solvente orgânico, ácido acético 0,2 mol L-1 como fase aceptora, fase doadora com pH ajustado em 13 e agitação de 1500 rpm por 30 min. O método foi validado e apresentou valores de recuperação entre 63 - 69% para os analitos e mostrou-se linear entre 100 - 5000 ng mL-1 para cada enantiômero do 1\'-Oxo-BF e 100 - 2500 ng mL-1 para cada estereoisômero do 1\'-OH-BF (r > 0,99), com LOQ de 100 ng mL-1 para todos os analitos. O método desenvolvido e validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro do BF utilizando microssomas hepáticos de ratos, que mostrou formação predominante do (S)-1\'-Oxo-BF e do (R,R)-1\'-OH-BF. Um segundo fármaco básico abordado neste trabalho foi a ranolazina (RNZ). Para a análise enantiosseletiva da RNZ e de um de seus metabólitos (desmetil ranolazina - DRNZ) em fração microssomal isolada de fígado de ratos, foi desenvolvido um método estereosseletivo empregando a DLLME-LC-MS-MS. Os analitos foram extraídos de 0,5 mL de meio microssomal utilizando o procedimento DLLME, tendo o clorofórmio como solvente extrator e acetona como solvente dispersante. Pela primeira vez os enantiômeros da RNZ e DRNZ foram resolvidos numa mesma corrida cromatográfica. ii Para esta separação foi utilizada uma coluna Chiralcel OD-H® e hexano:etanol (60/40, v/v) e 0,05% de dietilamina como fase móvel, na vazão de 1,0 mL min-1. A validação do método mostrou valores de recuperação em torno dos 55 e 45% para os enantiômeros da RNZ e DRNZ, respectivamente. Os LOQ foram de 25 ng mL-1 para cada enantiômero da RNZ e 10 ng mL-1 para cada enantiômero da DRNZ. A linearidade foi estabelecida entre 10-1000 ng mL-1 e 25-2500 ng mL-1 para cada enantiômero da DRNZ e RNZ, respectivamente. O método desenvolvido e validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro utilizando microssomas hepáticos de ratos, mostrando que a metabolismo da RNZ foi enantiosseletivo. Finalmente, um método analítico empregando a SPME/TFME-LC-MS-MS foi desenvolvido para a análise simultânea do fármaco anfótero repaglinida (RPG) e dois dos seus principais metabólitos, a 2-despiperiril-2-amino-repaglinida (DA-RPG) e a 2-despiperidil-2-(5- carboxipentilamina)-repaglinida (DC-RPG) em fração microssomal isolada de fígado humano. A SPME/TFME foi conduzida com o auxílio do equipamento Multi Sampler SPME nas seguintes condições: pré-condicionamento dos blades com 1 mL de uma solução metanol:água (50/50, v/v) por 30 min, 60 min de extração e 90 min de dessorção com 1 mL de fase móvel. A análise por LC-MS-MS foi feita empregando uma coluna cromatográfica C18 em modo reverso, com fase móvel composta por acetonitrila:água (50/50, v/v) e 0,1% de ácido acético, na vazão de 0,5 mL min-1. A validação do método mostrou valores de recuperação acima dos 80% para todos os analitos. O LOQ foi de 2 ng mL-1 para todos os analitos, sendo o método linear no intervalo 2-1000 ng mL-1 para a RPG e 2-500 ng mL-1 para a DA-RPG e DC-RPG. Os analitos foram estáveis durante todo o protocolo analítico e de metabolismo. O método validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro utilizando microssomas hepáticos de humanos, mostrando que o perfil metabólico da RPG e a taxa de formação da DA-RPG e DC-RPG é alterada em função da concentração de proteínas microssomais no meio de incubação e também em função do tempo de incubação. Além disso, os resultados mostrama possibilidade de haver diversos outros metabólitos que não foram monitorados. / In the present work, the microextraction techniques hollow-fiber liquid phase microextraction (HF-LPME), dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and solid phase microextraction based on thin film (SPME/TFME) were used as sample preparation techniques to study the in vitro metabolism of chiral drugs with distinct acid-base characteristics. High-performance liquid chromatography (HPLC) with UV detection and liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS-MS) were used for the analyses. An enantioselective liquid chromatographic method using two-phase hollow- fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME-HPLC) was developed for the determination of isradipine (ISR) enantiomers and its main metabolite (pyridine derivative of isradipine - PDI) in microsomal fraction isolated from rat liver. The analytes were extracted from 1 mL of microsomal medium using a two-phase HF-LPME procedure with hexyl acetate as the acceptor phase, 30 min of extraction and sample agitation at 1500 rpm. For the first time, ISR enantiomers and PDI were resolved. For this separation, a Chiralpak AD® column with hexane:2-propanol:ethanol (94/04/02, v/v/v) as mobile phase at a flow rate of 1.5 mL min-1 were used. The column was kept at 23 °C ± 2. The drug and metabolite detection was performed at 325 nm and the internal standard oxybutynin was detected at 225 nm. The recovery rates were 23% for PDI and 19% for each ISR enantiomer. The method presented quantification limits (LOQ) of 50 ng mL-1 and it was linear over the concentration range of 50-5000 ng mL-1 and 50-2500 ng mL-1 for PDI and each ISR enantiomer, respectively. The validated method was employed to an in vitro metabolism study of ISR using rat liver microsomal fraction, showing that (+)-(S)-ISR is preferentially metabolized. In the same way, a three-phase HF-LPME-HPLC method for the stereoselective determination of bufuralol metabolites, 1\'-oxobufuralol (1\'-Oxo-BF) and 1\'-hydroxybufuralol (1\'-OH-BF), in microsomal preparations is described for the first time. The HPLC analysis was carried out using a Chiralcel OD-H® column with hexane:2-propanol:methanol (97.5/2.0/0.5, v/v/v) plus 0.5% diethylamine as the mobile phase, and UV detection at 248 and 273 nm. The HF-LPME optimized conditions involved: n-octanol as the organic solvent, 0.2 mol L-1 acetic acid as the acceptor phase, donor phase pH adjusted to 13, sample agitation at 1500 rpm and extraction for 30 min. By using this extraction procedure, the recovery rates were in the range of 63- 69%. The method was linear over the concentration range of 100-5000 ng mL-1 for each enantiomer of 1\'-Oxo-BF and of 100-2500 ng mL-1 for each stereoisomer of 1\'-OH-BF. The quantification limits were 100 ng mL-1 for all analytes. The validated method was used to assess the in vitro metabolism of bufuralol using rat liver microsomal fraction that demonstrated predominant formation of (S)-1\'-Oxo-BF and (R,R)-1\'-OH-BF. A second basic drug addressed in this thesis is ranolazine (RNZ). For the chiral analysis of RNZ and one of its metabolites (desmethyl ranolazine - DRNZ) in microsomal fraction isolated from rat liver, an analytical enantioselective method using DLLME-LC-MS-MS was developed. The analytes were extracted from 0.5 mL of microsomal medium by DLLME. Chloroform was the extractor solvent and acetone the dispersive solvent. The enantiomers of RNZ and DRNZ were analyzed simultaneously for the first time using a Chiralcel OD-H® column and hexane:ethanol (60/40, v/v) plus 0.05% diethylamine as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL min-1. Method validation showed recoveries in the order of 55 and 45% for the enantiomers iv of RNZ and DRNZ, respectively. The LOQs were 25 ng mL-1 for each RNZ enantiomers and 10 ng mL-1 for each DRNZ enantiomers. Linearity was established between 10-1000 ng mL-1 and 25-2500 ng mL-1 for each DRNZ and RNZ enantiomers, respectively. The validated method was employed to an in vitro metabolism study of RNZ using rat liver microsomal fraction, showing that the metabolism of RNZ is enantioselective. Finally, an analytical method was developed employing SPME/TFME-LC-MS-MS for the simultaneous analyses of the anphoteric drug repaglinide (RPG) and two of the its main metabolites 2-despiperidyl- 2-amino repaglinide (DA-RPG) and 2-despiperidyl-2-(5-carboxypentylamine) repaglinide (DC-RPG) in human microsomal fraction. The SPME/TFME procedure was carried out with the support of \"Multi Sampler SPME\" under the following conditions: conditioning of the blades with 1 mL of methanol:water (50/50, v/v) for 30 min, 60 min for extraction and 90 min for desorption with 1 mL of mobile phase. The LC-MS-MS analyses were performed using a C18 column under reversed phase conditions, with the mobile phase of acetonitrile:water (50/50, v/v) plus 0.1% acetic acid at a flow rate of 0.5 mL min-1. The method validation showed recoveries over 80% for all analytes. The LOQ was 2 ng mL-1 for all analytes, and the method was linear over the concentration range of 2 e 1000 ng mL-1 for RPG and of 2 a 500 ng mL-1 for DA-RPG and DC-RPG. The validated method was used to assess the in vitro metabolism profile of RPG by using human liver microsomes. These studies showed that the rate of formation of DA-RPG and DC-RPG depends on both microsomal protein concentration in the incubation medium and the incubation time. Furthermore, the results highlighted the possibility of formation of several other metabolites which have not been monitored.

microssomas hepático de humanos (HLMs) e biotransformação empregando fungos. Anteriormente aos estudos de biotransformação e metabolismo in vitro, todos os métodos propostos foram validados e os resultados corroboraram de acordo com os guiais oficiais. Inicialmente foi desenvolvido um método para determinação simultânea da OXC e os enantiômeros de seu metabólito em meio de cultura empregando a eletroforese capilar. A separação foi realizada utilizando como eletrólito de análise uma mistura da ?-ciclodextrina fosfatada (P-?-CD) 1% (m/v) como seletor quiral em solução tampão tris-fosfato 10 mmol L-1 pH 2,5. O comprimento efetivo do capilar foi 20 cm, a tensão aplicada foi de ?20 kV e a temperatura de análise foi de 15° C. Para esse método, nenhuma técnica miniaturizada de preparação de amostra foi efetiva na extração desses analitos do meio de cultura. Portanto, optou-se por utilizar extração líquidolíquido empregando metil-terc-butil éter como solvente extrator. Os estudos de biotransformação demonstraram enantiosseletividade na formação da licarbazepina (LIC) a partir da OXC para duas espécies de fungos. A espécie Glomerella cingulata (VA1), biotransformou com 100% de fração enantiomérica (fe) o enantiômero (S)-(+)- LIC enquanto que a espécie Beuveria bassiana (ATCC 7159) metabolizou com fe de 79% o enantiômero (S)-(+)-LIC. Um outro método empregando a eletroforese capilar também foi desenvolvido neste trabalho. Este novo método foi empregado para a análise enantiosseletiva dos metabólitos da diHTBZ após o procedimento de metabolismo in vitro empregando microssomas hepático de humanos para o fármaco TBZ e também foi utilizado para análise dos metabólitos diHTBZ após o procedimento de biotransformação da TBZ empregando fungos. Neste método de EC foi utilizada como eletrólito de análise a carboximetil-?-ciclodextrina (CM-?-CD) 1% (m/v) como seletor quiral adicionada em solução tampão tris-fosfato 80 mmol L-1 pH 2,5. O comprimento efetivo do capilar correspondeu a 20 cm e a tensão aplicada foi de +15 kV. A temperatura de análise foi de 15° C. Entre as técnicas miniaturizadas de preparação de amostras avaliadas para extração destes metabólitos diHTBZ tanto em meio microssomal quanto em meio de cultura líquido, a DLLME foi escolhida. Para tanto, utilizando a matriz de meio microssomal (para aplicação dos estudos de metabolismo in vitro da TBZ) foi empregado 75 ?L de diclorometano como solvente extrator e 150 ?L de acetona como solvente dispersor. Os estudos de metabolismo in vitro demonstraram que o perfil cinético do metabolismo da TBZ corresponde a um comportamento de inibição pelo substrato e trata-se de um metabolismo diastereo- e enantiosseletivo. Estes estudos também demonstraram que os enantiômeros dos diastereoisômeros diHTBZ foram catalisados principalmente pela CYP2C19 e o clearance predito sugere que o metabolismo pelo fígado é a principal via para a eliminação da TBZ. Já, nos estudos de biotransformação com fungos para a TBZ, o método por CE foi utilizado e, assim como para o meio microssomal, as técnicas de microextração foram avaliadas. Novamente, foi escolhida a técnica DLLME como técnica de extração, e também foi utilizado 75 ?L de diclorometano como solvente extrator e 150 ?L de acetona como solvente dispersor. Os estudos preliminares de biotransformação da TBZ demonstraram diastereoisomerismo para todos os fungos avaliados, e, adicionalmente, para algumas espécies de fungos, houve também enantiosseletividade na formação dos isômeros. O fungo Chaetomiun globusum (VR10) metabolizou ambos isômeros da diHTBZ, sendo que a produção dos metabólitos foi diastereosseletiva para a formação majoritária do estereoisômero trans-diHTBZ e enantiosseletividade somente na produção do estereoisômero cisdiHTBZ. As espécies Glomerella cingulata (VA1), Mucor rouxii, e Beuveria bassiana (ATCC 7159), metabolizaram diastereoisomericamente e também enantiosseletivamente ambos metabólitos da diHTBZ, sendo que o fungo da espécie Mucor rouxii apresentou um perfil de metabolização bem interessante, com a formação majoritária dos enantiômeros (E1) dos diastereoisômeros cis- e trans- e formação majoritária do metabólito trans-diHTBZ. Os resultados apresentados nesse trabalho demonstraram que somente a DLLME foi efetiva na extração da TBZ em meio microssomal e em meio de cultura. Para analitos com características bastante básicas, como é o caso da OXC, as demais técnicas de microextração avaliadas não foram eficientes nas condições de análise empregadas nesse estudo devido principalmente à dificuldade de manter estes analitos na forma molecular. Porém, a importância deste trabalho recai sobre os resultados obtidos a partir da aplicação dos estudos estereosseletivos de biotransformação com fungos de ambos os fármacos e, principalmente, nos resultados obtidos do metabolismo in vitro da TBZ que corroboram com dados in vivo da literatura e traz novas informações a respeito do metabolismo deste fármaco / Nowadays miniaturized extraction techniques are widely used in many sectors of analytical chemistry because they present several advantages such as: the ability to extract analytes in levels of trace employing minimal or none amounts of organic solvents; facility of automation and speed in the extraction procedure. New methodologies with the aim of producing pure enantiomers of drugs marketed as racemates are also very promising. In this context, this study aimed to evaluate the miniaturized sample preparation techniques, Solid Phase Microextraction (SPME), Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction (HF-LPME) and Dispersive Liquid-Liquid Microextraction (DLLME) in extraction of drugs and their metabolites: oxcarbazepine (OXC) and tetrabenazine (TBZ) from complex matrices such as microsomal medium and liquid culture medium for subsequent application in stereoselective in vitro metabolism using human liver microsomes (HLMs) and in biotransformation studies employing fungi as catalytic agent. Prior to the biotransformation and the in vitro metabolism studies, all the proposed methods were validated and the results were in agreement with the official guidelines. Initially, an enantioselective capillary electrophoresis method was developed for the simultaneous determination of OXC and its metabolites in liquid culture medium. The chiral separation was carried out using phosphated ?-cyclodextrin (P-?-CD) 1% (w/v) as the chiral selector in tris-phosphate 10 mmol L-1 pH 2.5 buffer solution. The effective length of the capillary was 20 cm, the applied voltage was ?20 kV and the temperature of analysis was 15 °C. For this method, no miniaturized sample preparation technique was effective in extracting these analytes from the culture medium. Therefore, liquid-liquid extraction using methyl tert-butyl ether as solvent extractor as employed. The biotransformation studies showed enantioselectivity in the formation of licarbazepine (LIC) by two fungus species. The specie Glomerella cingulata (VA1) biotransformed OXC with 100% of enantiomeric fraction (EF) for the (S)-(+)-LIC enantiomer while the fungus Beuveria bassiana (ATCC 7159) metabolized with EF of 79% for the (S)-(+)-LIC enantiomer. Next, another method by capillary electrophoresis was also developed in this work. This new method was employed for the enantioselective analysis of diHTBZ metabolites after in vitro microsomal metabolism of the drug TBZ. Additionally, this method was used to analyze the diHTBZ metabolites after TBZ biotransformation by fungi. The chiral separation of diHTBZ metabolites was performed by using carboxymethyl-?-cyclodextrin (CM-?-CD) 1% (w/v) as the chiral selector added to trisphosphate buffer solution 80 mmol L-1 pH 2.5. The effective length of the capillary was 20 cm and the applied voltage was +15 kV. The analysis temperature was 15 °C. Among the miniaturized sample preparation techniques evaluated for the extraction of diHTBZ metabolites from both matrices, human liver microsomal and in liquid culture medium, DLLME showed to be the most adequate. Therefore, using microsomal medium as matrix 75 ?L dichloromethane as solvent extractor and 150 ?L acetone as disperser solvent was used. The in vitro metabolism of TBZ showed a kinetic profile of inhibition by substrate and demonstrated a diastereo- and enantioselective metabolism. These studies showed also that the enantiomers of the diastereomers of the diHTBZ were catalyzed mainly by CYP2C19 and the predicted clearance suggests that the metabolism by the liver is the major pathway for the elimination of TBZ. For the last, for fungal biotransformation studies with TBZ, 75 ?L was used as extracting solvent of dichloromethane and 150 ?L acetone as solvent disperser for the DDLME procedure. Preliminary biotransformation studies TBZ demonstrated a diastereoisomerism for all evaluated fungi, and additionally for some species of fungi, showed enantioselectivity in the formation of isomers. The fungus Chaetomiun globusum (VR10) metabolized both isomers of diHTBZ, and the production of metabolites was diastereoselective with majority formation of the trans-stereoisomer diHTBZ and enantioselectivity only in the production of cis-stereoisomer diHTBZ. The species Glomerella cingulata (VA1), Mucor rouxii, and Beuveria bassiana (ATCC 7159), metabolized diastereomerically and also enantiosselectivelly both metabolites of diHTBZ. The fungus Mucor rouxii showed an interesting biotransformation profile, with the majority training enantiomers (E1) of cis- and trans- diastereoisomers and majority formation of trans-diHTBZ metabolite. The results presented in this study showed that only DLLME was effective in extracting the TBZ from microsomal and liquid culture medium. For analytes with very basic features such as the OXC, the other evaluated microextraction techniques were not effective under the conditions employed in this study due mainly to the difficulty of keeping these analytes in the molecular form.

microssomas hepático de humanos (HLMs) e biotransformação empregando fungos. Anteriormente aos estudos de biotransformação e metabolismo in vitro, todos os métodos propostos foram validados e os resultados corroboraram de acordo com os guiais oficiais. Inicialmente foi desenvolvido um método para determinação simultânea da OXC e os enantiômeros de seu metabólito em meio de cultura empregando a eletroforese capilar. A separação foi realizada utilizando como eletrólito de análise uma mistura da ?-ciclodextrina fosfatada (P-?-CD) 1% (m/v) como seletor quiral em solução tampão tris-fosfato 10 mmol L-1 pH 2,5. O comprimento efetivo do capilar foi 20 cm, a tensão aplicada foi de ?20 kV e a temperatura de análise foi de 15° C. Para esse método, nenhuma técnica miniaturizada de preparação de amostra foi efetiva na extração desses analitos do meio de cultura. Portanto, optou-se por utilizar extração líquidolíquido empregando metil-terc-butil éter como solvente extrator. Os estudos de biotransformação demonstraram enantiosseletividade na formação da licarbazepina (LIC) a partir da OXC para duas espécies de fungos. A espécie Glomerella cingulata (VA1), biotransformou com 100% de fração enantiomérica (fe) o enantiômero (S)-(+)- LIC enquanto que a espécie Beuveria bassiana (ATCC 7159) metabolizou com fe de 79% o enantiômero (S)-(+)-LIC. Um outro método empregando a eletroforese capilar também foi desenvolvido neste trabalho. Este novo método foi empregado para a análise enantiosseletiva dos metabólitos da diHTBZ após o procedimento de metabolismo in vitro empregando microssomas hepático de humanos para o fármaco TBZ e também foi utilizado para análise dos metabólitos diHTBZ após o procedimento de biotransformação da TBZ empregando fungos. Neste método de EC foi utilizada como eletrólito de análise a carboximetil-?-ciclodextrina (CM-?-CD) 1% (m/v) como seletor quiral adicionada em solução tampão tris-fosfato 80 mmol L-1 pH 2,5. O comprimento efetivo do capilar correspondeu a 20 cm e a tensão aplicada foi de +15 kV. A temperatura de análise foi de 15° C. Entre as técnicas miniaturizadas de preparação de amostras avaliadas para extração destes metabólitos diHTBZ tanto em meio microssomal quanto em meio de cultura líquido, a DLLME foi escolhida. Para tanto, utilizando a matriz de meio microssomal (para aplicação dos estudos de metabolismo in vitro da TBZ) foi empregado 75 ?L de diclorometano como solvente extrator e 150 ?L de acetona como solvente dispersor. Os estudos de metabolismo in vitro demonstraram que o perfil cinético do metabolismo da TBZ corresponde a um comportamento de inibição pelo substrato e trata-se de um metabolismo diastereo- e enantiosseletivo. Estes estudos também demonstraram que os enantiômeros dos diastereoisômeros diHTBZ foram catalisados principalmente pela CYP2C19 e o clearance predito sugere que o metabolismo pelo fígado é a principal via para a eliminação da TBZ. Já, nos estudos de biotransformação com fungos para a TBZ, o método por CE foi utilizado e, assim como para o meio microssomal, as técnicas de microextração foram avaliadas. Novamente, foi escolhida a técnica DLLME como técnica de extração, e também foi utilizado 75 ?L de diclorometano como solvente extrator e 150 ?L de acetona como solvente dispersor. Os estudos preliminares de biotransformação da TBZ demonstraram diastereoisomerismo para todos os fungos avaliados, e, adicionalmente, para algumas espécies de fungos, houve também enantiosseletividade na formação dos isômeros. O fungo Chaetomiun globusum (VR10) metabolizou ambos isômeros da diHTBZ, sendo que a produção dos metabólitos foi diastereosseletiva para a formação majoritária do estereoisômero trans-diHTBZ e enantiosseletividade somente na produção do estereoisômero cisdiHTBZ. As espécies Glomerella cingulata (VA1), Mucor rouxii, e Beuveria bassiana (ATCC 7159), metabolizaram diastereoisomericamente e também enantiosseletivamente ambos metabólitos da diHTBZ, sendo que o fungo da espécie Mucor rouxii apresentou um perfil de metabolização bem interessante, com a formação majoritária dos enantiômeros (E1) dos diastereoisômeros cis- e trans- e formação majoritária do metabólito trans-diHTBZ. Os resultados apresentados nesse trabalho demonstraram que somente a DLLME foi efetiva na extração da TBZ em meio microssomal e em meio de cultura. Para analitos com características bastante básicas, como é o caso da OXC, as demais técnicas de microextração avaliadas não foram eficientes nas condições de análise empregadas nesse estudo devido principalmente à dificuldade de manter estes analitos na forma molecular. Porém, a importância deste trabalho recai sobre os resultados obtidos a partir da aplicação dos estudos estereosseletivos de biotransformação com fungos de ambos os fármacos e, principalmente, nos resultados obtidos do metabolismo in vitro da TBZ que corroboram com dados in vivo da literatura e traz novas informações a respeito do metabolismo deste fármaco / Nowadays miniaturized extraction techniques are widely used in many sectors of analytical chemistry because they present several advantages such as: the ability to extract analytes in levels of trace employing minimal or none amounts of organic solvents; facility of automation and speed in the extraction procedure. New methodologies with the aim of producing pure enantiomers of drugs marketed as racemates are also very promising. In this context, this study aimed to evaluate the miniaturized sample preparation techniques, Solid Phase Microextraction (SPME), Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction (HF-LPME) and Dispersive Liquid-Liquid Microextraction (DLLME) in extraction of drugs and their metabolites: oxcarbazepine (OXC) and tetrabenazine (TBZ) from complex matrices such as microsomal medium and liquid culture medium for subsequent application in stereoselective in vitro metabolism using human liver microsomes (HLMs) and in biotransformation studies employing fungi as catalytic agent. Prior to the biotransformation and the in vitro metabolism studies, all the proposed methods were validated and the results were in agreement with the official guidelines. Initially, an enantioselective capillary electrophoresis method was developed for the simultaneous determination of OXC and its metabolites in liquid culture medium. The chiral separation was carried out using phosphated ?-cyclodextrin (P-?-CD) 1% (w/v) as the chiral selector in tris-phosphate 10 mmol L-1 pH 2.5 buffer solution. The effective length of the capillary was 20 cm, the applied voltage was ?20 kV and the temperature of analysis was 15 °C. For this method, no miniaturized sample preparation technique was effective in extracting these analytes from the culture medium. Therefore, liquid-liquid extraction using methyl tert-butyl ether as solvent extractor as employed. The biotransformation studies showed enantioselectivity in the formation of licarbazepine (LIC) by two fungus species. The specie Glomerella cingulata (VA1) biotransformed OXC with 100% of enantiomeric fraction (EF) for the (S)-(+)-LIC enantiomer while the fungus Beuveria bassiana (ATCC 7159) metabolized with EF of 79% for the (S)-(+)-LIC enantiomer. Next, another method by capillary electrophoresis was also developed in this work. This new method was employed for the enantioselective analysis of diHTBZ metabolites after in vitro microsomal metabolism of the drug TBZ. Additionally, this method was used to analyze the diHTBZ metabolites after TBZ biotransformation by fungi. The chiral separation of diHTBZ metabolites was performed by using carboxymethyl-?-cyclodextrin (CM-?-CD) 1% (w/v) as the chiral selector added to trisphosphate buffer solution 80 mmol L-1 pH 2.5. The effective length of the capillary was 20 cm and the applied voltage was +15 kV. The analysis temperature was 15 °C. Among the miniaturized sample preparation techniques evaluated for the extraction of diHTBZ metabolites from both matrices, human liver microsomal and in liquid culture medium, DLLME showed to be the most adequate. Therefore, using microsomal medium as matrix 75 ?L dichloromethane as solvent extractor and 150 ?L acetone as disperser solvent was used. The in vitro metabolism of TBZ showed a kinetic profile of inhibition by substrate and demonstrated a diastereo- and enantioselective metabolism. These studies showed also that the enantiomers of the diastereomers of the diHTBZ were catalyzed mainly by CYP2C19 and the predicted clearance suggests that the metabolism by the liver is the major pathway for the elimination of TBZ. For the last, for fungal biotransformation studies with TBZ, 75 ?L was used as extracting solvent of dichloromethane and 150 ?L acetone as solvent disperser for the DDLME procedure. Preliminary biotransformation studies TBZ demonstrated a diastereoisomerism for all evaluated fungi, and additionally for some species of fungi, showed enantioselectivity in the formation of isomers. The fungus Chaetomiun globusum (VR10) metabolized both isomers of diHTBZ, and the production of metabolites was diastereoselective with majority formation of the trans-stereoisomer diHTBZ and enantioselectivity only in the production of cis-stereoisomer diHTBZ. The species Glomerella cingulata (VA1), Mucor rouxii, and Beuveria bassiana (ATCC 7159), metabolized diastereomerically and also enantiosselectivelly both metabolites of diHTBZ. The fungus Mucor rouxii showed an interesting biotransformation profile, with the majority training enantiomers (E1) of cis- and trans- diastereoisomers and majority formation of trans-diHTBZ metabolite. The results presented in this study showed that only DLLME was effective in extracting the TBZ from microsomal and liquid culture medium. For analytes with very basic features such as the OXC, the other evaluated microextraction techniques were not effective under the conditions employed in this study due mainly to the difficulty of keeping these analytes in the molecular form.

Neste trabalho, a microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca (HF-LPME), a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) e a microextração em fase sólida na configuração de um filme delgado (SPME/TFME) foram empregadas como técnicas de microextração para a preparação de amostras microssomais no estudo de metabolismo in vitro de fármacos quirais com diferentes características ácido-base. Para análise empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detector por absorção no UV e a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS-MS). O fármaco neutro isradipina (ISR) foi o primeiro a ser abordado. Um método estereosseletivo empregando HFLPME- HPLC foi desenvolvido para a determinação dos enantiômeros da ISR e seu principal metabólito (um derivado piridínico da isradipina - PDI) em fração microssomal isolada de fígado de ratos. Os analitos foram extraídos de 1 mL de meio microssomal utilizando o procedimento HF-LPME na configuração duas fases, tendo o solvente acetato de hexila como fase aceptora. Pela primeira vez, o PDI e os enantiômeros da ISR foram resolvidos numa mesma corrida cromatográfica. Para esta separação foi utilizada uma coluna Chiralpak AD® e hexano:2-propanol:etanol (94/04/02, v/v/v) como fase móvel, na vazão de 1,5 mL min-1. A ISR e o PDI foram detectados em 325 nm e o padrão interno, oxibutinina, foi detectado em 225 nm. A validação do método mostrou valores de recuperação de 23% para o PDI e 19% para cada enantiômero da ISR, 50 ng mL-1 como limite de quantificação (LOQ) para todos os analitos e linearidade entre 50-5000 ng mL-1 e 50-2500 ng mL-1 para o PDI e cada enantiômero da ISR, respectivamente. O método desenvolvido e validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro, utilizando microssomas hepáticos de ratos, mostrando que o (+)-(S)-ISR foi preferencialmente metabolizado. Do mesmo modo que para a ISR, um método analítico empregando HF-LPME-HPLC no modo três-fases foi desenvolvido para a análise estereosseletiva concomitante do bufuralol (BF) e dos seus principais metabólitos 1\'- oxobufuralol (1\'-Oxo-BF) e 1\'-hidroxibufuralol (1\'-OH-BF) em preparações microssomais. As análises por HPLC foram conduzidas empregando uma coluna Chiralcel OD-H® com fase móvel composta por hexano:2-propanol:metanol:dietilamina (97,5/2,0/0,5/0,5, v/v/v/v), na vazão de 1,5 mL min-1 e detecção em 248 nm e 273 nm. As condições otimizadas da HFLPME foram: n-octanol como solvente orgânico, ácido acético 0,2 mol L-1 como fase aceptora, fase doadora com pH ajustado em 13 e agitação de 1500 rpm por 30 min. O método foi validado e apresentou valores de recuperação entre 63 - 69% para os analitos e mostrou-se linear entre 100 - 5000 ng mL-1 para cada enantiômero do 1\'-Oxo-BF e 100 - 2500 ng mL-1 para cada estereoisômero do 1\'-OH-BF (r > 0,99), com LOQ de 100 ng mL-1 para todos os analitos. O método desenvolvido e validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro do BF utilizando microssomas hepáticos de ratos, que mostrou formação predominante do (S)-1\'-Oxo-BF e do (R,R)-1\'-OH-BF. Um segundo fármaco básico abordado neste trabalho foi a ranolazina (RNZ). Para a análise enantiosseletiva da RNZ e de um de seus metabólitos (desmetil ranolazina - DRNZ) em fração microssomal isolada de fígado de ratos, foi desenvolvido um método estereosseletivo empregando a DLLME-LC-MS-MS. Os analitos foram extraídos de 0,5 mL de meio microssomal utilizando o procedimento DLLME, tendo o clorofórmio como solvente extrator e acetona como solvente dispersante. Pela primeira vez os enantiômeros da RNZ e DRNZ foram resolvidos numa mesma corrida cromatográfica. ii Para esta separação foi utilizada uma coluna Chiralcel OD-H® e hexano:etanol (60/40, v/v) e 0,05% de dietilamina como fase móvel, na vazão de 1,0 mL min-1. A validação do método mostrou valores de recuperação em torno dos 55 e 45% para os enantiômeros da RNZ e DRNZ, respectivamente. Os LOQ foram de 25 ng mL-1 para cada enantiômero da RNZ e 10 ng mL-1 para cada enantiômero da DRNZ. A linearidade foi estabelecida entre 10-1000 ng mL-1 e 25-2500 ng mL-1 para cada enantiômero da DRNZ e RNZ, respectivamente. O método desenvolvido e validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro utilizando microssomas hepáticos de ratos, mostrando que a metabolismo da RNZ foi enantiosseletivo. Finalmente, um método analítico empregando a SPME/TFME-LC-MS-MS foi desenvolvido para a análise simultânea do fármaco anfótero repaglinida (RPG) e dois dos seus principais metabólitos, a 2-despiperiril-2-amino-repaglinida (DA-RPG) e a 2-despiperidil-2-(5- carboxipentilamina)-repaglinida (DC-RPG) em fração microssomal isolada de fígado humano. A SPME/TFME foi conduzida com o auxílio do equipamento Multi Sampler SPME nas seguintes condições: pré-condicionamento dos blades com 1 mL de uma solução metanol:água (50/50, v/v) por 30 min, 60 min de extração e 90 min de dessorção com 1 mL de fase móvel. A análise por LC-MS-MS foi feita empregando uma coluna cromatográfica C18 em modo reverso, com fase móvel composta por acetonitrila:água (50/50, v/v) e 0,1% de ácido acético, na vazão de 0,5 mL min-1. A validação do método mostrou valores de recuperação acima dos 80% para todos os analitos. O LOQ foi de 2 ng mL-1 para todos os analitos, sendo o método linear no intervalo 2-1000 ng mL-1 para a RPG e 2-500 ng mL-1 para a DA-RPG e DC-RPG. Os analitos foram estáveis durante todo o protocolo analítico e de metabolismo. O método validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro utilizando microssomas hepáticos de humanos, mostrando que o perfil metabólico da RPG e a taxa de formação da DA-RPG e DC-RPG é alterada em função da concentração de proteínas microssomais no meio de incubação e também em função do tempo de incubação. Além disso, os resultados mostrama possibilidade de haver diversos outros metabólitos que não foram monitorados. / In the present work, the microextraction techniques hollow-fiber liquid phase microextraction (HF-LPME), dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and solid phase microextraction based on thin film (SPME/TFME) were used as sample preparation techniques to study the in vitro metabolism of chiral drugs with distinct acid-base characteristics. High-performance liquid chromatography (HPLC) with UV detection and liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS-MS) were used for the analyses. An enantioselective liquid chromatographic method using two-phase hollow- fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME-HPLC) was developed for the determination of isradipine (ISR) enantiomers and its main metabolite (pyridine derivative of isradipine - PDI) in microsomal fraction isolated from rat liver. The analytes were extracted from 1 mL of microsomal medium using a two-phase HF-LPME procedure with hexyl acetate as the acceptor phase, 30 min of extraction and sample agitation at 1500 rpm. For the first time, ISR enantiomers and PDI were resolved. For this separation, a Chiralpak AD® column with hexane:2-propanol:ethanol (94/04/02, v/v/v) as mobile phase at a flow rate of 1.5 mL min-1 were used. The column was kept at 23 °C ± 2. The drug and metabolite detection was performed at 325 nm and the internal standard oxybutynin was detected at 225 nm. The recovery rates were 23% for PDI and 19% for each ISR enantiomer. The method presented quantification limits (LOQ) of 50 ng mL-1 and it was linear over the concentration range of 50-5000 ng mL-1 and 50-2500 ng mL-1 for PDI and each ISR enantiomer, respectively. The validated method was employed to an in vitro metabolism study of ISR using rat liver microsomal fraction, showing that (+)-(S)-ISR is preferentially metabolized. In the same way, a three-phase HF-LPME-HPLC method for the stereoselective determination of bufuralol metabolites, 1\'-oxobufuralol (1\'-Oxo-BF) and 1\'-hydroxybufuralol (1\'-OH-BF), in microsomal preparations is described for the first time. The HPLC analysis was carried out using a Chiralcel OD-H® column with hexane:2-propanol:methanol (97.5/2.0/0.5, v/v/v) plus 0.5% diethylamine as the mobile phase, and UV detection at 248 and 273 nm. The HF-LPME optimized conditions involved: n-octanol as the organic solvent, 0.2 mol L-1 acetic acid as the acceptor phase, donor phase pH adjusted to 13, sample agitation at 1500 rpm and extraction for 30 min. By using this extraction procedure, the recovery rates were in the range of 63- 69%. The method was linear over the concentration range of 100-5000 ng mL-1 for each enantiomer of 1\'-Oxo-BF and of 100-2500 ng mL-1 for each stereoisomer of 1\'-OH-BF. The quantification limits were 100 ng mL-1 for all analytes. The validated method was used to assess the in vitro metabolism of bufuralol using rat liver microsomal fraction that demonstrated predominant formation of (S)-1\'-Oxo-BF and (R,R)-1\'-OH-BF. A second basic drug addressed in this thesis is ranolazine (RNZ). For the chiral analysis of RNZ and one of its metabolites (desmethyl ranolazine - DRNZ) in microsomal fraction isolated from rat liver, an analytical enantioselective method using DLLME-LC-MS-MS was developed. The analytes were extracted from 0.5 mL of microsomal medium by DLLME. Chloroform was the extractor solvent and acetone the dispersive solvent. The enantiomers of RNZ and DRNZ were analyzed simultaneously for the first time using a Chiralcel OD-H® column and hexane:ethanol (60/40, v/v) plus 0.05% diethylamine as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL min-1. Method validation showed recoveries in the order of 55 and 45% for the enantiomers iv of RNZ and DRNZ, respectively. The LOQs were 25 ng mL-1 for each RNZ enantiomers and 10 ng mL-1 for each DRNZ enantiomers. Linearity was established between 10-1000 ng mL-1 and 25-2500 ng mL-1 for each DRNZ and RNZ enantiomers, respectively. The validated method was employed to an in vitro metabolism study of RNZ using rat liver microsomal fraction, showing that the metabolism of RNZ is enantioselective. Finally, an analytical method was developed employing SPME/TFME-LC-MS-MS for the simultaneous analyses of the anphoteric drug repaglinide (RPG) and two of the its main metabolites 2-despiperidyl- 2-amino repaglinide (DA-RPG) and 2-despiperidyl-2-(5-carboxypentylamine) repaglinide (DC-RPG) in human microsomal fraction. The SPME/TFME procedure was carried out with the support of \"Multi Sampler SPME\" under the following conditions: conditioning of the blades with 1 mL of methanol:water (50/50, v/v) for 30 min, 60 min for extraction and 90 min for desorption with 1 mL of mobile phase. The LC-MS-MS analyses were performed using a C18 column under reversed phase conditions, with the mobile phase of acetonitrile:water (50/50, v/v) plus 0.1% acetic acid at a flow rate of 0.5 mL min-1. The method validation showed recoveries over 80% for all analytes. The LOQ was 2 ng mL-1 for all analytes, and the method was linear over the concentration range of 2 e 1000 ng mL-1 for RPG and of 2 a 500 ng mL-1 for DA-RPG and DC-RPG. The validated method was used to assess the in vitro metabolism profile of RPG by using human liver microsomes. These studies showed that the rate of formation of DA-RPG and DC-RPG depends on both microsomal protein concentration in the incubation medium and the incubation time. Furthermore, the results highlighted the possibility of formation of several other metabolites which have not been monitored.

A new solid phase microextraction system composed of nanotubes coating fixed on a stainless steel support is suggested. Thermal stability and selectivity of the system was examined. It was determined that the system can be used for direct and headspace extraction of volatile aromatic hydrocarbons. Possibilities of four liquid phase microextraction techniques – hollow fibre liquid phase microextraction, liquid phase microextraction based on the solidification of a floating drop, dispersive liquid-liquid microextraction and dispersion-solidification liquid-liquid microextraction – for the extraction of volatile aromatic hydrocarbons were investigated. Extraction conditions of the investigated methods were optimized and the main analytical characteristics were determined. For all the methods detection limits and repeatability of the results are close. An exception is dispersive liquid-liquid microextraction with slightly higher detection limits. An extraction is especially fast using dispersive liquid-liquid microextraction and dispersion-solidification liquid-liquid microextraction. The most time-consuming method is liquid phase microextraction based on the solidification of a floating drop. All the methods are suitable for clean sample extraction. For the extraction from complex matrices the most suitable methods are headspace solid phase microextraction and hollow fibre liquid phase microextraction. The prepared microextraction techniques were applied for water and snow... [to full text] / Pasiūlyta nauja kietafazės mikroekstrakcijos sistema, kurioje nerūdijančio plieno strypelis dengtas anglies nanovamzdeliais, ištirtas jos terminis stabilumas ir atrankumas, nustatyta, kad sistema tinka lakių aromatinių angliavandenilių ekstrakcijai iš tirpalo ir iš viršerdvės. Ištirtos keturių skysčių-skysčių mikroekstrakcijos metodų - skysčių-skysčių mikroekstrakcijos kapiliare, mikroekstrakcijos užšaldomu tirpiklio lašu, dispersinės skysčių-skysčių mikroekstrakcijos ir dispersinės skysčių-skysčių mikroekstrakcijos užšaldant ekstraktą - galimybės ekstrahuoti lakius aromatinius angliavandenilius. Optimizuotos tirtų metodų ekstrakcijos sąlygos, nustatytos pagrindinės analizinės charakteristikos. Visų metodų rezultatų pasikartojamumas ir aptikimo ribos artimi. Išimtis – dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija, kuria gautos kiek didesnės aptikimo ribos. Greičiausi ekstrakcijos metodai - dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija ir dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija užšaldant ekstraktą, ilgiausiai trunka mikroekstrakcija užšaldomu tirpiklio lašu. Švarių mėginių ekstrakcijai tinka visi tirti metodai, užterštiems mėginiams geriau tinka kietafazė mikroekstrakcija iš viršerdvės arba skysčių-skysčių mikroekstrakcija kapiliare. Paruoštos lakių aromatinių angliavandenilių mikroekstrakcijos metodikos pritaikytos vandens ir sniego mėginių analizei.

Pasiūlyta nauja kietafazės mikroekstrakcijos sistema, kurioje nerūdijančio plieno strypelis dengtas anglies nanovamzdeliais, ištirtas jos terminis stabilumas ir atrankumas, nustatyta, kad sistema tinka lakių aromatinių angliavandenilių ekstrakcijai iš tirpalo ir iš viršerdvės. Ištirtos keturių skysčių-skysčių mikroekstrakcijos metodų - skysčių-skysčių mikroekstrakcijos kapiliare, mikroekstrakcijos užšaldomu tirpiklio lašu, dispersinės skysčių-skysčių mikroekstrakcijos ir dispersinės skysčių-skysčių mikroekstrakcijos užšaldant ekstraktą - galimybės ekstrahuoti lakius aromatinius angliavandenilius. Optimizuotos tirtų metodų ekstrakcijos sąlygos, nustatytos pagrindinės analizinės charakteristikos. Visų metodų rezultatų pasikartojamumas ir aptikimo ribos artimi. Išimtis – dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija, kuria gautos kiek didesnės aptikimo ribos. Greičiausi ekstrakcijos metodai - dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija ir dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija užšaldant ekstraktą, ilgiausiai trunka mikroekstrakcija užšaldomu tirpiklio lašu. Švarių mėginių ekstrakcijai tinka visi tirti metodai, užterštiems mėginiams geriau tinka kietafazė mikroekstrakcija iš viršerdvės arba skysčių-skysčių mikroekstrakcija kapiliare. Paruoštos lakių aromatinių angliavandenilių mikroekstrakcijos metodikos pritaikytos vandens ir sniego mėginių analizei. / A new solid phase microextraction system composed of nanotubes coating fixed on a stainless steel support is suggested. Thermal stability and selectivity of the system was examined. It was determined that the system can be used for direct and headspace extraction of volatile aromatic hydrocarbons. Possibilities of four liquid phase microextraction techniques – hollow fibre liquid phase microextraction, liquid phase microextraction based on the solidification of a floating drop, dispersive liquid-liquid microextraction and dispersion-solidification liquid-liquid microextraction – for the extraction of volatile aromatic hydrocarbons were investigated. Extraction conditions of the investigated methods were optimized and the main analytical characteristics were determined. For all the methods detection limits and repeatability of the results are close. An exception is dispersive liquid-liquid microextraction with slightly higher detection limits. An extraction is especially fast using dispersive liquid-liquid microextraction and dispersion-solidification liquid-liquid microextraction. The most time-consuming method is liquid phase microextraction based on the solidification of a floating drop. All the methods are suitable for clean sample extraction. For the extraction from complex matrices the most suitable methods are headspace solid phase microextraction and hollow fibre liquid phase microextraction. The prepared microextraction techniques were applied for water and snow... [to full text]