La migration cellulaire est un mécanisme important pour divers processus cellulaires tels que l’embryogenèse et la cicatrisation. De même, elle participe à des processus pathologiques notamment l’invasion des cellules malignes et la formation des métastases cancéreux. La dissémination métastatique est un processus très compliqué. L’acquisition du pouvoir migratoire invasif par la cellule maligne ainsi que son potentiel métastatique est gérée par le cytosquelette qui est dynamiquement modifié et contrôlé par des voies de signalisation intracellulaires. Cependant, la physiologie des cellules métastatiques et les cascades de signalisation qui les poussent à métastaser ne sont toujours pas comprises. Les protéines Ezrine, Radixine et Moésine (ERMs) jouent un rôle important dans l’organisation du cytosquelette au cortex cellulaire et elles sont des déterminantes clés de la migration cellulaire. Ainsi, une dérégulation à ce niveau peut conduire à une migration cellulaire aberrante. D’où l’implication des ERMs dans différents cancers agressifs et invasifs. Les ERMs sont régulées en aval de plusieurs acteurs cellulaires notamment les récepteurs membranaires. Plusieurs études ont rapporté que le récepteur au thromboxane A2 (RTXA2), un récepteur couplé à la protéine G (RCPG) favorise les métastases. Il a été décrit surtout dans le cadre de cancer du sein triple négatif (CSTN), l’un des cancers les plus mortels chez la femme. Les RCPG possèdent un rôle central dans presque toutes les fonctions physiologiques et constituent la plus grande famille des cibles médicamenteuses. D’une manière intéressante, les deux laboratoires de Dr Sébastien Carréno et Dr Michel Bouvier, ont découvert que le RTXA2 active les protéines ERMs à travers la GTPase RhoA. Dans ce projet de recherche on a identifié une nouvelle voie de signalisation liant le RTXA2 aux ERMs à travers la GTPase RhoA et la kinase SLK. Cette voie est impliquée dans la migration des cellules de cancer du sein triple négatif. Ainsi, on a pu démontrer que la moésine et la kinase SLK agissaient en aval du récepteur étudié pour favoriser la vitesse et la directionnalité de la migration des cellules de CSTN. 6 On a montré que la migration cellulaire dirigée en aval du RTXA2 est due à une polarité de la moésine au front de la migration. On a constaté aussi que la moésine est responsable d’une polarité des filaments d’actine au front de la migration suite à une activation du récepteur. Ce travail a mis en évidence une nouvelle cascade de signalisation importante pour la migration des cellules cancéreuses agressives triples négatives du sein ce que pourrait être une nouvelle cible des thérapies anti-métastatiques. / Cell migration is an important mechanism for various cellular processes such as embryogenesis and cicatrization. Likewise, it controls pathological processes including the invasion of malignant cells and the formation of metastases. Metastasis is a very complicated process. The acquisition of invasive migratory power by a malignant cell as well as its metastatic potential is regulated by the cytoskeleton which is dynamically modified and controlled by intracellular signaling pathways. However, metastatic cells physiology and the cascades causing their metastases are not clear yet. Ezrin, Radixin and Moesin (ERMs) proteins have an important role in organizing the cytoskeleton at the cell cortex and they are key determinants of cell motility. Thus, a deregulation at this point may lead to an aberrant cell migration. Hence, the involvement of ERMs in various aggressive and invasive cancers. ERMs are regulated downstream of several cellular actors in particular membrane receptors. Several studies have reported that the thromboxane A2 receptor (TXA2R), a G protein coupled receptor (GPCR) promotes metastasis. It has been described especially in the context of triple negative breast cancer (TNBC), one of the deadliest cancers in women. GPCR have a central role in almost all physiological functions and constitute the largest family of drug targets. Interestingly, the two laboratories of Dr Sébastien Carréno and Dr Michel Bouvier, have discovered that the TXA2R activates ERM proteins through the GTPase RhoA. In this research project, we have identified a new signaling pathway linking the TXA2 receptor to ERMs via RhoA and the kinase SLK. This pathway is involved in the migration of triple negative breast cancer cells. Thus, we demonstrated that moesin and SLK acted downstream of the receptor to promote the speed and directionality of TNBC cells migration. We discovered that the directed cell migration downstream of TXA2R is due to a polarization of moesin at the leading edge. We also observed that moesin is responsible for actin filaments polarity at the leading edge following an activation of the receptor. So, this work has revealed a new signaling cascade important for the migration of aggressive triple negative breast cancer cells which could be a new target for anti-metastatic therapies.

Les protéines ERMs (Ezrine, radixine et moésine) jouent un rôle central in cellulo, dans de nombreux processus cellulaires tels que les infections, la migration et la division cellulaire. Parmi celles-ci, la moésine est plus particulièrement impliquée dans la formation de la synapse immunologique, l’infection virale et bactérienne, et les métastases cancéreuses. D’un point de vue structural, les ERM peuvent être en conformation inactive (replies sur elles-mêmes) ou actives (ouvertes), ce qui permet leur interaction a la fois avec les constituants du cytosquelette (actine et tubuline) via leur domaine C-terminal et la membrane plasmique via leur domaine FERM. La liaison a la membrane plasmique se fait principalement et spécifiquement via un lipide de la famille des phosphoinositides, le phosphatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2). De plus, les protéines peuvent être phosphorylées, ce qui contribue à leur ouverture structurale. Cependant, le rôle de la phosphorylation sur les interactions ERM/membrane et ERM/cytosquelette, bien que beaucoup étudié in cellulo, est peu compris au niveau moléculaire.Le but de cette thèse est précisément d’étudier, au niveau moléculaire et à l’aide de systèmes biomimétiques, les interactions entre des protéines recombinantes et des membranes biomimétiques contenant du PIP2. Pour cela, nous avons mis au point des membranes lipidiques sous forme de vésicules unilamellaires (petites ou larges) et de bicouches lipidiques supportées, qui permettent de caractériser les interactions entre protéines et membranes par des techniques biophysiques complémentaires, notamment la cosédimentation quantitative, la microscopie et spectroscopie de fluorescence, et la microbalance à cristal de quartz. Dans une première partie, nous avons étudié le rôle de la double phosphorylation de la moésine (réalisée par mutation sur site spécifique) sur les interactions moésine/membrane biomimétique, en comparaison de la protéine sauvage, les protéines recombinantes et les mutants ayant été produites et purifiées au laboratoire.Nos résultats mettent en évidence une interaction spécifique et coopérative pour le double mutant phosphomimétique alors que cette interaction est simple dans le cas de la protéine sauvage. Dans une seconde partie, nous avons employé les bicouches lipidiques supportées contenant le PIP2 pour étudier les mécanismes molécules d’adsorption de la protéine virale Gag et de ses mutants. Les méthodologies développées dans ce travail de thèse ouvrent des perspectives en biophysique moléculaires car elles sont facilement transposables à l’étude d’autres protéines sur des membranes lipidiques modèles contenant des phosphoinositides.Mots clés: Ezrine-Radixine-Moésine, phosphoinositides, PIP2, interactions protéine-lipide, membrane lipidique biomimétique, protéine virale Gag, cytosquelette. / ERM (ezrin, radixin, moesin) proteins play a central role in cellulo in a large number of physiological and pathological processes, including cell infection, migration and cell division. Among the ERMs, moesin is particularly involved in the formation of the immunological synapse, viral and bacterial infection, and cancer metastasis. From a structural point of view, ERMs can be in inactive (closed) conformation or active (open), which enable them to interact on one side with the cytoskeleton (actin and tubulin) via their C-terminal domain and on the other side with the plasma membrane via their FERM domain. Binding to the plasma membrane is mediated via a specific lipid of the phosphoinositide family, the phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate (PIP2). In addition, ERM can be phosphorylated, which contribute to their structural opening. To date, the role of the phosphorylation in ERM/membrane and ERM/cytoskeleton interactions, although widely studied in cellulo, remains poorly understood at the molecular level.The aim of this PhD thesis is precisely to study, at the molecular level and using biomimetic systems, interactions between recombinant proteins and biomimetic membranes containing PIP2. To this end, we have engineered lipid membranes in the form of large and small unilamellar vesicles and supported lipid bilayers. These biomimetic membranes are used to characterize interactions between proteins and membranes by complementary biophysical techniques, notably quantitative cosedimentation, fluorescence microscopy and spectroscopy, and quartz crystal microbalance with dissipation monitoring. In a first part, we studied the role of double phosphorylation on moesin, achieved via a site-specific mutation on threonine residues, on moesin/biomimetic membrane interactions, in comparison to the wild type protein. The recombinant proteins and mutants were produced in our laboratory.Our results show that there is a specific and cooperative interaction for the double phosphomimetic mutant while interactions is 1:1 in the case of the wild type protein. In a second part, we used supported lipid bilayers containing PIP2 to study the molecular adsorption mechanism of the viral protein Gag and of its mutants. The methodologies that were developed in this work open perspectives in molecular biophysics since they are easily adaptable to other proteins on model lipid membranes containing phosphoinositidesKeywords: Ezrin-Radixin-Moesin, phosphoinositides, PIP2, protein/lipid interactions, biomimetic lipid membrane, Gag viral protein, cytoskeleton.