Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-06-09T21:26:35Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kelly de Souza Fernandes - 2016: 2715711 bytes, checksum: a2c065301e1443bb424fa23c738e43d2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-06-10T13:24:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kelly de Souza Fernandes - 2016: 2715711 bytes, checksum: a2c065301e1443bb424fa23c738e43d2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-10T13:24:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kelly de Souza Fernandes - 2016: 2715711 bytes, checksum: a2c065301e1443bb424fa23c738e43d2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2016-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Miltefosine (MT) is a alkylphospholipid originally developed for treatment of breast cancer and other solid tumors. It is currently used in the treatment of leishmaniasis, an infectious parasitic disease caused by protozoa of the genus Leishmania, being the first oral drug adopted for this purpose. However, its mechanism of action remains unclear. Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy of a spin-labeled lipid (5-DOXIL stearate) and a thiol-specific spin label (4-maleimido-TEMPO) in the membrane of axenic amastigotes of L.(Leishmania) amazonensis and peritoneal macrophages from Balb/c mice showed that MT causes significant increase in membrane dynamics at similar concentrations that inhibit parasite growth or are cytotoxic to macrophage. Although these alterations can be detected using a spin-labeled lipid, our experimental results indicated that MT interacts predominantly with the protein component of the membrane. Using a method for the rapid incorporation of MT into the membrane, these effects were measured immediately after treatment. Cytotoxicity, estimated via microscopic counting of living and dead cells, indicated ~80% parasites and macrophages death at the concentration of MT at which EPR spectroscopy detected a significant change in membrane dynamics. Cell viability, analyzed using the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide tetrazolium) reduction assay, showed that 50% inhibitory concentration (IC50) of MT depends on the cell concentration used in the assay. This dependence was analyzed using a theoretical equation involving biophysical parameters such as the partition coefficient of watermembrane and MT concentrations on the membrane and in the aqueous medium. The data showed that cells more sensitive to MT are respectively: erythrocytes, Leishmania promastigotes and Leishmania amastigotes and macrophage. The IC50 value of MT for 4 x 107 parasites/mL was 24,35 M. For the same cell concentration, a significant alteration was detected in the membrane lipid fluidity of parasites to 15 M of MT. The EPR spectra of spinlabeled membrane-bound proteins were consistent with more expanded and solvent exposed protein conformations, suggesting a detergent-like action, with a possible formation of micelle-like structures around polypeptide chains. / A Miltefosina (MT) é um alquilfosfolipídio originalmente desenvolvido para o tratamento de câncer de mama e outros tumores sólidos. Atualmente é utilizada no tratamento da leishmaniose, uma doença infecto-parasitária causada pelo protozoário do gênero Leishmania, sendo o primeiro fármaco de uso oral aprovado para tal fim. No entanto, seu mecanismo de ação ainda é pouco conhecido. A espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) de um marcador de spin lipídico (5-DOXIL estearato) e outro específico de grupo tiol (4-maleimido-TEMPO) na membrana de amastigotas axênicas de L. (Leishmania) amazonensis e de macrófagos extraídos de peritônio de camundongos BALB/c, mostrou que a MT causa um aumento significativo na dinâmica destas membranas para concentrações similares àquelas que inibem o crescimento do parasito ou que são citotóxicas ao macrófago. Embora essas alterações possam ser detectadas usando um marcador de spin lipídico, nossos resultados experimentais indicaram que a MT interage predominantemente com a componente proteica da membrana. Utilizando um método para incorporação rápida da MT na membrana, esses efeitos foram medidos imediatamente após o tratamento. Ensaios de citotoxicidade, estimada via contagem microscópica de células vivas e mortas, indicaram que ~80% dos parasitos e dos macrófagos estão mortos na concentração de MT no qual a espectroscopia de RPE detectou uma mudança significativa na dinâmica da membrana. A viabilidade celular, quantificada pela redução do sal MTT ((3-4,5- Dimetiltiazol-2yl)-2,5 difenil brometo de tetrazolina), mostrou que a concentração de MT que inibe 50% da proliferação celular (IC50) depende da concentração celular usada no ensaio. Esta dependência foi analisada utilizando uma equação teórica envolvendo parâmetros biofísicos tais como o coeficiente de partição membrana-água e concentrações de MT na membrana e no meio aquoso. Os dados mostraram que as células mais sensíveis à MT são respectivamente: eritrócitos, formas promastigotas e amastigotas da Leishmania e macrófagos. O valor do IC50 da MT para 4 x 107 parasitos/mL foi de 24,35 M. Para esta mesma concentração de células, foi detectada uma alteração significativa na fluidez lipídica da membrana dos parasitos com 15 M de MT. Os espectros de RPE do marcador de spin ligados a proteínas da membrana foram consistentes com as conformações mais expandidas e dinâmicas das proteínas expostas no solvente, sugerindo uma ação semelhante à de detergente, com uma possível formação de estruturas tipo micelas em volta das cadeias polipeptídicas.

A RMN é uma das principais técnicas usadas no estudo de perfis metabólicos pois é uma técnica quantitativa, altamente reprodutível e não-seletiva. Desta forma, o objetivo desta tese foi a aplicação da RMN no estudo metabólico em diferentes processos biológicos. A primeira aplicação foi na análise do perfil metabolômico e metabonômico dos agentes causadores da leishmaniose. Para tal, foram analisados extratos celulares das espécies Leishmania major e Leishmania donovani e extratos destas espécies crescidas com os fármacos miltefosina e paromomicina. Os espectros de RMN de 1H foram analisados pelo programa ChenoMX e os espectros de RMN 2D pelo software TopSpin e as bases de dados HMDB e BMRB. Cerca de 50 metabólitos foram identificados, como a adenina, arginina, glutamina, glutamato, manose, isoleucina, leucina e tirosina. Técnicas quimiométricas como PCA, PLS-DA e heatmaps foram utilizadas para investigar os metabólitos responsáveis pela diferenciação das duas espécies bem como entre as culturas com e sem fármacos. O segundo estudo foi com o composto metilglioxal. A presença de metilglioxal em queijos contribui com o escurecimento e deterioração do sabor, mesmo em baixas temperaturas. Por esta razão, foram estudados os produtos da adição de metilglioxal em extrato de queijo parmesão e o comportamento de diferentes espécies de lactobacilos na presença e na ausência de metilglioxal em extrato de queijo parmesão. Os resultados permitiram um entendimento maior das reações envolvidas entre esta molécula e os componentes do queijo, o que ajudará encontrar alternativas para a resolução do problema e aumentar o tempo de prateleira do queijo. O terceiro estudo realizado foi sobre a produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica. O objetivo deste estudo foi modificar geneticamente uma espécie de lactobacilo para a produção de etanol e analisar a vinhaça de planta de etanol pós-fermentação com levedura. Os espectros de RMN de 1H e 1H-13C mostraram que as bactérias modificadas são eficientes na produção de etanol e que dois açucares foram erroneamente identificados por cromatografia como maltose e maltotriose quando na verdade eram trealose e arabinose.  Por meio destes destes estudos mostrou-se parte das inúmeras aplicações que a RMN tem na metabolômica e que existem diversas ferramentas estatísticas disponíveis para auxiliar no estudo metabolômico. / NMR is one of the main techniques used in metabolic profile studies because it is a quantitative, highly reproducible and non-selective technique. Thus, the aim of this thesis was the application of NMR in metabolic studies of different biological processes. The first application was the analysis of the metabolomic and metabonomic profile of the causative agents of leishmaniasis. Cell extracts of the species Leishmania major and Leishmania donovani and extracts of these species grown with miltefosine and paromomycin drugs were analyzed. 1H spectra were analyzed by ChenoMX software and 2D spectra by TopSpin software and HMDB and BMRB databases. About 50 metabolites were identified, such as adenine, arginine, glutamine, glutamate, mannose, isoleucine, leucine and tyrosine. Chemometric techniques were used to investigate the metabolites responsible for the differentiation of the two species and between cultures with and without drugs. The second study was with methylglyoxal molecule. The presence of methylglyoxal in cheese contributes to browning and deterioration of flavor, even at low temperatures. For this reason, products of the addition of methylglyoxal in Parmesan cheese extract and the behavior of different species of lactobacilli in the presence and absence of methylglyoxal in Parmesan cheese extract were studied. The results allowed a better understanding of the reactions involved between this molecule and the components of the cheese, which will help find alternatives to solve the problem and increase the shelf life of the cheese. The third study was about the production of ethanol from lignocellulosic biomass. The objective of this study was to genetically modify a lactobacillus species to produce ethanol and analyze the post-fermentation thin stillage. NMR spectra showed that the modified bacteria are efficient in production of ethanol and that two sugars were erroneously being identified by chromatography as maltose and maltotriose when they actually were trehalose and arabinose. These studies showed part of the numerous applications that NMR has in metabolomics and that there are several statistical tools available to assist in metabolomic studies.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-16T17:25:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInvitroEfeitos.pdf: 1226021 bytes, checksum: 04d04874e9e2a9c1dc6bb2c6529fdff8 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-10-24T12:47:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInvitroEfeitos.pdf: 1226021 bytes, checksum: 04d04874e9e2a9c1dc6bb2c6529fdff8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-24T12:47:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInvitroEfeitos.pdf: 1226021 bytes, checksum: 04d04874e9e2a9c1dc6bb2c6529fdff8 (MD5) Previous issue date: 2011 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A amebíase caracteriza-se como uma doença crônica, não inflamatória, afebril que envolve a parede do intestino grosso podendo invadir a mucosa intestinal e se disseminar para outros órgãos, principalmente o fígado. A infecção por Entamoeba histolytica é tratada pelo metronidazol, mas este apresenta efeitos colaterais, por isso buscam-se medicamentos mais eficazes e que não tragam nenhum efeito adverso ao paciente. Além disso, o teste de novos fármacos pode revelar importantes particularidades do parasito, tais como a descoberta de vias metabólicas ou mesmo possíveis diferenças em sua estrutura. No presente trabalho foi testado o efeito amebicida do metronidazol, da dinitroanilina orizalina, uma droga inibidora de microtúbulos, da aquilfosfocolina miltefosina, que inibe a síntese de fosfolipídios de membrana, e da droga hibrida TC95, que apresenta os grupos funcionais dinitroanilina e alquilfosfocolina. Realizou-se cultura com trofozoítos do protozoário, onde as drogas e o controle com os diluentes foram adicionados após 7 horas de cultivo. Foi feita a contagem dos trofozoítos viáveis após período de 12 horas da adição das drogas e do controle em intervalos de 12 a 60 horas. Após análise das curvas de crescimento, detectou-se que o TC95 foi a droga mais efetiva dos três tratamentos, a miltefosina obteve pouca inibição e a orizalina não foi efetiva. Isso se deve a maior suscetibilidade do parasito a danos de membrana, com pouca efetividade da inibição dos microtúbulos. / Amebiasis is characterized as a chronic, noninflammatory, afebrile which involves the colon wall and can invade the intestinal mucosa and spread to other organs, especially the liver. Entamoeba histolytica infection is treated with metronidazole, but this one presents side effects, so researches have been done to find more effective drugs with no adverse effects to the patient. In addition, testing new drugs may reveal important features of the parasite, such as the discovery of metabolic pathways or possible differences in their structure. In the present study, it was tested the amoebicidal effect of metronidazole, dinitroaniline oryzalin, a microtubule inhibitor, miltefosine, an alkylphosphocholine, that inhibits the membrane phospholipids syntesis, and TC95, a hybrid drug that presents the functional groups dinitroaniline and alkylphosphocholine. It was performed a culture with protozoan trophozoites, where the drugs and the control with diluents were added after 7 hours of culture. It was made a count of the viable trophozoites 12 hours after the addition of the drugs and the control at intervals of 12 to 60 hours. After analyzing the growth curves, it was found that the TC95 was the most effective drug of the three treatments, miltefosine had little inhibition and oryzalin was not effective. This is due to greater susceptibility of the parasite to membrane damage, with little effectiveness on microtubules inhibition.