Dysfunction of Mitochondrial Respiratory Chain in Rostral Ventrolateral Medulla During Experimental Endotoxemia Sepsis is a complex pathophysiologic state resulting from an exaggerated whole-body inflammatory response to infection or injury. Metabolic disturbances, abnormal regulation of blood flow and diminished utilization of oxygen at the cellular level may account for tissue damage and lead to multiple organ failure and death. As the primary site of cellular energy generation is the mitochondrion, it presents itself as an important target for the septic cascade. In this regard, the notion that bioenergetic failure due to mitochondrial dysfunction contributes to organ failure during sepsis has received attention. We established the low frequency fluctuations in the systemic arterial pressure signals are related to the sympathetic neurogenic vasomotor tone, and reflect the functional integrity of the brain stem. Their origin is subsequently traced to the premotor sympathetic neurons at the rostral ventrolateral medulla (RVLM), whose neuronal activity is intimately related to the ¡§life-and-death¡¨ process. Based on a rat model of experimental endotoxemia that provides continuous information on changes in neuronal activity in the RVLM, the present study was undertaken to evaluate whether changes in mitochondrial respiratory functions are associated with death arising from sepsis. We also evaluated the efficacy of a new water-soluble coenzyme Q10 (CoQ10, ubiquinone) formula in the protection against fatality during endotoxemia by microinjection into bilateral RVLM. Dysfunction of Mitochondrial Respiratory Chain in Rostral Ventrolateral Medulla During Experimental Endotoxemia in the Rat We investigated the functional changes in mitochondrial respiratory chain at the RVLM in an experimental model of endotoxemia that mimics systemic inflammatory response syndrome. Experiments were carried out in adult male Sprague-Dawley rats that were maintained under propofol anesthesia. Intravenous administration of E. coli lipopolysaccharide (LPS; 30 mg/kg) induced progressive hypotension, with death ensued within 4 hours. The sequence of cardiovascular events during this LPS-induced endotoxemia can be divided into a reduction (Phase I), followed by an augmentation (Phase II; ¡§pro-life¡¨ phase) and a secondary decrease (Phase III; ¡§pro-death¡¨ phase) in the power density of the vasomotor components (0-0.8 Hz) of systemic arterial pressure (SAP) signals. Enzyme assay revealed significant decrease of the activity of NADH cytochrome c reductase (Complex I+III) and cytochrome c oxidase (Complex IV) in the RVLM during all 3 phases of endotoxemia. On the other hand, the activity of succinate cytochrome c reductase (Complex II+III) remained unaltered. Neuroprotective Effects of Coenzyme Q10 at Rostral ventrolateral Medulla Against Fatality During Experimental Endotoxemia in the Rat CoQ10 is a highly mobile electron carrier in the mitochondrial respiratory chain that also acts as an antioxidant. We evaluated the neuroprotective efficacy of CoQ10 against fatality in an experimental model of endotoxemia, using a novel water-soluble formulation of this quinone derivative. In Sprague-Dawley rats maintained under propofol anesthesia, intravenous administration of E. coli LPS (30 mg/kg) induced experimental endotoxemia. Pretreatment by microinjection bilaterally of CoQ10 (1 or 2 mg) into RVLM significantly diminished mortality, prolonged survival time, and reduced the slope or magnitude of the LPS-induced hypotension. CoQ10 pretreatment also significantly prolonged the duration of Phase II endotoxemia and augmented the total power density of the vasomotor components of SAP signals in Phase II endotoxemia. The increase in superoxide anion production induced by LPS at the RVLM during Phases II and III endotoxemia was also significantly blunted. Conclusion The present study revealed that selective dysfunction of respiratory enzyme Complexes I and IV in the mitochondrial respiratory chain at the RVLM is closely associated with fatal endotoxemia. CoQ10 provides neuroprotection against fatality during endotoxemia by acting on the RVLM. We further found that a reduction in superoxide anion produced during endotoxemia at the RVLM may be one of the mechanisms that underlie the elicited neuroprotection of CoQ10. These findings therefore open a new direction for future development of therapeutic strategy in this critical, complicated and highly fatal condition known as sepsis.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(薬科学) / 甲第24555号 / 薬科博第172号 / 新制||薬科||19(附属図書館) / 京都大学大学院薬学研究科医薬創成情報科学専攻 / (主査)教授 大野 浩章, 教授 小野 正博, 教授 掛谷 秀昭 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Pharmaceutical Sciences / Kyoto University / DFAM

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Nigella sativa ou cumin noir est une plante et un condiment populaires. Les graines de N. sativa sont très utilisées en médecine traditionnelle des pays nord africains pour le traitement du diabète. Cependant, les mécanismes d'actions cellulaires et moléculaires via lesquels cette plante exerce son effet euglycémiant restent encore mal compris. Le but de notre étude est d'examiner l’effet de N. sativa sur la sécrétion d’insuline, le transport de glucose et sur les voies de signalisation impliquées dans l’homéostasie et le métabolisme de glucose, en utilisant des essais biologiques sur des cultures cellulaires murines (cellules β pancréatiques βTC, myoblastes C2C12, hépatocytes H4IIE et adipocytes 3T3-L1) et des études in vivo chez le rat normoglycémique et le Meriones shawi (rongeur) diabétique. Chez les cellules β pancréatiques, N. sativa a augmenté leur prolifération ainsi que la sécrétion basale et gluco-stimulée de l’insuline. N. sativa a augmenté aussi la prise de glucose de 50% chez les cellules musculaires alors que chez les cellules graisseuses, la prise de glucose est augmentée jusqu’au 400%. Les expériences d’immunobuvardage de type western ont montré que N. sativa stimule les voies de signalisation de l’insuline (Akt et ERKs) et aussi celle insulino-indépendante (AMPK) chez les cellules C2C12. Par contre, chez les 3T3-L1, l’augmentation de transport de glucose est plutôt reliée à une activation de la voie de peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ). Chez les hépatocytes, N. sativa augmente la stimulation des protéines intracellulaires Akt et 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK). Cette activation de l’AMPK est associée à un effet découpleur de la plante au niveau de la phosphorylation oxydative mitochondriale. Par ailleurs, chez les Meriones shawi diabétiques, N. sativa diminue graduellement la glycémie à jeun ainsi que la réponse glycémique (AUC) à une charge orale en glucose (OGTT) pour atteindre des valeurs semblables aux animaux témoins après quatre semaines de traitement. Une amélioration du profile lipidique est observée autant chez les Meriones shawi diabétiques que chez les rats normaux. Au niveau moléculaire, N. sativa augmente le contenu musculaire en glucose transporter 4 Glut4 et la phosphorylation de l’acetyl-coenzyme A carboxylase ACC dans le muscle soléaire et le foie chez les Mériones shawi diabétiques. Par contre, chez le rat normal, on assiste à une stimulation des voies de signalisation de l’insuline (Akt et ERK) au niveau hépatique. En conclusion, nous avons confirmé l’action insulinotropique de N. sativa au niveau des cellules β pancréatiques et mis en évidence un effet proliférateur pouvant potentiellement s’avérer utile pour contrecarrer la perte de masse cellulaire observée chez les diabétiques. Notre étude a également mis en évidence pour la première fois que N. sativa exerce son activité antidiabétique par une combinaison d’effets insulino-mimétiques et insulino-sensibilisateurs directs permettant ainsi d’augmenter le transport de glucose des tissus périphériques. Cette action de N. sativa est liée à une stimulation des voies de signalisation intracellulaires insulinodépendantes et -indépendantes (AMPK) chez le muscle squelettique et le foie alors qu’elle passe par la voie des PPARγ au niveau du tissu adipeux. Finalement, l’étude in vivo vient confirmer l’effet antidiabétique de N. sativa. Notre apport novateur se situe au niveau de la démonstration que l’activité antidiabétique de N. sativa chez le Meriones shawi diabétique est la résultante des mêmes activités que celles déterminées au niveau de l’étude in vitro. En effet, N. sativa active la voie de l’AMPK, améliore la sensibilité à l’insuline et augmente l’insulinémie. Notre étude montre aussi que N. sativa possède une activité antilipidémiante. Ces résultats confirment le bien-fondé de l'utilisation ethnopharmacologique de N. sativa comme traitement du diabète et des perturbations du métabolisme lipidique qui y sont associées. De plus, les actions pléiotropiques de N. sativa en font un traitement alternatif ou complémentaire du diabète très prometteur qui encouragent à présent la tenue d’études cliniques de bonne qualité. / Nigella sativa or black cumin is a medicinal plant and a popular condiment. The seeds of N. sativa are widely used in the traditional medicine of North African countries for the treatment of diabetes. However, the cellular and molecular mechanisms of action through which the plant exerts its hypoglycemic effect remain unclear. The aim of our study is to determine the effect of N. sativa on insulin secretion, glucose transport and signaling pathways involved in the regulation of glucose homeostasis and metabolism. We carried out in vitro murine cell-based bioassays (βTC pancreatic β cells, C2C12 myoblasts, H4IIE hepatocytes and 3T3-L1 adipocytes) and in vivo studies in normoglycemic rats and diabetic Meriones shawi (rodent). In pancreatic β cells, N. sativa increased cell proliferation as well as basal and glucose stimulated insulin secretion. It also enhanced glucose uptake in muscle cells by 50%. Moreover, the increase of glucose uptake in fat cells reached levels up to 400%. The experiments using Western immunoblot analysis showed that N. sativa stimulated insulin-dependent (Akt and ERK) as well as -independent (AMPK) pathways in C2C12 cells. In 3T3-L1 cells, the increase of glucose uptake was attributed to the activation of the peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ) pathway. Similarly to C2C12 cells, N. sativa activated Akt and 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) in hepatocytes. This activation of AMPK was associated with an uncoupling effect on mitochondrial oxidative phosphorylation. In diabetic Meriones, N. sativa gradually decreased fasting blood glucose and the glycemic response to an oral glucose load (OGTT) to values similar to normal animals at the end of treatment. Improved lipid profile is observed in both animal models. At the molecular level, N. sativa increased muscle glucose transporter 4 (Glut4) content and acetyl-coenzyme A carboxylase (ACC) phosphorylation in soleus muscle and liver in diabetic Meriones shawi. In normal rats, the plant extract induced a stimulation of insulin signaling pathways (Akt and ERK) in the liver. In conclusion, N. sativa has an insulinotropic effect on pancreatic β cells. Our study has revealed for the first time that N. sativa exerts its antidiabetic activity by a combination of insulino-mimetic and insulin-sensitizing effects, thereby increasing glucose uptake in peripheral tissues. This effect of N. sativa is linked to the stimulation of insulin-dependent and -independent (AMPK) pathway in skeletal muscle and liver, while in adipose tissue, the effect was attributed to the activation of PPARγ. Finally, the in vivo study confirms the antidiabetic and antihyperlipidemic effects of N. sativa. Our original contribution lies in the demonstration that the in vivo antidiabetic action of N. sativa is exerted though the same mechanisms identified by our in vitro studies. These data support the soundness of the ethnobotanical use of this plant for the treatment of diabetes and its associated dyslipidemia. Moreover, the pleiotropic actions of N. sativa make it a very promising alternative or complementary treatment for diabetes, which calls for immediate high quality clinical trials.

Nigella sativa ou cumin noir est une plante et un condiment populaires. Les graines de N. sativa sont très utilisées en médecine traditionnelle des pays nord africains pour le traitement du diabète. Cependant, les mécanismes d'actions cellulaires et moléculaires via lesquels cette plante exerce son effet euglycémiant restent encore mal compris. Le but de notre étude est d'examiner l’effet de N. sativa sur la sécrétion d’insuline, le transport de glucose et sur les voies de signalisation impliquées dans l’homéostasie et le métabolisme de glucose, en utilisant des essais biologiques sur des cultures cellulaires murines (cellules β pancréatiques βTC, myoblastes C2C12, hépatocytes H4IIE et adipocytes 3T3-L1) et des études in vivo chez le rat normoglycémique et le Meriones shawi (rongeur) diabétique. Chez les cellules β pancréatiques, N. sativa a augmenté leur prolifération ainsi que la sécrétion basale et gluco-stimulée de l’insuline. N. sativa a augmenté aussi la prise de glucose de 50% chez les cellules musculaires alors que chez les cellules graisseuses, la prise de glucose est augmentée jusqu’au 400%. Les expériences d’immunobuvardage de type western ont montré que N. sativa stimule les voies de signalisation de l’insuline (Akt et ERKs) et aussi celle insulino-indépendante (AMPK) chez les cellules C2C12. Par contre, chez les 3T3-L1, l’augmentation de transport de glucose est plutôt reliée à une activation de la voie de peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ). Chez les hépatocytes, N. sativa augmente la stimulation des protéines intracellulaires Akt et 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK). Cette activation de l’AMPK est associée à un effet découpleur de la plante au niveau de la phosphorylation oxydative mitochondriale. Par ailleurs, chez les Meriones shawi diabétiques, N. sativa diminue graduellement la glycémie à jeun ainsi que la réponse glycémique (AUC) à une charge orale en glucose (OGTT) pour atteindre des valeurs semblables aux animaux témoins après quatre semaines de traitement. Une amélioration du profile lipidique est observée autant chez les Meriones shawi diabétiques que chez les rats normaux. Au niveau moléculaire, N. sativa augmente le contenu musculaire en glucose transporter 4 Glut4 et la phosphorylation de l’acetyl-coenzyme A carboxylase ACC dans le muscle soléaire et le foie chez les Mériones shawi diabétiques. Par contre, chez le rat normal, on assiste à une stimulation des voies de signalisation de l’insuline (Akt et ERK) au niveau hépatique. En conclusion, nous avons confirmé l’action insulinotropique de N. sativa au niveau des cellules β pancréatiques et mis en évidence un effet proliférateur pouvant potentiellement s’avérer utile pour contrecarrer la perte de masse cellulaire observée chez les diabétiques. Notre étude a également mis en évidence pour la première fois que N. sativa exerce son activité antidiabétique par une combinaison d’effets insulino-mimétiques et insulino-sensibilisateurs directs permettant ainsi d’augmenter le transport de glucose des tissus périphériques. Cette action de N. sativa est liée à une stimulation des voies de signalisation intracellulaires insulinodépendantes et -indépendantes (AMPK) chez le muscle squelettique et le foie alors qu’elle passe par la voie des PPARγ au niveau du tissu adipeux. Finalement, l’étude in vivo vient confirmer l’effet antidiabétique de N. sativa. Notre apport novateur se situe au niveau de la démonstration que l’activité antidiabétique de N. sativa chez le Meriones shawi diabétique est la résultante des mêmes activités que celles déterminées au niveau de l’étude in vitro. En effet, N. sativa active la voie de l’AMPK, améliore la sensibilité à l’insuline et augmente l’insulinémie. Notre étude montre aussi que N. sativa possède une activité antilipidémiante. Ces résultats confirment le bien-fondé de l'utilisation ethnopharmacologique de N. sativa comme traitement du diabète et des perturbations du métabolisme lipidique qui y sont associées. De plus, les actions pléiotropiques de N. sativa en font un traitement alternatif ou complémentaire du diabète très prometteur qui encouragent à présent la tenue d’études cliniques de bonne qualité. / Nigella sativa or black cumin is a medicinal plant and a popular condiment. The seeds of N. sativa are widely used in the traditional medicine of North African countries for the treatment of diabetes. However, the cellular and molecular mechanisms of action through which the plant exerts its hypoglycemic effect remain unclear. The aim of our study is to determine the effect of N. sativa on insulin secretion, glucose transport and signaling pathways involved in the regulation of glucose homeostasis and metabolism. We carried out in vitro murine cell-based bioassays (βTC pancreatic β cells, C2C12 myoblasts, H4IIE hepatocytes and 3T3-L1 adipocytes) and in vivo studies in normoglycemic rats and diabetic Meriones shawi (rodent). In pancreatic β cells, N. sativa increased cell proliferation as well as basal and glucose stimulated insulin secretion. It also enhanced glucose uptake in muscle cells by 50%. Moreover, the increase of glucose uptake in fat cells reached levels up to 400%. The experiments using Western immunoblot analysis showed that N. sativa stimulated insulin-dependent (Akt and ERK) as well as -independent (AMPK) pathways in C2C12 cells. In 3T3-L1 cells, the increase of glucose uptake was attributed to the activation of the peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ) pathway. Similarly to C2C12 cells, N. sativa activated Akt and 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) in hepatocytes. This activation of AMPK was associated with an uncoupling effect on mitochondrial oxidative phosphorylation. In diabetic Meriones, N. sativa gradually decreased fasting blood glucose and the glycemic response to an oral glucose load (OGTT) to values similar to normal animals at the end of treatment. Improved lipid profile is observed in both animal models. At the molecular level, N. sativa increased muscle glucose transporter 4 (Glut4) content and acetyl-coenzyme A carboxylase (ACC) phosphorylation in soleus muscle and liver in diabetic Meriones shawi. In normal rats, the plant extract induced a stimulation of insulin signaling pathways (Akt and ERK) in the liver. In conclusion, N. sativa has an insulinotropic effect on pancreatic β cells. Our study has revealed for the first time that N. sativa exerts its antidiabetic activity by a combination of insulino-mimetic and insulin-sensitizing effects, thereby increasing glucose uptake in peripheral tissues. This effect of N. sativa is linked to the stimulation of insulin-dependent and -independent (AMPK) pathway in skeletal muscle and liver, while in adipose tissue, the effect was attributed to the activation of PPARγ. Finally, the in vivo study confirms the antidiabetic and antihyperlipidemic effects of N. sativa. Our original contribution lies in the demonstration that the in vivo antidiabetic action of N. sativa is exerted though the same mechanisms identified by our in vitro studies. These data support the soundness of the ethnobotanical use of this plant for the treatment of diabetes and its associated dyslipidemia. Moreover, the pleiotropic actions of N. sativa make it a very promising alternative or complementary treatment for diabetes, which calls for immediate high quality clinical trials.