Les microparticules sont des vésicules extracellulaires qui résultent du remodelage des phospholipides membranaires en réponse à une activation ou une apoptose. La vision initiale leur attribuant une activité uniquement procoagulante s’avère plus complexe, par la mise en évidence d'une activité plasminogénolytique portée par les MPs endothéliales, tumorales et leucocytaires (MPLs). Au cours de ce travail, nous avons démontré un nouveau mécanisme impliquant les MPLs comme des vecteurs d’une activité fibrinolytique capable de lyser un thrombus fibrino-plaquettaire en fonction de leur activité de génération de plasmine. Cette activité s’intègre dans un rôle protecteur des MPs capable de contrebalancer le risque de microthromboses associé au choc septique. Cette activité fibrinolytique identifie les MPs comme des biomarqueurs déterminants pour le pronostic vital mais aussi comme des cibles thérapeutiques potentielles, pouvant être à l’origine de biothérapies vésiculaires basées sur la génération de MPs fibrinolytiques de grade clinique. L’évaluation du bénéfice apporté par les MPs est actuellement limitée par un manque de standardisation. Dans une seconde partie de ce travail, nous avons proposé une nouvelle stratégie de standardisation de la cytométrie en flux. Cette stratégie a été évaluée dans le cadre d'une étude multicentrique internationale qui a montré pour la première fois l’absence de différence significative des numérations des MPs entre des instruments de configuration optique différente. Maitriser des protocoles standardisés est une étape indispensable pour accélérer le transfert de ces innovations diagnostiques et thérapeutiques au lit du patient. / The microparticles are extracellular vesicles resulting from the remodeling of membrane phospholipids in response to activation or apoptosis. The initial vision only assigning a procoagulant activity is more complex, by highlighting a range plasminogenolytic activity by endothelial, tumor and leukocyte (MPLS) MPs. In this work, we demonstrated a novel mechanism involving MPLS as vectors fibrinolytic activity able to lyse a fibrin-platelet thrombus on the basis of generation of plasmin activity. This activity is part of a protective role of MPs which may counterbalance the risk of microthromboses associated with septic shock. This fibrinolytic activity identifies MPs as key biomarkers for prognosis but also as potential therapeutic targets that can be the source of vesicular biotherapies based on generation of fibrinolytic MPs of clinical grade. The evaluation of the benefit provided by MPs is currently limited by a lack of standardization. In the second part of this work, we proposed a new strategy for standardization of flow cytometry. This strategy was evaluated in a multicenter international study that showed for the first time no significant difference in MPs counts between different optical configuration tools. To master standardized protocols is a necessary step to improve the transfer of these diagnostic and therapeutic innovations to the patient.

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La production de tissus par génie tissulaire est un domaine dont la finalité clinique est en pleine expansion. De nombreux facteurs restent cependant à améliorer afin de permettre leur utilisation extensive. Nos objectifs étaient d’évaluer la capacité d’extraits d’algue et des molécules isolées de sérum à optimiser différentes étapes de la production des tissus par génie tissulaire. Nos hypothèses étaient que l'ajout des extraits d’algue diminue le temps de fabrication des peaux reconstruites en stimulant la production et le dépôt de matrice alors que les protéines isolées du sérum stimulent la production de microparticules (MP) par les cellules du derme, ces MP ayant été démontrées avoir une action sur la croissance des cellules endothéliales et donc sur la vascularisation des greffons. / Skin production by tissue engineering method is a field whose clinical purpose is expanding. However, many factors need to be improved to enable their extensive use. Our objectives were to evaluate the ability of seaweed extracts and serum molecules to optimize different stages of tissue-engineered skin production. Our hypotheses were that adding seaweed extracts reduces the manufacturing time of reconstructed skin by stimulating the production and the deposition of the extracellular matrix while serum- isolated proteins stimulate the production of microparticles (MP) by the dermal cells, the MP stimulating growth of endothelial cells and thus, potentially, vascularization of the grafts.

La drépanocytose est la première maladie génétique en France et notamment en Guadeloupe. Il s’agit d’une maladie du sang qui est due à une mutation ponctuelle au niveau du gène de la β-globine, laquelle entre dans la composition de l’hémoglobine. Ainsi les drépanocytaires ont une hémoglobine anormale appelée « HbS », contrairement à l’hémoglobine normale « HbA ». En condition de faible oxygénation, l’HbS polymérise et forme des fibres à l’intérieur des érythrocytes. Ces fibres rigidifient et fragilisent les globules rouges. Par conséquent ils peuvent bloquer la circulation à cause de leur faible déformabilité, et causer des crises vaso-occlusives douloureuses, complication caractéristique de la drépanocytose. Ce modèle physiopathologique classique a été complété par les résultats plus récents montrant l’importance du rôle des leucocytes dans l’établissement de ces obstructions. Par ailleurs, les globules rouges des drépanocytaires sont plus prompts à l’hémolyse en raison de leur fragilité. En raison de l’hémolyse exacerbée, l’hémoglobine se retrouve dans le plasma et diminue la biodisponibilité du principal vasodilatateur, le monoxyde d’azote. De plus, les globules rouges rigides et déformés entrainent activation de l’endothélium. Il en résulte dans la drépanocytose, un contexte pro-inflammatoire et pro-adhérent mais aussi pro-coagulant.Ce contexte est propice à l’activation des cellules sanguines et notamment à celle des plaquettes et des érythrocytes qui par bourgeonnement de leur membrane, émettent alors en grandes quantités, des vésicules sub-micrométriques appelées microparticules, ou MP. En l’absence de traitement curatif applicable à tous les patients drépanocytaires, nous avons décidé d’étudier le profil mais aussi le rôle des MP de patients drépanocytaires dans le but de mieux comprendre cette maladie et dans l’espoir de peut-être découvrir une nouvelle piste diagnostique ou thérapeutique.Nous avons donc montré que les patients SC ont des concentrations sanguines en MP plus importantes que les sujets AA, mais moindres que les patients SS. Etonnamment les MP SC, qu’elles soient d’origine érythrocytaire ou plaquettaire, ont aussi plus de phosphatidylsérine (PS) à leur surface que les MP SS. Ce phospholipide étant impliqué dans l’activation de la cascade de la coagulation, il serait intéressant d’évaluer l’intensité de cette activation par des MP SS ou SC. On pourrait aussi comparer ces intensités à celle induite par des MP de patients SS sous hydroxyurée. En effet nous avons aussi montré que 2 ans après avoir commencé ce traitement, les MP érythrocytaires des patients ont une taille plus importante et une exposition de la PS diminuée drastiquement.Les MP étant physiologiquement dans le sang, elles peuvent entrer en contact avec les cellules sanguines mais aussi avec l’endothélium vasculaire. Etant donné l’importance des changements que connaît cet endothélium chez les drépanocytaires (pro-adhérent, pro-inflammatoire et pro-coagulant), nous nous sommes ensuite focalisés sur l’impact des MP de drépanocytaires sur les cellules endothéliales. Ces dernières provenaient de la moelle osseuse humaine, territoire fréquemment affecté par les vaso-occlusions. Il ressort de ces travaux que les MP de patients SS et SC induisent, par rapport aux MP de sujets AA, une surexpression dose-dépendante de gènes impliqués dans l’adhérence (ICAM-1, VCAM-1, E-sélectine), dans l’inflammation (IL-6, IL-1β et CD40-I) et dans la coagulation (TF). Au niveau protéique, ICAM-1 est aussi surexprimé. En effet les MP SS induisent dès 4 heures d’incubation, une augmentation de la densité moyenne d’ICAM-1 membranaire, ainsi qu’une augmentation de la proportion de cellules exprimant cette protéine. ICAM-1 étant impliquée dans l’adhérence des leucocytes à l’endothélium (roulement, adhérence ferme et même transmigration). / Sicle cell disease (SCD) is the first genetic disease in France and more specifically in Guadeloupe. It is a blood disorder due to a point mutation in the β-globin gene. The corresponding peptide chain being a part of hemoglobin, SCD patients have an abnormal hemoglobin called “HbS”, contrary to the normal one, so called “HbA”. In hypoxic conditions, HbS forms polymers inside red blood cells (RBCs), thereby making them rigid but also fragile. Consequently, RBCs can stop blood flow due to their low deformability, and so cause a painful vaso-occlusive crisis, which is a complication characterizing SCD. This pathophysiological model has been modified by recent results showing the involvement of leukocytes in the establishing of these occlusions. Besides, sickle RBCs are more prone to hemolysis owing to their being fragile. Due to this exacerbated hemolysis, hemoglobin is released in the plasma and diminishes the bioavailability of the main vasodilator, nitrite monoxide. Moreover, rigid sickled RBCs entail endothelium activation, which results in a pro-inflammatory, a pro-adhesive and a pro-coagulant context. This latter favors blood cells activation, among which are platelets and erythrocytes that bud high quantities of submicrometric membrane vesicles called microparticles, or MPs. In the absence of curative treatment for all patients, we decided to study the profile but also the role of MPs from SCD patients to better understand this disease and hoping to find a new diagnostic or therapeutic pathway. We showed that SC patients have lower MP levels than SS patients, but higher MP levels than AA subjects. Surprisingly, we have observed that SC MPs, whether they derive from RBCs or platelets (PLTs), have higher densities of exposed phosphatidylserine (PS) than SS MPs. Since this phospholipid is involved in the activation of the coagulation cascade, it would be interesting to evaluate the intensity of this activation by SS or SC MPs. One could also compare these intensities to the one induced by MPs from SS patients under hydrocarbamide. Indeed we also showed that 2 years after the beginning of this treatment, erythrocyte-derived MP are larger and expose PS much less.As MPs are physiologically in the blood, they can interact with blood cells but also with the vascular endothelium. Given the known changes of this endothelium in SCD (pro-adhesive, pro-inflammatory and pro-coagluant), we then focused on the impact of SCD MPs on endothelial cells (ECs). These cells came from human bone marrow, a territory frequently affected by vaso-occlusions. These experiments showed that SS and SC MPs, induce, compared to AA MPs, a dose-dependent overexpression of genes involved in adherence (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin), in inflammation (IL-6, IL-1β and CD40-I) and in coagulation (TF). At the protein level, ICAM-1 is also overexpressed. Indeed SS MPs induce within 4 hours of incubation, an increase of the mean membrane density of ICAM-1, but also an increased proportion of cells bearing this protein. As ICAM-1 is involved in leukocytes adherence to the endothelium (rolling, firm adhesion and even transmigration), SS MPs may, by triggering ICAM-1 overexpression at the endothelium surface, allow their adherence to the endothelium, thereby promoting RBC adherence and so the occlusion of the vessel and the occurring of a VOC. It would be interesting to determine which type of MP cause the overexpression of ICAM-1 and to evaluate if it is sufficient to increase in vitro adherence of leukocytes to ECs stimulated with MPs. This would allow to evaluate how important MPs are when considering the fight against sickle cell disease.

De nombreuses études épidémiologiques et cliniques ont montré que la pollution aux particules en suspension était étroitement liée à la morbidité et à la mortalité cardiovasculaire. Les particules les plus fines, d’un diamètre aérodynamique inférieur à 2,5 µm, semblent être les plus nocives car elles peuvent pénétrer profondément dans les poumons et pourraient atteindre la circulation systémique. Une grande partie de cette fraction est constituée de particules diesel (DEP) issues du trafic automobile. Cependant, les mécanismes physiopathologiques responsables de la toxicité des particules diesel n’ont pas encore été entièrement identifiés.Afin de mieux comprendre le mode d’action des DEP, nous avons étudié dans un premier temps leurs effets sur la fonction endothéliale vasculaire. Nous avons d’abord évalué leurs effets in vitro sur les réponses vasomotrices d’aorte isolée de rat. Nous avons observé que l’incubation avec les DEP inhibait les relaxations endothélium-dépendantes à l’acétylcholine, à la fois chez le rat normo- et chez le rat hypertendu ;cet effet est réversible après ajout de superoxyde dismutase. Les réponses endothélium-indépendantes sont également altérées mais dans une moindre mesure. Ces résultats montrent que la toxicité vasculaire des DEP est due à un stress oxydatif. Nous avons ensuite analysé les effets in vivo (par voie endotrachéale) de ces DEP. Les résultats ont montré que les DEP induisaient une inhibition des réponses endothélium-dépendantes, mais uniquement chez le rat hypertendu. Il semblerait donc que, in vivo, il y ait une synergie d’action entre les DEP et l’hypertension. Cette dysfonction endothéliale est accompagnée d’une surexpression de l’ARNm de la p22phox, sous-unité de la NADPH oxydase connue pour son implication majeure dans le stress oxydatif de la paroi vasculaire.La seconde partie de notre travail a consisté à identifier des substances médicamenteuses capables de prévenir les désordres occasionnés par les DEP. Nous avons ainsi soumis des rats à différents traitements médicamenteux (rosuvastatine, apocynine et ramipril) avant de prélever leur aorte et d’évaluer l’effet des DEP sur les réponses vasomotrices. Ces traitements n’ont pas permis de protéger l’endothélium de la toxicité in vitro des DEP. Par contre, un traitement à la rosuvastatine a permis de réduire le stress oxydatif induit par l’exposition in vivo (endotrachéale) aux DEP au sein de l’aorte thoracique de rats hypertendus. Ces résultats ont été confirmés in vitro dans des cellules endothéliales humaines (HUVEC). L’effet protecteur de la rosuvastatine sur le stress oxydatif induit par les DEP semble provenir d’une interaction avec les voies de la NO synthase endothéliale et de la NADPH oxydase.Dans la troisième partie de ce travail, nous avons tenté d’identifier le rôle de l’inflammation dans la toxicité induite par les DEP. Nous avons plus particulièrement étudié l’effet des DEP sur la polarisation des macrophages. Nos résultats ont montré que les DEP étaient incapables de polariser les macrophages Mphi en macrophages pro-inflammatoires M1 ou en macrophages anti-inflammatoires M2 ;du moins, ils n’avaient aucun effet sur l’expression des marqueurs M1 (TNF-alpha et IL 1-beta) et M2 (MRC 1 et TGM2) utilisés dans cette étude. Par ailleurs, l’exposition aux DEP n’a pas permis d’inverser le phénotype des macrophages M1 ou M2. Ces résultats plaident contre un rôle important de l’inflammation dans la toxicité vasculaire induite par les DEP.Nos résultats montrent dès lors, que dans nos modèles in vitro et in vivo, la toxicité vasculaire des DEP est directement liée à la production d’anion superoxyde. Cependant, contrairement à d’autres modèles expérimentaux, nous n’avons pas pu mettre en évidence de réaction inflammatoire induite par ces microparticules. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Résumé : Cette thèse porte sur l’élaboration d’un outil de capture d’ADN permettant d’identifier une mutation génétique (SNP) grâce à la formation de sandwichs avec des particules de carboxylatex biofonctionnalisées avec des oligonucléotides couplée à une détection de la fluorescence. Le modèle biologique choisi pour ce projet est le génotypage plaquettaire et plus particulièrement la recherche du gène biallélique HPA-1. Le principal objectif de ce travail a été d’optimiser un outil de capture préalablement développé dans l’équipe (Trévisan, 2011) afin de réduire le nombre d’étapes et de simplifier la mise en œuvre globale du test en modifiant les interactions moléculaires utilisée pour capturer l’ADN cible et en utilisant des particules fluorescentes comme élément de détection. En présence d’ADN cible, des sandwichs sont formés entre les particules fluorescentes et les particules magnétiques biofonctionnalisées. Ces sandwichs sont purifiés par séparation magnétique et la fluorescence est détectée par trois méthodes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (détection par ondes évanescentes). Dans un premier temps, les paramètres de fonctionnalisation chimique et biologique des différentes particules (magnétiques et fluorescentes) ont été déterminés et optimisés ainsi que les conditions d’hybridation pour la capture de l’ADN cible. Ensuite, la formation des sandwichs et leur détection ont été suivies par des mesures de fluorescence en utilisant trois méthodes différentes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (capteur à ondes évanescentes). Les résultats obtenus avec les différentes méthodes de détection sont concordants et montrent que l’outil de capture d’ADN développé permet de capturer la cible synthétique (oligonucléotide) HPA-1 en réduisant le temps d’analyse de 45 min. Dans nos conditions, le test permet de discriminer l’allèle a de l’allèle b du gène HPA-1 qui ne diffère que d’un nucléotide. Le rapport des signaux de fluorescence issus du sandwich spécifique et du sandwich non spécifique est d’environ 2,5 à 3. Ce rapport devra être amélioré par la suite, en optimisant les conditions de formation des sandwichs. La prochaine étape consistera à optimiser le système de capture d’ADN développé pour gagner en spécificité et déterminer la limite de détection du test. Ce test devra également être validé avec des échantillons biologiques. A plus long terme, la fluorescence pourra être détectée par un photodétecteur miniaturisé actuellement développé à l’Université de Sherbrooke. Des études préliminaires présentées dans ce manuscrit montrent les potentialités de ce nouveau transducteur. // Abstract : This thesis is about the development of a new assay to capture DNA. This assay is based on the formation of sandwiches between biofunctionnalized with oligonucleotides carboxylatex microparticles combined with fluorescence detection. It should be able to discriminate single nucleotide polymorphism (SNP). This assay is designed to be applied to platelet genotyping for the research of the gene HPA-1. The main goal of this work was to improve an assay previously developed (Trévisan, 2011) by INL and EFS Rhône-Alpes. The objectives are to reduce the number of steps and to simplify the test. To do so, the molecular interactions used in order to capture target DNA are modified and fluorescent microparticles are used for the detection. In the presence of target DNA, sandwiches are formed between both biofunctionnalized fluorescent and magnetic particles. Those sandwiches are purified through magnetic separation. Then, fluorescence is detected by three methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader (detection with an evanescent wave). First, chemical and biological parameters for the functionalization of the different particles (magnetic and fluorescent) are determined. The conditions for the capture of target DNA were optimized. Then, the formation and the detection of the sandwiches were estimated by measuring the fluorescence using three different methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader. The results obtained with the three methods are consistent. They show that the new system enables to capture synthetic target (oligonucleotide) HPA-1 with a reduction of total time analysis of 45 min. In our conditions, SNP can be discriminated for HPA-1 gene. For this discrimination, the fluorescence signal ratio about 2.5 to 3. This ratio should be improved by optimizing the conditions of sandwiches formation. Next step will consist in the optimization of the system developed to capture DNA in order to gain specificity and to determine the limit of detection. This test should also be validated with biological samples. In the long term, fluorescence could be detected by a miniaturized photodetector developed in the University of Sherbrook. Preliminary studies presented in this manuscript show the potentialities of this new transducer.

Cette thèse porte sur l’élaboration d’un outil de capture d’ADN permettant d’identifier une mutation génétique (SNP) grâce à la formation de sandwichs avec des particules de carboxylatex biofonctionnalisées avec des oligonucléotides couplée à une détection de la fluorescence. Le modèle biologique choisi pour ce projet est le génotypage plaquettaire et plus particulièrement la recherche du gène biallélique HPA-1. Le principal objectif de ce travail a été d’optimiser un outil de capture préalablement développé dans l’équipe (Trévisan, 2011) afin de réduire le nombre d’étapes et de simplifier la mise en oeuvre globale du test en modifiant les interactions moléculaires utilisée pour capturer l’ADN cible et en utilisant des particules fluorescentes comme élément de détection. En présence d’ADN cible, des sandwichs sont formés entre les particules fluorescentes et les particules magnétiques biofonctionnalisées. Ces sandwichs sont purifiés par séparation magnétique et la fluorescence est détectée par trois méthodes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (détection par ondes évanescentes). Dans un premier temps, les paramètres de fonctionnalisation chimique et biologique des différentes particules (magnétiques et fluorescentes) ont été déterminés et optimisés ainsi que les conditions d’hybridation pour la capture de l’ADN cible. Ensuite, la formation des sandwichs et leur détection ont été suivies par des mesures de fluorescence en utilisant trois méthodes différentes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (capteur à ondes évanescentes). Les résultats obtenus avec les différentes méthodes de détection sont concordants et montrent que l’outil de capture d’ADN développé permet de capturer la cible synthétique (oligonucléotide) HPA-1 en réduisant le temps d’analyse de 45 min. Dans nos conditions, le test permet de discriminer l’allèle a de l’allèle b du gène HPA-1 qui ne diffère que d’un nucléotide. Le rapport des signaux de fluorescence issus du sandwich spécifique et du sandwich non spécifique est d’environ 2,5 à 3. Ce rapport devra être amélioré par la suite, en optimisant les conditions de formation des sandwichs. La prochaine étape consistera à optimiser le système de capture d’ADN développé pour gagner en spécificité et déterminer la limite de détection du test. Ce test devra également être validé avec des échantillons biologiques. A plus long terme, la fluorescence pourra être détectée par un photodétecteur miniaturisé actuellement développé à l’Université de Sherbrooke. Des études préliminaires présentées dans ce manuscrit montrent les potentialités de ce nouveau transducteur. / This thesis is about the development of a new assay to capture DNA. This assay is based on the formation of sandwiches between biofunctionnalized with oligonucleotides carboxylatex microparticles combined with fluorescence detection. It should be able to discriminate single nucleotide polymorphism (SNP). This assay is designed to be applied to platelet genotyping for the research of the gene HPA-1. The main goal of this work was to improve an assay previously developed (Trévisan, 2011) by INL and EFS Rhône-Alpes. The objectives are to reduce the number of steps and to simplify the test. To do so, the molecular interactions used in order to capture target DNA are modified and fluorescent microparticles are used for the detection. In the presence of target DNA, sandwiches are formed between both biofunctionnalized fluorescent and magnetic particles. Those sandwiches are purified through magnetic separation. Then, fluorescence is detected by three methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader (detection with an evanescent wave). First, chemical and biological parameters for the functionalization of the different particles (magnetic and fluorescent) are determined. The conditions for the capture of target DNA were optimized. Then, the formation and the detection of the sandwiches were estimated by measuring the fluorescence using three different methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader. The results obtained with the three methods are consistent. They show that the new system enables to capture synthetic target (oligonucleotide) HPA-1 with a reduction of total time analysis of 45 min. In our conditions, SNP can be discriminated for HPA-1 gene. For this discrimination, the fluorescence signal ratio about 2.5 to 3. This ratio should be improved by optimizing the conditions of sandwiches formation. Next step will consist in the optimization of the system developed to capture DNA in order to gain specificity and to determine the limit of detection. This test should also be validated with biological samples. In the long term, fluorescence could be detected by a miniaturized photodetector developed in the University of Sherbrook. Preliminary studies presented in this manuscript show the potentialities of this new transducer.

L'insuffisance rénale chronique (IRC) est associée à une importante morbidité et mortalité cardio-vasculaire, à laquelle participent l'inflammation chronique, le stress oxydant et la dysfonction endothéliale. Les toxines urémiques sont des solutés s'accumulant dans le sérum et les tissus des patients IRC. Parmi elles, les toxines urémiques liées aux protéines sont mal épurées par la dialyse, et ont une toxicité endothéliale démontrée in vitro. Nous avons démontré que l'indoxyl sulfate (IS), une toxine liée aux protéines, induit la production de radicaux oxygénés (ROS) par les cellules endothéliales en culture (HUVEC), par le biais de l'activation de la NADP(H) oxydase, et par une déplétion en glutathion intracellulaire. Ce stress oxydant était induit par des concentrations d'IS rencontrées dans le sérum des patients IRC. Les patients IRC ont un niveau élevé de microparticules endothéliales (MPE), marqueur d'activation et de lésion endothéliale, et un nombre diminué de progéniteurs endothéliaux circulants (PEC), qui représentent les capacités de réparation de l'endothélium lésé. Nous avons souhaité étudier si les toxines urémiques jouaient un rôle dans ce déséquilibre. Chez des patients hémodialysés (HD), nous avons démontré que le nombre de PEC CD34+/CD133+ était inversement corrélé aux taux de 3 toxines urémiques, l'indole-3-acétique acide (IAA, une toxine proche de l'IS) et la ß2 microglobuline. In vitro, l'IAA induit l'apoptose des progéniteurs CD133+, et cet effet est imbibé par l'ajout d'érythropoïétine (EPO) au milieu de culture. Le sérum urémique induit l'apoptose des PEC. Bien que le nombre des PEC soit diminué chez les patients HD par rapport aux contrôles, leur nombre est positivement corrélé à 2 marqueurs de lésion vasculaire : le nombre de MPE, et la rigidité artérielle évaluée par la vitesse de l'onde de pouls aortique. Cela suggère que les PEC restent mobilisables chez les patients HD, en réponse aux lésions vasculaires, peut-être en partie grâce à leur traitement par EPO. En conclusion, les toxines urémiques participent à la dysfonction endothéliale des patients IRC, en augmentant le stress oxydant endothélial et la libération de MPE, et réduisent les capacités de réparation endothéliale en diminuant la survie des PEC. / Chronic kidney disease (CKD) is associated with dramatically increased cardio-vascular morbidity and mortality. Not only do traditional risk factors explain this accelerated atherosclerosis, but also chronic inflammation, oxidative stress and endothelial dysfunction. Uremic toxins are solutes accumulating in serum and tissues of CKD patients. Among them, protein-bound uremic toxins are poorly removed by haemodialysis (HD), and have shown deleterious effects on cultured endothelial cells (HUVEC). We showed that indoxyl suphate (IS), a protein-bound toxin, induces reactive oxygen species production in HUVEC, through activation of NAD(P)H oxidase, and intracellular glutathione depletion. This induction of oxidative stress was observed for concentrations of IS found in CKD patients. CKD patients exhibit high levels of endothelial microparticles (EMP), a marker of endothelial lesion, and low levels of endothelial progenitor cells (EPC), originating from bone marrow and implied in endothelial repair. We asked whetehr uremic toxins could play a role in this imbalance. In HD patients, we showed that the number of CD34+/CD133+ EPC was inversely correlated with the serum levels of two uremic toxins, indole-3-acetic acid (IAA, a protein-bound uremic toxin close to IS) and ß2microglobulin. In vitro, IAA induced apoptosis of CD133+ cells, unless erythropoietin was added to the medium. Uremic serum induced EPC apoptosis. Although endothelial progenitor cell number was reduced in CKD patients compared to healthy controls, it was positively correlated with two markers of vascular lesion : the number of EMP in serum, and the pulse wave velocity reflecting arterial stifness. This suggests that EPC can be mobilized in the circulation upon vessel injury, in spite of uremic toxicity, and maybe thanks to erythropoietin treatment in HD patients. In conclusion, uremic toxins induce endothelial dysfunction, assessed by increased endothelial oxidative stress and shedding of EMP, and reduce regeneration capacities of endothelium. They are probably key actors in cardio-vascular risk of CKD patients.

Les analogues de nucléosides (AN), sont des agents importants dans le traitement d’hémopathies malignes et de certaines tumeurs solides. Le catabolisme rapide, la résistance cellulaire au traitement et le grand volume de distribution dans le corps limitent potentiellement l’efficacité thérapeutique des AN. Notre objectif est de concevoir un vecteur permettant un ciblage de ces molécules vers les tissus cancéreux, assurant son internalisation cellulaire et sa protection dans les milieux biologiques. Trois types de vecteurs de taille micronique, submicronique et moléculaire ont été élaborés et caractérisés : microparticules polymériques à base de poly(ε-caprolactone) (PCL), liposomes multilamellaires et complexes d’inclusion de la prodrogue de la cytarabine (Ara-C), qui est active sur certaines lignées cellulaires résistantes à l’Ara-C, l’AraC-SATE (bis(tbutyl-S-acyl-2-thioethyl)-cytidine monophosphate).Les microparticules ont été préparées par la méthode de « double émulsion - évaporation de solvant » en utilisant comme surfactants des copolymères amphiphiles composés de blocs biodégradables de PCL et de blocs bio-éliminables de polyéthylène glycol (PEG). Une série de copolymères mPEG-PCL avec des blocs PCL de différents poids moléculaires a été synthétisée et l’effet de la longueur de chaînes de PCL sur les caractéristiques physico-chimiques des particules a été étudié. Une efficacité d’encapsulation satisfaisante a pu être obtenue, qui a été dix fois plus importante que celle des microparticules à base de PCL seul. Les liposomes ont été préparés par la méthode d’injection d’éthanol. Une étude de formulation a été réalisée afin de sélectionner la formule permettant d’obtenir la meilleure efficacité d’encapsulation. Le test d’internalisation cellulaire et du comportement aérodynamique des liposomes nébulisés ont montré la pertinence des liposomes élaborés pour le ciblage des cellules pulmonaires qui pourrait être d'un grand intérêt pour le traitement des métastases au niveau des poumons.L’encapsulation moléculaire de l’AraC-SATE dans l’hydroxyporpyl-β-cyclodextrine a été réalisée pour augmenter la solubilité apparente de la prodrogue. L’évaluation des complexes sur des cultures de cellules leucémiques murines a montré une activité cytotoxique comparable à celle de la prodrogue indiquant que l’inclusion moléculaire ne modifie pas l’activité biologique de la prodrogue. / Nucleoside analogues (NA) are important agents in the treatment of haematological malignancies and solid tumours. Their rapid catabolism, cell resistance and overdistribution in the body jeopardize the NA chemotherapy. Our objective is to design a vector for these molecules targeting cancerous tissue and ensuring its cellular internalization and protection in the biological media. Micro-sized, nano-sized and molecular vectors were developed and characterized: polymeric microparticles of poly (ε-caprolactone) (PCL), multilamellar liposomes and inclusion complexes of the prodrug of cytarabine (Ara-C), which is active on some cell types resistant to treatment, the AraC-SATE (bis(tbutyl-S-acyl-2-thioethyl)-cytidine monophosphate).The microparticles were prepared by the "double emulsion - solvent evaporation" method using as surfactants, amphiphilic copolymers consisting of biodegradable blocks (PCL) and bio-removable blocks (polyethylene glycol, PEG). A series of copolymers mPEG-PCL with PCL blocks of different molecular weights was synthesized and the effect of PCL chain length on the particle physico-chemical properties was studied. Satisfactory encapsulation efficiency could be obtained, which was 10 times greater than that of microparticles prepared with PCL alone. Liposomes were prepared by the ethanol injection method. A formulation study was conducted in order to select the formula having the optimal encapsulation efficiency. Investigations about the cell internalization and the aerodynamic behaviour of the nebulized liposomes showed the relevance of developed liposomes for targeting lung cells that could be of great interest for the treatment of metastases in the lungs. The molecular encapsulation of the AraC-SATE in the hydroxyporpyl-β-cyclodextrin was carried out in order to increase the apparent solubility of the prodrug. The evaluation of inclusion complexes on murine leukemic cell cultures showed a cytotoxic activity comparable to that of the prodrug indicating that the molecular inclusion does not alter the biological activity of the prodrug.

Les microparticules (MP) sont des vésicules de la membrane plasmique émises après stress cellulaire. Nous avons étudié le rôle des MPs leucocytaires extraites de la rate de rats comme marqueur du vieillissement et effecteurs de la senescence et de la dysfonction endothéliales induites par les fortes concentrations de glucose (HG). L’émission basale de MP augmente avec l’âge qui favorise leur génération en réponse au LPS ou au PMA/ionophore A23187 (MPLPS, MPPMA/I). Les MP de rats âgés mais pas de jeunes induisent la sénescence de cellules endothéliales primaires d’artères coronaires (AC) de porc. MPLPS ou MPPMA/I de rats jeunes, mais pas MPCTL (cellules non traitées) réduisent la relaxation dépendante de l’endothélium d’anneaux d’AC en réponse à la bradykinine avec sous-expression de eNOS, surexpression de COX2, ICAM-1, VCAM-1. HG favorise l’émission des MP de rate. Dans les AC en HG, la vasoconstriction en réponse au U46619l est diminuée de manière dépendante du SGLT1/2 et de l’EDHF. / Microparticles (MP) are plasma membrane vesicles shed from stimulated cells. We investigated whether leukocyte MP extracted from rat spleen are reliable markers of aging and effectors of high glucose (HG)-induced endothelial senescence and dysfunction. Data indicate that ageing enhances MP shedding from spleen cells of middle-age and aged rats and raises MP release in response to LPS, or to PMA and ionophore A23187. Of note, MP from aged but not young rats induced senescence of porcine coronary artery primary endothelial cells. In young rats, MPLPS, MPPMA/I but not from resting cells (MPCTL) reduced the endothelial-dependent relaxation of coronary artery rings (CAR) in response to bradykinin with down-regulation of eNOS, up-regulation of COX-2, ICAM-1, VCAM-1. HG enhanced early and late MP release from spleen cells. Prolonged exposure to HG potentiated endothelial dysfunction in CAR and altered vasoconstriction in response to U46619l in a SGLT1/2 and EDHF dependent manner.