L’imagerie par spectrométrie de masse est une technique sans marquage permettant la détection et la localisation de protéines à partir de coupes de tissus. Afin de répondre à des problématiques biologiques, le nombre de protéines identifiées doit être amélioré. Une stratégie consiste à réaliser une micro-jonction liquide sur des régions particulières des coupes de tissus afin d’extraire les peptides issus de la digestion in situ des protéines. Plus de 1500 protéines ont identifié sur une zone de 650µm, correspondant à environ 1900 cellules. Une corrélation entre ces données avec celles générées par MSI a augmenté le nombre de protéines localisées. Afin d’obtenir dans le même temps, la localisation et l’identification de protéines, une méthode consiste à réaliser la microdissection de l’ensemble de la coupe après l’avoir déposée sur une lame recouverte de parafilm. PAM a également été appliquée à l’étude de l'expression différentielle de protéines dans des tumeurs de prostate. Les résultats ont permis d’identifier des biomarqueurs potentiels tels que des protéines complexées avec des petits ARN nucléolaires. Enfin, la faisabilité des méthodes MS appliquées à l’étude structurale de protéines, tel que l'échange deutérium ou le pontage chimique, ont été examinés directement sur tissu. Les résultats préliminaires suggèrent qu’une étude structurale de protéines est possible afin de déterminer des changements de structures entrainés par la modification du microenvironnement. Réunis ensemble, ces méthodes MS d'analyses directes fournissent un moyen robuste d’étude de protéines dans leur état natif afin de fournir des indications sur leur rôle dans des systèmes biologiques. / Mass spectrometry-based methods for direct tissue analysis, such as MS imaging, are label-free techniques that permit the detection and localization of proteins on tissue sections. There is a need to improve the number of protein identifications in these techniques for them to comprehensively address biological questions. One strategy to obtain high protein IDs is to realize liquid microjunction on localized regions of tissue sections to extract peptides from the in situ digestion of proteins. More than 1500 proteins were identified in a 650µm spot, corresponding to about 1900 cells. Matching these IDs with those from MSI increased the number of localized proteins. In order to achieve simultaneous identification and localization of proteins, a method consisting of microdissecting entire tissue sections mounted on parafilm-covered slides was developed. Spectral counting was then used to quantify identified proteins, and the values were used to generate images. PAM was also used to examine the differential expression of proteins on prostate tumors. Results identified potential biomarkers such as proteins in complex with small nucleolar ribosomal RNAs. Lastly, the feasibility of applying MS methods of structural analysis, such as deuterium exchange and crosslinking, directly on tissue was examined. Preliminary results suggest the possibility of this approach, which could be significative by permiting the determination of protein structural changes for a given microenvironment. Taken together, these direct MS analysis methods provide a robust means of analyzing proteins in their native state and are expected to provide insights to their role in biological systems.