Reproduction de : Thèse de doctorat : Chimie et physico-chimie des polymères : Le Mans : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Identifier rapidement le contenu microbien d’un échantillon biologique complexe constitue un enjeu majeur en biodéfense et dans les domaines concernant la santé humaine, les biotechnologies et l’environnement. La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) permet de sonder le contenu protéique d’un échantillon avec précision. Ce travail de thèse porte sur le développement d’un nouveau concept d’interprétation des données de spectrométrie de masse MS/MS à des fins d’identification sans a priori du contenu microbien d’un échantillon à l’aide de bases de données protéiques généralistes. L’approche d’identification se base (i) sur la base de données actuelle la plus exhaustive, et (ii) sur un algorithme d’interprétation de spectres MS/MS. Une architecture informatique a été développée afin de regrouper les résultats MS/MS selon la taxonomie des organismes vivants tout en veillant à minimiser le temps de traitement nécessaire et à maximiser le taux d’attribution de spectres MS/MS. Une stratégie d’identification récursive à travers l’arbre taxonomique basée sur le nombre de spectres spécifiques associés à chaque taxon est possible, mais ne permet pas d’identifier avec confiance le contenu d’un échantillon multi-organismes séquencés. Le concept innovant développé a permis d’établir une corrélation entre le nombre de spectres attribués à un taxon et la distance phylogénétique de ce taxon au taxon de l’organisme présent dans le cas d’un échantillon mono-organisme séquencé. Cette corrélation permet de modéliser et de déterminer la présence de tout organisme séquencé dans un échantillon multi-organismes. Un outil automatique d’estimation de distances phylogénétiques entre taxons a donc été mis au point, basé sur l’ajout de nouveaux organismes à un alignement multiple de séquences de référence composé de 31 familles de protéines universelles pour des organismes des 3 domaines du vivants (bactéries, archées, eucaryotes). Enfin, deux algorithmes d’identification du contenu d’un échantillon multi-organismes séquencés ont été évalués : un algorithme glouton naïf basé sur une heuristique et un algorithme résolvant un problème d’optimisation non-convexe de manière itérative utilisant un terme de régularisation pondéré de norme ℓ1. / The rapid identification of the microbial content of a complex biological sample is a major issue in biodefense and in areas related to human health, biotechnology and the environment. Tandem mass spectrometry (MS/MS) enables accurate profiling of the protein content of a sample. This thesis focuses on the development of a new concept in MS/MS data interpretation to identify the microbial content of a sample using general protein databases without prior knowledge of the target. The identification approach is based on (i) the most extensive protein database currently available and (ii) an MS/MS spectra interpretation algorithm. A dedicated computer architecture has been developed to combine the MS/MS results according to the taxonomy of living organisms while minimizing the required processing time and maximizing the MS/MS spectra assignment rate. A recursive identification strategy across the taxonomic tree based on the number of specific spectra associated with each taxon is possible but does not confidently identify the contents of a sample containing multiple sequenced organisms. The innovative concept developed here enables the correlation of the number of spectra assigned to a given taxon and the phylogenetic distances between this taxon and the taxon of the organism present in the case of a sample containing a single sequenced organism. This correlation allows us to model and determine the presence of any sequenced organism in a sample containing multiple organisms. An automatic tool for estimating phylogenetic distances between taxa has been developed. This tool is based on the addition of new organisms to a multiple sequence alignment comprising 31 families of universal proteins from organisms from all 3 domains of life (Bacteria, Archaea, Eukarya). Finally, two algorithms for identifying multiple organisms from a single sample have been assessed : a naive greedy algorithm based on a heuristic and an iterative algorithm that solves a non-convex optimization problem using a weighted ℓ1 norm regularization term.

Thèse de doctorat : Biochimie. Biologie cellulaire et moléculaire : Paris 12 : 2004. / Titre provenant de la version imprimée. Bibliogr. f. 108-131.

Th.--Pharm.--Paris 5, 1984. N°: 98.

Th. 3e cycle--Biochim., microbiol. Lille 1, 1979. N°: 778.

La distribution de la neige à l'échelle du paysage dans les zones alpines est une des variables les plus importantes contrôlant la structure et la fonction des écosystèmes de montagne. Des changements d'épaisseur neigeuse et de durée d'enneigement peuvent entraîner de grands changements dans les conditions édapho-climatiques, ainsi que dans la composition des communautés végétales et surtout sur les cycles biogéochimiques majeurs et par conséquence la structure et le fonctionnement de l'écosystème. Nous avons utilisé l'approche métatranscriptomique pour essayer de comprendre la diversité fonctionnelle réelle et les activités exprimées dans les sols alpins par les micro-organismes, en réponse à différentes contraintes environnementales. La transcriptomique, et par extension, la métatranscriptomique, peut être vue comme l'analyse quantitative complète de tous les gènes exprimés par un ou plusieurs organismes, ou par l'écosystème entier. L'utilisation de cette approche implique d'abord l'extraction des ARN une bonne qualité et avec un bon rendement, ensuite la conversion de ces ARN en cDNA en ciblant les fractions de ARNm. La capacité d'évaluer le metatranscriptome des communautés microbiennes complexes dans différentes conditions environnementales représente en soi une avancée significative dans notre capacité de relier la structure et les fonctions des communautés avec les génotypes d'ADN (les séquences) et avec la correspondance phénotype. Dans cette étude, nous présentons l'utilisation pour la première fois de l'approche métatranscriptomique concernant les activités des communautés microbiennes des eucaryotes des sols alpins sous deux conditions d'enneigement très contrasté nommés LSM (lately snowmelt) et ESM (early snowmelt), qui sont caractérisés par des gradients climatiques contrastés et des différences de végétations associées. Nous présentons également une analyse des séquences et des procédures d'annotation en utilisant des logiciels publiquement disponibles et des scripts de python en utilisant l'environnent d'Obitools. Nous avons également développé un pipeline d'analyse bio-informatique adapté qui permet d'extraire correctement des renseignements fonctionnels et taxinomiques de ces bases de données. / The distribution of snow across the landscape in the Alps is one of the most important variables controlling the structure and function of mountain ecosystems. Changes in snow depth and duration can cause major changes in soil and climatic conditions, as well as the composition of plant communities and especially on the major biogeochemical cycles and consequently the structure and functioning of the ecosystem. We used the approach métatranscriptomique to try to understand the functional diversity and real activity expressed in Alpine soils by micro-organisms in response to different environmental constraints. Transcriptomics, and by extension, the métatranscriptomique, can be seen as full quantitative analysis of all genes expressed by one or more agencies or by the entire ecosystem. Using this approach involves first extracting RNA in good quality and good yield, then the conversion of RNA into cDNA by targeting mRNA fractions. The ability to assess metatranscriptome complex microbial communities under different environmental conditions is in itself a significant advance in our ability to link the structure and functions of communities with the genotypes of DNA (the sequence) and phenotype correspondence. In this study, we present the first use of the approach métatranscriptomique on the activities of eukaryotic microbial communities of alpine soil in two very contrasting locations called LSM (Lately snowmelt) and ESM (early snowmelt) which are characterized by contrasting climatic gradients and differences in vegetation associated. We present an analysis of sequences and annotation procedures using publicly available software and scripts using python programs and Obitools. We have also developed a pipeline of bioinformatics analysis adapted to correct extraction of information of the functional and taxonomic databases.

La microflore joue un rôle majeur dans la mobilité des éléments métalliques et métalloïdes dans les sols. L’activité bactérienne globale d’oxydation de l’AsIII en AsV tend à diminuer la toxicité et la mobilité de l’arsenic (As) dans les sols, cependant l’effet de la matière organique (MO) sur cette activité n’a pas été déterminé jusqu’à présent. Il est important de répondre à cette question car sur des sites pollués, un apport de MO peut être préconisé dans le cadre d’opérations de phyto-stabilisation. Par ailleurs, dans un contexte de pollution diffuse, les pratiques agricoles d’amendement des sols pourraient avoir un impact sur le transfert d’As. L’objectif de ce projet de thèse était donc de quantifier l’influence de la MO sur la spéciation de l’As par la microflore de sols pollués, et les conséquences de ce processus sur la mobilité du métalloïde. L’influence de la MO sur la spéciation de l’As a été évaluée (1) au niveau physiologique et moléculaire, sur l’activité de deux souches pures et (2) au niveau global, par l’évaluation de l’activité d’oxydation de l’AsIII par les communautés microbiennes de sols pollués et des incubations de sols. L’effet de la nature même de la MO a été examiné à travers la comparaison de substrats simples et complexes. Les expériences réalisées avec les souches de Thiomonas delicata et Herminiimonas arsenicoxydans ont montré un effet négatif de la MO sur la vitesse spécifique d’oxydation de l’AsIII. L’extrait de levure (EdL) induit une diminution de l’expression du gène aioA codant pour la grande sous-unité de l’arsénite-oxydase permettant l’oxydation de l’arsenic, avec les deux souches pures. Au niveau plus global des communautés microbiennes de sols, l’activité AsIII-oxydantes a été évaluée sur 8 sols pollués par de l’As. Les mesures ont été effectuées dans des milieux de cultures contenant différentes concentrations de MO. Deux MO complexes ont été comparées : l’EdL et une mixture synthétique de molécules organiques (SMOM) dont la composition a été inspirée par les caractéristiques de la MO de sols réels (rapport C/N, contenu en groupes fonctionnels). Des corrélations ont été recherchées entre les caractéristiques des sols et la constante de vitesse d’oxydation de l’AsIII par la microflore, avec et sans ajout de MO. La vitesse d’oxydation de l’AsIII par la microflore des sols semble limitée par la MO disponible, et cette limitation est levée par un apport de 0,08 g.L-1 de C apporté sous forme d’EdL ou de SMOM. Lorsque l’apport de MO s’élève à 0,4 g.L-1 de C, des résultats divergents sont observés : l’EdL est moins inhibiteur que la SMOM. Enfin, une expérience a été réalisée dans le but d’évaluer l’influence combinée de l’activité microbienne et de l’apport de SMOM sur la mobilisation de l’As présent dans quatre sols pollués, incubés au laboratoire en suspension. Une mobilisation dans la phase aqueuse de l’As présent dans les sols pollués est observée en présence de SMOM et de microorganismes actifs. Ce travail de thèse apporte un éclairage sur le rôle important joué par le métabolisme de la MO au sein du cycle biogéochimique de l’As, phénomène devant être pris en compte lors des études visant à optimiser la remédiation des sites pollués / The soil microflora plays a major role in the mobilization of metals and metalloids in soils. The global bacterial oxidation of AsIII to AsV tends to decrease the toxicity and mobility of arsenic in soils. The effect of organic matter (OM) on bacterial AsIII oxidation in presence of oxygen and its potential impact on the behavior of arsenic in non-saturated soils has not been determined up to date. However, supply of OM on polluted sites can be proposed in the context of a phytostabilization operation. Furthermore, agricultural soils affected by diffuse As pollution may be fertilized by organic amendments that could impact arsenic transfer. The objective of the present PhD thesis was to quantify the influence of OM on the speciation of As by the polluted soil microflora and the consequences of this process on arsenic mobility. The influence of OM on the speciation of As was evaluated (1) at the physiological and molecular levels on two pure strains and (2) at global level by AsIII oxidation measurements by microbial communities from polluted soils and on soils incubations. The effect of the nature of OM was considered through the comparison of simple and complex substrates. The experiments with Thiomonas delicata and Herminiimonas arsenicoxydans showed a negative effect of OM on the specific AsIII oxidation rate. Yeast extract (YE) induced a decrease of aioA gene (encoding for the big subunit of arsenite oxidase responsible for AsIII oxidation) expression with both pure strains. At the level of soils microbial communities, AsIII oxidizing activity were measured on 8 As-polluted soils. Measurements were realized in culture media containing different concentrations of OM. Two complex OMs were compared: YE and a synthetic mixture of organic matters (SMOM) whose composition was inspired from soils OM characteristics (C/N ratio and proportion of functional groups). Correlations were searched between soils characteristics and AsIII bio-oxidation rate constants with and without added OM. Results indicate that AsIII oxidation rate by the soil microflora was limited by available OM and this limitation was removed by the addition of 0.08 g L-1 of organic C as YE or SMOM. When the addition of OM reached 0.4 g L-1 of C, divergent results were observed: YE was less inhibiting than SMOM. Finally, an experiment was carried out to evaluate the combined influence of microbial activity and SMOM addition on As mobilization from polluted soils incubated as slurries at laboratory scale. A mobilization of As present in the polluted soils was observed in presence of both SMOM and active microorganisms. This PhD thesis enlightens the important role played by OM metabolism within the biogeochemical cycle of As, which should be given consideration in the context of polluted site remediation

Les biotechnologies basées sur des microorganismes capables de survivre à de fortes doses de rayonnement ionisants et de concentrer les radionucléides constituent une technique attractive pour décontaminer les effluents nucléaires, en particulier du fait du faible volume de déchets générés. En utilisant deux méthodes d’analyses directes et complémentaires que sont la métagénétique et la métaprotéomique, l’inventaire complet de la piscine de refroidissement d’un coeur de réacteur nucléaire (en fonctionnement et à l’arrêt) et d’une piscine de stockage de sources radioactives de cobalt a été réalisé. Les microbiotes sont extrêmement différents entre les deux piscines. Une majorité de Cyanobacteria a été identifiée dans la piscine du réacteur alors qu’une majorité de Proteobacteria l’a été dans la piscine des sources. Durant le fonctionnement du réacteur, une majorité de Variovorax a été identifiée. Certaines espèces de Variovorax sont capables d’utiliser du H2 comme source d’énergie, ce qui peut leur donner un avantage dans un environnement nucléaire aquatique. Parmi les microorganismes isolés de la piscine du réacteur, 46 bactéries ont été identifiées. Leur capacité à résister aux rayonnements gamma et à accumuler l’uranium et le cobalt ont été déterminées. Parmi ces bactéries, six souches ont été capables d’accumuler la totalité de l’uranium d’une solution à 5 μM, et deux d’entre elles ont entièrement accumulé l’uranium d’une solution à 50 μM. Ce travail présente le premier inventaire complet d’une piscine de refroidissement d’un coeur de réacteur nucléaire en fonctionnement. Cette thèse présente des perspectives tant sur le plan industriel avec l’utilisation des microorganismes isolés dans un procédé de biodécontamination d’effluents nucléaires que sur le plan fondamental avec l’élucidation des mécanismes développés par ces microorganismes pour résister aux rayonnements et accumuler les radionucléides. / Biotechnology with microorganisms able to survive high radiation doses and concentrate radionuclides is an attractive technology to decontaminate nuclear effluents with low waste volume. By using two direct and complementary analysis methods, metagenetics and metaproteomics, the complete inventories of microorganisms present in a French nuclear reactor cooling pool (during operation and at shutdown) and in a radioactive 60Co sources storage pool have been performed. The microbiota from the two pools were extremely different, with a majority of Cyanobacteria in the sources storage pool, and Proteobacteria in the reactor pool. Depending on the pools’ conditions a change in the microbiota had been observed. Variovorax was the main genus identified during the reactor’s operation. Some strains of Variovorax are able to use H2 as an energy source, conferring them an advantage in nuclear pools. Several microorganisms have been isolated from the reactor pool. Among them 46 bacteria were identified. Their abilities to resist ionizing radiations and to accumulate specific radionuclides were determined. Several genera studied in this work had never been described concerning their ability to resist radiations or accumulate radionuclides. Six strains could entirely remove uranium from a 5 μM solution and up to 50 μM for two strains. This work presents the first complete inventory of a working nuclear reactor cooling pool. This PhD work opens interesting industrial perspectives as the isolated strains could be implemented in a new nuclear effluents decontamination process and fundamental perspectives as their resistance and radionuclides accumulation pathways could be deciphered.

Le mercure est un polluant global posant des problèmes de santé publique. Il est émis par des sources naturelles et anthropiques. Aux pôles, une chimie particulière amène à une oxydation du mercure de l'atmosphère qui provoque des dépôts de mercure divalent sur la neige.Ce travail de thèse propose d'étudier la composante microbiologique dans le cycle du mercure en zone polaire afin de comprendre si elle joue un rôle dans l'entrée du mercure dans les écosystèmes polaires. Pour réaliser cette étude nous avons travaillé sur différents types d'échantillons : micro organismes isolés de la neige comme des levures et des bactéries, plancton collecté en arctique, biofilms échantillonnés en arctique et en antarctique.Les résultats obtenus indiquent que les différents types de microorganismes semblent capable de réagir avec le mercure déposé.Ce type d'approche à l'interface entre la chimie et de la biologie était une première au laboratoire de glaciologie, les résultats obtenus ouvrent des perspectives intéressantes pour la compréhension du cycle du mercure en zone polaire.

Le contrôle de la qualité microbiologique de l’eau constitue une problématique majeure en termes sanitaire et économique. L’efficacité des traitements appliqués est actuellement vérifiée par des méthodes standards basées sur la mise en culture des microorganismes. Cependant, leur mise en œuvre ne permet d’obtenir des résultats ne présentant qu’une vision partielle de la population microbienne présente dans un échantillon et ce dans un délai qui n’est pas compatible avec le niveau de réactivité requis dans le domaine de la gestion de l’eau.Les présents travaux visaient à démontrer que l’application de la cytométrie en flux pour le suivi microbiologique au sein de filières de production d’eau potable et de circuits de tours aéroréfrigérantes représente une approche alternative aux méthodes réglementaires et classiques utilisées dans ce domaine. Une attention particulière a été portée sur le fait d’être en mesure de quantifier les cellules totales et viables et d’être capable d’identifier l’impact de différents traitements chimiques et/ou physiques (ozone, UV, biocides oxydants) au niveau de la cellule microbienne. La démarche de calibration et l’utilisation conjointe de différents marqueurs fluorescents incluant le SYBR Green II, l’iodure de propidium et le Chemchrome V6 a permis d’atteindre ce double objectif. Par ailleurs, 3 systèmes de cytométrie en flux différents ont été utilisés selon les études, comprenant le FACSCaliburTM, le FACSCantoTM et l’ACCURITM C6.Au regard des résultats obtenus, il apparait que la cytométrie en flux représenterait un atout dans le domaine du diagnostic rapide d’installations de par sa simplicité, son délai de résultat court (1 heure) et le niveau d’information apporté sur la population microbienne (impact sur la membrane, le matériel génétique ou le métabolisme). / The water microbiological quality control is a major issue in health and economic terms. The effectiveness of treatments applied is currently tested using culture-based standard methods. However, their application leads to a partial view of the microbial population present in a sample and within a period that is not compatible with the required responsiveness concerning water management.The present work aims to demonstrate that the application of flow cytometry for microbiological monitoring of drinking water treatment plants and cooling tower circuits represents an alternative approach to regulatory and conventional methods used in this field. Particular attention was paid to being able to quantify total and viable cells and be able to identify the impact of different chemical and/or physical treatment (ozone, UV, oxidizing biocides) on a microbial cell. The calibration process and the joint use of various fluorescent dyes including SYBR Green II, propidium iodide and ChemChrome V6 have achieved this double objective. Furthermore, three different flow cytometric systems have been used according to the studies comprising the FACSCaliburTM, FACSCantoTM and ACCURITM C6.Given the results, flow cytometry appears as an asset in the field of rapid diagnostic for treatment efficiency due to its ease of use, short time to result (1 hour) and the information provided related to the microbial population (impact on membrane, genetic material or metabolism).