Thèse de doctorat : Génie des procédés et des produits : INPL : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr.

La connectomique est un des plus grands défis dans la compréhension et le diagnostic des maladies du cerveau. En effet, les mauvaises connexions et le mauvais fonctionnement des circuits du cerveau sont à l'origine de nombreuses maladies neurologiques. Ceci peut être causé par des défauts génétiques, un dérèglement en cours de développement ou à une dégénérescence à un stade ultérieur de la vie. Pour étudier les changements morphologiques à la base des maladies mentales et neurologiques, les technologies d'imagerie actuelles sont limitées. Du fait de la difficulté à acheminer la lumière à l'intérieur de grands volumes de tissus, les études se font bien souvent à partir d'images bidimensionnelles de coupes histologiques et résultent, dans de nombreux cas, à des informations spatiales incomplètes. Dans ce projet, nous avons adopté une stratégie qui permet d'obtenir des images 3D de grands volumes à haute résolution, et ce, sans coupe histologique. D'une part, des techniques de transparisation ont été utilisées afin de minimiser la diffusion de la lumière dans les échantillons de tissus. D'autre part, pour une imagerie plus rapide, nous avons conçu un microscope de fluorescence à feuillet lumineux, à large champ de vue et à haute résolution. Les rayons d'un faisceau laser afocal sont déviés par un axicon pour interagir entre eux et former, dans l'échantillon, une fine aiguille lumineuse qui forme un feuillet lumineux une fois balayée à très grande vitesse dans un plan. Le signal de fluorescence émanant de la section illuminée par le feuillet est collecté selon un axe perpendiculaire par une caméra scientifique CMOS. Cette stratégie a permis de surpasser les systèmes déjà existants en fournissant des images grand volume avec une résolution isotrope de l'ordre du micron. Enfin, ce nouvel outil nous a permis de faire des études précédemment impossibles et aura certainement un impact direct sur l'évaluation post-mortem et l'optimisation de traitements, la découverte de médicaments et l'identification des régions cibles pour les maladies neurodégénératives. / Connectomics is one of the biggest challenges in understanding and diagnosing brain diseases. Indeed, many neurological diseases have their origins in a bad connection or a malfunction of brain circuits. This can be caused by genetic defects, developmental dysfunction or degeneration at a later stage of life. To study the morphological changes underlying mental and neurological diseases, current imaging technologies are limited. In fact, studies are often based on two-dimensional images of histological sections and result, in many cases, in incomplete spatial information. In this project, we adopted a strategy that allows us to obtain 3D images of large volumes at high resolution, without any histological section. On the one hand, optical clearing techniques were used to minimize light scattering in tissue samples. On the other hand, for faster imaging, we have designed a fluorescence light sheet microscope with a large field of view and high resolution. The rays of an afocal laser beam are deflected by an axicon (conical prism) to interact with each other and form, in the sample, a thin needle-shaped beam which, when swept at a very high speed along an axis, forms a light sheet. The fluorescence signal from the section illuminated by the light sheet is collected along a perpendicular axis by a scientific CMOS camera. This strategy has surpassed existing systems by providing large volume images with an isotropic micronic resolution. Finally, this new tool has allowed us to make previously impossible studies and will certainly have a direct impact on postmortem evaluation and treatment optimization, drug discovery and identification of target areas for neurodegenerative diseases.

Le mémoire explore l'intégration d'une matrice de photodiode et d'un spectromètre dans un microscope *STED* [1], il se concentre sur deux objectifs principaux : **l'intégration d'une matrice de photodiodes et d'un spectromètre dans un microscope *STED*** et **le développement et mise en œuvre d'algorithmes pour le traitement des données temporelles**. Le premier objectif présente des travaux sur l'intégration d'une matrice de photodiodes, un spectromètre capable de mesurer les longueurs d'onde des photons dans une plage spécifique. Ce développement permet l'acquisition d'images de bactéries contenant divers fluorophores, résolus à la fois temporellement et spectralement. Le second objectif se concentre sur le déploiement, la caractérisation, et la mise en œuvre d'algorithmes pour le traitement des données temporelles générées par le système de détection. Les algorithmes *MLE*, *phaseurs* [2] et *FLI-NET* [3] ont été testés sur des données simulées et expérimentales pour mesurer le temps de vie des fluorophores et la proportion entre deux populations caractérisées par deux temps de vie distincts. Une étude approfondie de ces algorithmes a été réalisée sur des images *FLIM* simulées et réelles pour évaluer leur efficacité. Le mémoire aborde également l'application de la technique *SPLIT-STED* [4], qui améliore la résolution spatiale du microscope *STED* en exploitant les informations temporelles. Cette méthode a montré des améliorations notables de la résolution, particulièrement utiles pour l'analyse d'échantillons vivants. Le mémoire met en lumière les limitations existantes dans le traitement des données *FLIM*, notamment en termes de mesure des temps de vie et des proportions associées, surtout lorsque le nombre de photons est limité. Il présente des solutions potentielles, telles que l'utilisation d'un réseau *U-NET* [5] pour une analyse plus approfondie des données, combinant les informations spatiales, temporelles et spectrales. Ces développements ouvrent la voie à des analyses plus précises et détaillées dans la recherche biologique, en utilisant la microscopie de super-résolution et la microscopie *S-FLIM*. / This master thesis explores the integration of a photodiode array and a spectrometer into a *STED* microscope [1], focusing on two main objectives: **the integration of a photodiode array and a spectrometer into a STED microscope** and **the development and implementation of algorithms for processing temporal data**. The first objective presents work on the integration of a photodiode array with a spectrometer capable of measuring the wavelengths of photons within a specific range. This development allows for the acquisition of images of bacteria containing various fluorophores, resolved both temporally and spectrally. The second objective focuses on the deployment, characterization, and implementation of algorithms for processing the temporal data generated by the detection system. The *MLE*, *phasor* [2], and *FLI-NET* [3] algorithms were tested on simulated and experimental data to measure the fluorophore lifetimes and the proportion between two populations characterized by two distinct lifetimes. An in-depth study of these algorithms was conducted on simulated and real *FLIM* images to evaluate their effectiveness. This master thesis also discusses the application of the *SPLIT-STED* technique [4], which improves the spatial resolution of the *STED* microscope by exploiting temporal information. This method has shown notable improvements in resolution, particularly useful for the analysis of living samples. The master thesis highlights the existing limitations in *FLIM* data processing, particularly in terms of measuring lifetimes and associated proportions, especially when the number of photons is limited. It presents potential solutions, such as the use of a *U-NET* network [5] for a more in-depth analysis of the data, combining spatial, temporal, and spectral information. These developments pave the way for more accurate and detailed analyses in biological research, using super-resolution microscopy and *S-FLIM* microscopy.

Titre de l'écran-titre (visionné le 23 novembre 2023) / Les bactéries lactiques sont indispensables pour la production de produits laitiers fermentés comme le fromage. Les espèces bactériennes Lactococcus lactis et Lactococcus cremoris sont les plus utilisées par l'industrie laitière. Cependant, la fermentation peut être ralentie par des bactériophages. Ils se multiplient via un cycle lytique débutant par leur adsorption à la surface cellulaire. Toutefois, l'adsorption ne mène pas toujours à l'infection dû à la présence de mécanismes de défense contre les phages chez certaines souches bactériennes. Ce phénomène est peu étudié puisque les essais classiques d'adsorption virale nécessitent beaucoup de ressources et les résultats obtenus peuvent être variables et ambigus. L'objectif général de ce projet consistait à explorer l'utilisation de la fluorescence pour optimiser les essais d'adsorption virale. Ainsi, cinq phages infectant des lactocoques et appartenant aux trois principaux groupes (Skunavirus, Ceduovirus et P335) isolés dans les usines laitières ont été sélectionnés afin d'adapter les protocoles à une diversité de phages. D'abord, le protocole classique d'adsorption virale a été utilisé pour cinq phages sur leur souche bactérienne hôte et sur une souche insensible, suspectée de bloquer l'adsorption. Un protocole de microscopie à fluorescence a ensuite été mis au point en utilisant le SYBR Gold pour marquer l'ADN viral et le rouge du Nil pour les membranes bactériennes. Cette méthode a permis une analyse qualitative efficace de l'adsorption des cinq phages et qui concordait avec les résultats obtenus par la méthode classique. Finalement, une méthode a été développée pour réaliser des essais d'adsorption en plaque 96 puits, afin de quantifier l'adsorption des phages sur plusieurs souches bactériennes en un seul essai. L'ajout de la fluorescence a aussi été tenté pour faire ces essais d'adsorption à un plus haut débit. Toutefois, la spécificité du fluorophore et la sensibilité du lecteur de plaque ne conviennent pas au contexte des tests d'adsorption. / Lactic acid bacteria are indispensable to produce fermented milk products, such as cheese. The bacterial species Lactococcus lactis and Lactococcus cremoris are the most used by the dairy industry. However, the fermentation process may be slowdown by the presence of lytic bacteriophages. These phages replicate through the lytic cycle that begins with their adsorption to the cell surface. However, phage adsorption does not always lead to a successful infection, due to the presence of phage defense mechanisms in some bacterial strains. This phenomenon is not often studied because classical phage adsorption assays need a lot of resources, and the results obtained are often variable and ambiguous. The general objective of this project was to explore the use of fluorescence to optimize viral adsorption assays. To do this, five lactococcal phages belonging to the three main groups (Skunavirus, Ceduovirus, and P335) isolated in cheese plants were selected to adapt the protocols to a diversity of phages. First, classical phage adsorption assays were performed with five of these phages on their host strain and on insensitive strains, suspected to block phage adsorption. A fluorescence microscopy protocol was then developed using SYBR Gold as a marker for viral DNA as well as Nile red for bacterial cell membranes. This method allowed a qualitative analysis of the adsorption of five phages on the different bacterial strains, and the results were in accordance with the ones obtained with the classical assays. Finally, a 96-well plate method was developed to quantify phage adsorption on multiple bacterial strains in a single assay. The addition of fluorescence has also been attempted to perform these phage adsorption assays at a higher throughput. However, the specificity of the fluorophore and the sensitivity of the plate reader were not suited to the context of phage adsorption tests.

Pendant plusieurs années, la microscopie à fluorescence a été limitée par le phénomène de diffraction. Or, pour étudier des phénomènes dynamiques à l’intérieur des cellules, une résolution nanométrique est souvent nécessaire. Pour ce faire, une avancée importante pour la microscopie super-résolution fut l’invention du microscope à déplétion par émission stimulée(STED pour STimulated-Emission-Depletion) (Hell and Wichmann, 1994). Si la microscopieSTED permet d’atteindre la précision nanométrique, celle-ci consiste en une technique extrêmement sophistiquée et son utilisation requiert des connaissances avancées dans plusieurs domaines, par exemple, la physique, la chimie et la biologie. Dans le but de rendre le microscope plus accessible, Durand et al. (2018) tire profit des dernières avancées en intelligence artificielle pour automatiser le paramétrage du STED à l’aide d’une boucle d’optimisation. L’objectif visé est de produire des images avec la plus haute qualité tout en minimisant le photo blanchiment et le temps d’exposition. L’incapacité de mesurer la qualité des images et de choisir un compromis parmi les objectifs nécessite malheureusement toujours la présence d’un expert derrière le microscope. En automatisant l’évaluation de la qualité des images et la sélection de compromis, ce mémoire vise à montrer le potentiel des réseaux de neurones pour l’apprentissage de la préférence en sciences de la vie. / For many years, fluorescent microscopy has been limited by diffraction. However, to study dynamic phenomena inside cells, a nanometric resolution is often necessary. To cope with this problem, an important development for fluorescent microscopy was the invention ofSTimulated-Emission-Depletion microscopy (STED) (Hell and Wichmann, 1994). If STEDachieves nanometric microscopy, it is also an extremely sophisticated technique that requires advanced knowledge across a wide range of domains, e.g. physics, chemistry and biology. With the goal of democratising the microscope, Durand et al. (2018) use the last development in artificial intelligence to automate STED parameterization with an optimisation loop. The objective aimed is to produce high-quality images while minimising photo bleaching and exposition time. The inability of measuring image quality and of choosing between compromise among objectives still forces an expert to stay behind the microscope. By automating the assessment of image quality and the selection of compromise, this master thesis intends to demonstrate the potential of neural networks for preference learning in life science.

Le suivi des interactions entre protéines, localisées à la membrane plasmique ou à l'intérieur de cellules, a été réalisé au cours de cette thèse par imagerie de fluorescence et par l'analyse de processus dits de FRET (Forster Resonance Energy Transfer). Pour quantifier le FRET entre nos protéines d'intérêt, nous avons choisi le contraste de durée de vie de fluorescence car cette méthode est indépendante de la concentration et de l'intensité de fluorescence. Afin d'obtenir une résolution suffisante pour des problématiques neurobiologiques, un microscope TIRFLIM (Total Internal Reflection Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) avait préalablement été développé. Celui-ci nous permet de faire de l'imagerie en plein champ avec une résolution axiale sub-longueur d'onde. Ce dispositif a été calibré et optimisé au cours de cette thèse pour répondre au mieux à des problématiques biologiques. Différentes approches ont ainsi été testées dans le but de calibrer la profondeur de pénétration de l'onde évanescente. Des surfaces plasmoniques ont entre autres été utilisées pour augmenter la sélectivité axiale du montage. Notre microscope a été dédié à l'étude de l'effet du cholestérol sur l'interaction entre la protéine précurseur de l'amyloïde APP, protéine transmembranaire impliquée dans la maladie d'Alzheimer et une de ses enzymes de clivage BACE1. Nous avons ainsi effectué un suivi dynamique de l'effet du cholestérol sur l'interaction entre APP et BACE1 dans des cellules HEK-293 et dans des cultures primaires de neurones d'hippocampe d'embryons de rat, de la membrane plasmique à l'intérieur des cellules grâce à notre dispositif TIRFLIM. La mesure d'anisotropie de fluorescence résolue en temps a également été implémentée sur notre montage. Ces mesures résolues en temps et en polarisation ont permis de mesurer le temps de corrélation rotationnelle de fluorophores et de mettre en évidence de manière qualitative différents niveaux d'homodimérisation de protéines impliquées dans la maladie d'Alzheimer.

Thèse de doctorat : Physique : Strasbourg 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 129-134.

Les techniques d'apprentissage machine se posent de plus en plus comme des outils importants pour l'automatisation de diverses tâches, allant de tâches de contrôle à des tâches d'analyse de données. Le domaine de la microscopie à fluorescence est aussi un domaine qui avance rapidement, avec de plus en plus de techniques de fine pointe à super-résolution permettant de résoudre des structures biologiques de plus en plus petites. Or, l'expertise requise pour générer de bonnes acquisitions peut sembler une épreuve difficile à surmonter, ce qui peut limiter l'application de ces techniques. Il y a donc un intérêt croissant à utiliser des techniques d'apprentissage machine pour assister le microscopiste, ou même contrôler les acquisitions. Mon projet consiste au développement d'outils qui facilitent l'entrainement des méthodes d'apprentissage machine. Vu la quantité importante de données nécessaires pour entrainer ces méthodes, il est d'intérêt de développer des outils permettant de générer des données d'entrainement. Dans cette optique, pySTED, un simulateur de microscopie de super-résolution STED a été développé. Le simulateur permet de générer des données synthétiques d'images STED, ce qui pourrait permettre d'augmenter des jeux de données. Additionnellement, pySTED a été développé dans le but de permettre l'entrainement d'agents d'apprentissage par renforcement en simulation, dans le but éventuel de déployer ces agents pour contrôler un vrai microscope STED. Les résultats obtenus témoignent de l'utilité d'avoir un simulateur pour l'entrainement d'algorithmes d'apprentissage machine. En effet, le nombre de données requises en entrainement démontre l'importance du simulateur dans un domaine où l'acquisition de données peut être couteuse. / Machine learning techniques are increasingly emerging as important tools for automating a variety of tasks, from control tasks to data analysis. Fluorescence microscopy is also a fast-moving field, with more and more cutting-edge, super-resolution techniques making it possible to resolve ever-smaller biological structures. However, the expertise required to generate good acquisitions can be difficult to acquire, which can limit the application of these techniques. There is therefore growing interest in using machine learning techniques to assist the microscopist, or even control acquisitions. My project involves the development of tools to facilitate the training of machine learning methods. Given the large amount of data needed to train these methods, it is of interest to develop tools for generating training data. With this in mind, pySTED, the STED super-resolution microscopy simulator, has been developed. The simulator can be used to generate synthetic data from STED images, which could be used to augment datasets. In addition, pySTED has been developed to enable the training of reinforcement learning agents in simulation, with the eventual aim of deploying these agents to control a real STED microscope. The results of this work demonstrate the difficulty and importance of using a simulator to train machine learning methods. Indeed, the amount of data required to train machine learning models highlights the importance of having access to a simulation platform for domains where data acquisition can be costly.

Les méthodes actuelles pour détecter et identifier des microorganismes dans un échantillon sont lentes et complexes. Les techniques d'identification bactérienne, par exemple, nécessitent généralement une étape de culture bactérienne, introduisant des délais pouvant dépasser les 48 heures. Dans plusieurs domaines, telles la recherche arctique, la santé et l'industrie agroalimentaire, la lenteur des analyses bactériologiques peut avoir de lourdes conséquences humaines ou financières. Il existe donc un réel intérêt pour la conception de capteurs sensibles permettant d'outrepasser l'étape de culture bactérienne. Par le passé, notre groupe de recherche a développé une technique de biodétection basée sur les modes de galerie de multiples microsphères fluorescentes en suspension libre dans un échantillon. La sensibilité et la robustesse de cette approche permettent d'envisager son intégration dans un biocapteur rapide et portatif. Cependant, la technologie n'est pas assez mature sous sa forme actuelle pour permettre cette intégration. L'objectif de nos travaux de recherche était donc d'intégrer notre technologie dans un système de laboratoire efficace. Pour ce faire, une nouvelle instrumentation optofluidique est proposée. Cette dernière joint un microscope à fluorescence et un système microfluidique conçu pour mélanger une solution de microsphères avec un échantillon contenant des bactéries. Le mélange est réalisé par un micromélangeur utilisant des rainures dont l'orientation et la position sont optimisées pour favoriser la dispersion de particules solides en suspension dans un fluide. Différentes méthodes d'apprentissage machine servant à analyser les modes de galerie de microsphères fluorescentes sont également décrites. En termes de rapidité, ces dernières surpassent de loin l'algorithme IMARI originellement proposé par notre groupe. Au final, l'instrumentation optofluidique et les méthodes d'analyses présentées dans ce mémoire ont permis de détecter la présence de deux types de picocyanobactéries nordiques. Les avancées réalisées pendant la maîtrise confirment donc le potentiel de notre approche et son intégration éventuelle dans un capteur portatif. / The detection and the identification of microorganisms in a liquid sample is, more often than not, a slow and complex process. The current bacterial identification methodologies, for instance, typically require bacterial growth on culture media, a step which introduces delays of 48 hours or more. In fields such as arctic research, healthcare or food production, these delays can beget serious human and financial consequences. Thus, there is a growing interest for sensitive biosensors capable of bypassing the bacterial growth step. Our research group as previously presented a biodetection scheme based on the analysis of the whispering gallery modes of multiple fluorescent microspheres free-floating in the solution under test. The sensitivity and the robustness of this approach promote its eventual use in a fast and portable biosensing device. However, under its current form, our technology still lacks the appropiate maturity to be integrated in such a device. The research presented in this thesis thus aimed at integrating our technology in an effective laboratory system. To that end, an improved optofluidic instrumentation is proposed. It joins a fluorescent microscope to a microfluidic chip capabe of mixing a solution of microspheres with a sample containing bacteria. The mixing if achived via a staggered herringbone mixer with a groove orientation optimized to promote the dispersion of solide microparticles in suspension. Several machine learning algorithms are also proposed to analyse the whispering gallery modes of our free-floating fluorescent microspheres. In terms of analysis speed, these methods outperform, by a great margin, the IMARI algorithm previously proposed by our group. In the end, the proposed instrumentation and algorithms were used to sucessfully detect the presence of two types of arctic picocyanobacteria. The contributions presented in this thesis thus confirm the potential of our biodetection scheme and further pave the way towards portable biosensors.

Pour bien comprendre et contrôler les aérosols contenant des virus (viroaérosol), un modèle de laboratoire approprié est requis. Pour cette étude, trois bactériophages : P008 couplé au SYBR Gold, PP01 exprimant la GFP et ʎ exprimant la EYFP ont été comparés entre eux et à des microsphères fluorescentes non-biologiques pour leur potentiel en tant que modèle de laboratoire en aérovirologie. Les modèles viraux ont été aérosolisés à partir d’un tampon de phage en utilisant un nébuliseur de TSI (modèle 9301) connecté à une chambre d’aérosols. La taille aérodynamique des aérosols ainsi que leur distribution ont été déterminées à l’aide d’un spectromètre de particules aérodynamique (APS, TSI modèle 3321). Les échantillons de viroaérosols ont été capturés à l’aide d’un impacteur Andersen à six étages contenant soit du tampon de phage à l’intérieur des plaques de chaque étage ou un milieu solide (agar à 1.5%). Les techniques des plages de lyse, du qPCR et la microscopie à fluorescence ont été utilisées pour quantifier les virus récupérés sur les étages de l’impacteur. La microscopie à fluorescence a aussi été utilisée pour quantifier et analyser les modèles viraux sur des particules seules et sur milieu solide. L’ADN viral, des plages de lyse ainsi que des particules fluorescentes ont été observées sur les étages 3 à 6 de l’échantillonneur ce qui corrélait avec les données obtenues par l’APS. La microscopie à fluorescence a permis de visualiser les modèles viraux sur ou à l’intérieur des particules d’aérosols. Ces résultats confirment que les virus peuvent être présents dans l’atmosphère sous forme d’aérosol dont la dimension est bien plus grande que celle de leur propre taille, et que les virus en aérosol peuvent être quantifiés et observés en utilisant la microscopie à fluorescence. L’ensemble de ces résultats suggèrent qu’un bactériophage fluorescent serait un excellent modèle de laboratoire pour étudier le comportement des virus dans l’air. / In order to understand and control virus aerosols (viroaerosols), an appropriate laboratory model is required. In this study, fluorescent bacteriophages P008 coupled to SYBR Gold, PP01 expressing GFP and ʎ expressing EYFP were compared to non-biological fluorescent microspheres for their potential as viral models in aerovirology. The test viruses were aerosolized in phage buffer using TSI’s 9301 model atomizer attached to a commercially available aerosol chamber. The aerodynamic particle size distribution of the viroaerosols was determined with an aerodynamic particle sizer (APS, TSI’s 3321 model). Samples were collected with a Sixstage Andersen impactor loaded with Petri dishes containing either phage buffer or a solid 1.5% agar medium. Plaque assays, qPCR and fluorescence microscopy were used to quantify the virus load on each stage of the impactor. Fluorescence microscopy was also used to quantify and analyze single aerosol particles in liquid or solid media. Viral DNA, infectious particles and fluorescent particles were detected on stages 3 to 6 of the sampler and correlated with the aerodynamic particle distribution. Fluorescence microscopy permitted visualization of viruses on or encapsulated inside aerosol particles and on a solid medium. These results confirm that viruses may be present in the atmosphere as aerosols, which are much larger than their own particle size, and that viruses could be visualized and quantified in aerosols using fluorescence microscopy. These findings suggest that a fluorescence-expressing bacteriophage would be an excellent laboratory model for the study of viruses in aerosols.