Microbes typically form highly complex and diverse communities that account for a significant portion of life's genetic diversity. Analysis of living systems, e.g. bacterial or cell population, plays a significant role in detecting and identifying pathogens, testing antibiotic susceptibility, and the fundamental research of population diversity and evolution. This work focuses on the analysis of bacterial communities using droplets based millifluidics. To monitor the bacteria growth, we designed an optofluidic system, combining the encapsulation of bacteria in numerous emulsion droplets to monitor their long-term behavior and relationship in a co-culture environment using fluorescent signals. In the first part of this work, we co-encapsulated and cultured two isogenic strains of Escherichia coli (E. coli) in numerous emulsion droplets to reveal their competition and cooperation relationship. Since two strains of E. coli express blue and yellow fluorescent proteins (BFP and YFP, respectively), we quantified their growth by integrating a fluorescence detection system. We analyzed the following parameters: doubling time, population yield, final biomass ratio, correlation map of doubling time and competition coefficient to characterize and compare the bacterial growth kinetics and behavior in mono and co-cultures. In addition, the experimental observations were compared with the predictions from a single growth model. Finally, we employed the millifluidic device to verify the appearance of cross-protection between antibiotic-sensitive bacteria and antibiotic-resistant bacteria. It is one of the mechanisms by which different bacteria, sharing the same environment, protect each other to survive in the presence of antibiotics. For this purpose, the E.coli YFP strain was chosen as an antibiotic-sensitive group. Simultaneously, the E.coli BFP strain with β-lactam and its mutations were selected as resistant strains. Combining the millifluidic droplet reactor method with other detection strategies, e.g. fluorescence microscopy, fluorescence flow cytometry, and plate reader, we proved the appearance of cross-protection by detecting the filamentary cells, the fluorescence of cell-free media, viable cell rates, cell shape and size, as well as β-lactamase activity. All these results obtained by millifluidic devices proved that this strategy could be used in a high-throughput bacterial coexistence study. In addition, the research of these general fields, such as bacterial community and antibiotic impact, can help us to reveal the interaction between microbial species and determine the right dose of antibiotics to inhibit bacterial growth in a co-existent environment efficiently.

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eine Gerätes, welches die Überwachung von mehreren hundert Mikrobioreaktoren ermöglicht. Dabei sollte es, neben der Reduzierung von Kosten und Arbeitskraft, die konventionellen Pipettiermethoden in der zeitliche Auflösung übertreffen. Weiterhin soll es über eine Gradientenerzeugung verfügen, um sehr feine Variationen der Zusammensetzung des verwendeten Mediums zu ermöglichen. Dafür wurde ein Analysator für fluoreszierenden Tropfen (Fluorescent Droplet Analyser) entwickelt, mit dem ein segmentierter Fluss von mehreren hundert Tropfen erzeugt werden kann und für viele Tage gemessen werden kann. Für die Messung wurde der Analysator mit einer flexiblen Fluoreszenzoptik ausgestattet um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe oder Molekühle detektieren zu können. Mehrere Experimente wurden durchgeführt, welche das Potentials des Gerätes zeigen. Einzelne Zellen des Pantoffeltierchen (Paramecium tetraurelia) konnten in einzelnen Tropfen eingeschlossen werden und mit einem metabolischen Farbstoffe ihre Stoffwechselaktivität gemessen werden. Ebenfalls wurden viele Experimente mit Pseudomonas fluorescens und E.coli YFP durchgeführt. Durch die flexible Fluoreszenzoptik konnte das Wachstum beider Arten in eine Experiment gemessen werden.

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eine Gerätes, welches die Überwachung von mehreren hundert Mikrobioreaktoren ermöglicht. Dabei sollte es, neben der Reduzierung von Kosten und Arbeitskraft, die konventionellen Pipettiermethoden in der zeitliche Auflösung übertreffen. Weiterhin soll es über eine Gradientenerzeugung verfügen, um sehr feine Variationen der Zusammensetzung des verwendeten Mediums zu ermöglichen. Dafür wurde ein Analysator für fluoreszierenden Tropfen (Fluorescent Droplet Analyser) entwickelt, mit dem ein segmentierter Fluss von mehreren hundert Tropfen erzeugt werden kann und für viele Tage gemessen werden kann. Für die Messung wurde der Analysator mit einer flexiblen Fluoreszenzoptik ausgestattet um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe oder Molekühle detektieren zu können. Mehrere Experimente wurden durchgeführt, welche das Potentials des Gerätes zeigen. Einzelne Zellen des Pantoffeltierchen (Paramecium tetraurelia) konnten in einzelnen Tropfen eingeschlossen werden und mit einem metabolischen Farbstoffe ihre Stoffwechselaktivität gemessen werden. Ebenfalls wurden viele Experimente mit Pseudomonas fluorescens und E.coli YFP durchgeführt. Durch die flexible Fluoreszenzoptik konnte das Wachstum beider Arten in eine Experiment gemessen werden.:1 Introduction 1 1.1 Motivation 1 1.2 Scope of this thesis 2 1.3 State of the art 3 2 Fundamentals 2.1 Millifluidics vs. microfluidics 5 2.1.1 Droplet based microfluidics 6 2.1.2 Surfactant in droplet-based millifluidics 7 2.2 The model of microorganism growth 8 2.3 The fluorescence based detection 9 3 Materials & Methods 3.1 The culture of the microorganisms and preparation 11 3.1.1 The Paramecium tetraurelia 11 3.1.2 Pseudomonas fluorescens 12 3.1.3 Escherichia coli 12 3.1.4 The bacteria culture 13 3.2 The Poisson distribution . 15 3.3 The composition of the emulsion 16 3.4 The fluidic components 17 3.5 Modules of the Fluorescent Droplet Analyser 18 3.5.1 The optocoupled relay card 18 3.5.2 The used fluidic pumps 19 3.5.3 The photonic elements of the FDA 19 3.5.4 The light sources 21 3.5.5 The optical fibres 23 3.5.6 The used detectors 23 3.6 The operating Software 24 4 The Fluorescent Droplet Analyser 4.1 The fluidic network for droplet generation and shuttling 26 4.1.1 Generation of a droplet sequence 28 4.1.2 Measuring a droplet sequence 30 4.2 The electric schematics of the FDA 31 4.3 The light source, guidance, and detection 32 4.3.1 Preparation of the fibres 33 4.3.2 The detection setup 35 4.4 The developed LabView program for operating the FDA 37 4.4.1 The automated measurement process 40 4.4.2 The peak mode 41 4.4.3 The time mode 42 4.4.4 The combined mode 42 4.4.5 The dynamic threshold 42 4.5 The developed VI program for analysing the data of the FDA 44 4.6 Flow characteristics of the FDA 46 4.6.1 Basic flow characteristics 46 4.6.2 Characteristics for shuttling of a droplet sequence 47 4.6.3 Influence of the hydrodynamic resistance 48 5 Monitoring of Paramecium tetraurelia 5.1 Introduction 51 5.2 Generation of a droplet sequence for Paramecium tetraurelia 53 5.3 Metabolic dynamics in droplets 54 5.4 Ecotoxicity assays 58 6 Monitoring of bacteria 6.1 Introduction 63 6.2 Generation of a droplet sequence for the bacteria experiments 64 6.3 Cell number calibration of the FDA 65 6.4 Monitoring of the bacteria growth 68 6.5 Investigation of the of the fluorescence signal 70 6.6 One bacteria cell in a droplet 71 6.7 The determination of the minimum inhibitory concentration 74 6.8 Long-term monitoring 80 6.9 Sectioning of the droplet sequence 80 6.10 Multicolor fluorescence detection 83