Les tétraspanines sont des protéines transmembranaires de la membrane plasmique qui forment un réseau d'interactions protéiques, appelé "Tetraspanin Web", entre tétraspanines ou avec d'autres protéines partenaires. Elles ont également la capacité de s'organiser en microdomaines membranaires appelés TEM (Tetraspanin-Enriched Microdomains). Ces protéines sont impliquées dans plusieurs mécanismes cellulaires et associées à de nombreuses pathologies. La diversité de leurs interacteurs reflète la pléiotropie de leurs fonctions.. Entre autres, elles jouent un rôle déterminant au cours des processus infectieux et notamment lors du bourgeonnement du VIH-1. Des études récentes menées au laboratoire ont plus particulièrement démontré, à l’échelle de la molécule unique, que les tétraspanines CD9 et CD81 étaient spécifiquement recrutées au niveau des sites d'assemblage de la protéine virale Gag. Ces travaux ont été faits dans un système modèle de cellules HeLa transfectées par Gag-GFP, dans lesquelles se forment des sites de bourgeonnement de pseudo-particules virales de type VIH-1. Ces observations soulèvent plusieurs questions quant à l’implication des tétraspanines CD9 et CD81 dans le mécanisme d’assemblage du virus, notamment dans le remodelage de la membrane plasmique de la cellule hôte et sa courbure lors du bourgeonnement, deux phénomènes auxquels les tétraspanines sont associées. Dans ce contexte, le principal objectif de ma thèse a été de déterminer l'organisation structurale des sites d'assemblage du VIH-1 en utilisant une nouvelle méthodologie combinant la microscopie à force atomique (AFM) et la microscopie super résolue de type dSTORM. La microscopie dSTORM fait partie des techniques basées sur la localisation de molécules individuelles et permet de cartographier des protéines fluorescentes avec une résolution latérale inférieure à 50nm tandis que l'AFM permet de déterminer la topographie membranaire avec une résolution du même ordre. La première partie de ma thèse a consisté à construire ce nouveau montage expérimental, en collaboration avec l'équipe de Marcelo Nollmann. Nous avons confirmé en premier lieu que les sites regroupant Gag-GFP corrélaient bien avec des protrusions membranaires caractérisés par AFM Nous avons montré que les tétraspanines CD9 étaient spécifiquement recrutées au niveau de ces sites de bourgeonnement et que leur recrutement corrélait avec le degré de maturation des bourgeons Gag-GFP qui dépend du diamètre et de la hauteur des sites de bourgeonnement. En plus d’une redistribution des tétraspanines au cours du processus d’assemblage des nouveaux virions, nous avons pu observer une déplétion des tétraspanines CD9 et CD81 à la surface des cellules exprimant la protéine virale Gag-GFP. Ces résultats préliminaires révèlent la capacité des protéines virales Gag à modifier spécifiquement l’environnement de la cellule hôte en modulant la répartition et l’expression des tétraspanines au niveau de la membrane plasmique, suggérant un rôle déterminant des tétraspanines au cours de la réplication du virus VIH-1. / Tetraspanins are transmembrane proteins forming a network of protein-protein interactions at the cell surface, called "Tetraspanin Web". They can also be organized into membrane microdomains named « TEMs » for « Tetraspanin Enriched Microdomains ». These domains are involved in many cellular functions and pathologies. The role of tetraspanins during infection has been described early on, notably TEMs are implicated in various aspects of the HIV-1 life cycle, including entry and budding. It has been demonstrated recently, at the single molecule level, that the CD9 and CD81 tetraspanins are specifically recruited by HIV-1 Gag to viral assembly and release sites. These observations raise crucial questions about the role of these two tetraspanins in this process and their implication in membrane remodelling and/or bending during assembly and budding of the viral particles. In this context, the main objective of my PhD thesis was to investigate the structural organization of HIV-1 assembly/budding sites by a combination of two advanced microscopy techniques: atomic force microscopy (AFM) and direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM). AFM provides information on the membrane topography with lateral resolution lower than a 50 nm. A similar resolution can be reached with dSTORM that is suitable to map fluorescently labeled proteins at the single molecule level. Combination of these two techniques allowed us to characterize the distribution of CD9 clusters within HIV-1 budding sites in the membrane topography context. The first task of my PhD was to build this new combo in collaboration with Marcelo Nollmann's group. We then performed AFM imaging of HeLa cells transfected with the viral protein Gag fused to GFP and demonstrated that Gag-GFP assembly sites correlate with membrane protrusions. In addition, by dSTORM imaging of the same region, we have shown that CD9 tetraspanins were enriched and recruited at Gag assembly sites and that their distribution depends on the assembly stage of the virus-like particles imaged with AFM (the dimensions of the budding sites relates to the assembly stage of the viral particles). Finally, we documented that Gag mediated depletion of both CD9 and CD81 tetraspanins from the surface of HeLa transfected cells. These results reveal the impact of the viral protein Gag on the host cell environment by modulating the partition and expression of tetraspanins within the plasma membrane, reinforcing an important role of tetraspanins during HIV-1 life cycle.

Les contacts cellulaires sont formés par l'association et la clusterisation des molécules d'adhésion, qui agissent comme des unités d'organisation et de signalisation, garantissant la cohérence et la plasticité des tissus. Bien que les détails moléculaires des complexes d'adhésion soient bien caractérisés, la façon dont ces unités d'adhérence supramoléculaires sont organisés et régulées dans les conditions physiologiques est méconnue. Nous avons développé et appliqué la microscopie super-résolue et une analyse quantitative pour caractériser l'organisation nanométrique de la E-cadhérine dans le tissu épithélial de l'embryon de drosophile. Les molécules individuelles de la E-cadhérine sont localisées en 3D avec une précision de 30 et 100 nm dans des directions latérale et axiale, respectivement. Nous avons constaté que la E-cadhérine existe soit sous forme de monomères ou d'oligomères, contenant jusqu'à une centaine de molécules. La distribution de taille des clusters suit une loi de puissance (sans taille caractéristique). L'analyse de la répartition de clusters à différentes étapes de la morphogénèse indique que l'état d'agrégation est dicté par la concentration de la E-cadhérine aux jonctions. Pour tenter de déterminer comment la clusterisation de la E-cadhérine est régulée, nous avons perturbé l'endocytose et l'ancrage de la E-cadhérine à l'actine, et analysé l'état de clusterisation. / Cell-cell contacts form through binding and clustering of adhesion molecules, which act as organizational and signaling units and ensure coherence and plasticity of tissues. While the molecular details of adhesion complexes are well characterized, little is known about how these supramolecular adhesion units are organized and regulated in physiological conditions. We developed and applied superresolution microscopy and quantitative analysis to characterize the nanoscale organization of E-cadherin clusters in the early epithelial tissue of Drosophilaembryos. E-cadherin molecules at adherens junctions were localized in 3D with precision of 30 and 100 nm in lateral and axial directions, respectively. We found that E-cadherin exists either as monomers or oligomeric clusters, containing up to one hundred molecules. The cluster size distribution follows a power law - referred as scale free with no characteristic size. Analysis of clustering distribution at different stages of tissue morphogenesis indicates that the state of aggregation is dictated by the junctional concentration of E-cadherin. In an attempt to determine how E-cadherin clustering might be regulated, we perturbed endocytosis and anchoring of E-cadherin to actin, and analyzed the state of E-cadherin clustering. While blocking dynamin-dependent endocytic pathways yields increases of junctional E-cadherin concentration and promotes macroscopic aggregates, RNAi knockdown of α-catenin and Par-3 reduces E-cadherin concentration and changes significantly the organization of E-cadherin.