Le cancer de l'ovaire est la première cause de décès par cancer gynécologique. Cette thèse avait pour objectif la prospection de nouvelles solutions thérapeutiques fondées sur la délivrance prolongée d'agents anti tumoraux à l'aide de systèmes macromoléculaires de synthèse. L'un des obstacles majeurs était la disposition d'un modèle de tumeur pertinent chez l'animal. Après un examen bibliographique des connaissances acquises, le deuxième chapitre examine le potentiel d'un panel de xénogreffes dérivées de tumeurs ovariennes humaines directement greffées chez la souris immunodéprimée. Il est montré que les principales caractéristiques phénotypiques et moléculaires des tumeurs originales sont maintenues au niveau des greffes. Les résultats traduisent la présence d'une hétérogénéité intra-tumorale et d'une oligoclonalité au niveau des tumeurs primaires. L'ensemble confirme l'importance du choix du modèle tumoral pour l'évaluation de nouveaux traitements et l'étude des mécanismes aboutissant aux rechutes de la maladie et au développement d'une chimiorésistance. Un troisième chapitre traite l'exemple d'un système de délivrance prolongée fondé sur le couplage d'un agent antitumoral modèle, la doxorubicine, associé de diverses manières à un vecteur macromoléculaire biorésorbable, le poly(L-lysine citramide). Le premier conjugué obtenu par couplage direct sur le vecteur étant trop stable, divers systèmes ont été conçus pour obtenir la libération souhaitée. L'utilisation d'un bras espaceur clivable de type ester-hydrazone a fourni le meilleur résultat. Pour pallier la complexité de ces conjugués, une stratégie innovante fondée sur le piégeage de la doxorubicine dans une gélatine artificielle à base de poly(N-acryloyl glycinamide) est prospectée qui devrait permettre l'utilisation simultanée de plusieurs principes actifs piégés temporairement par voie physique dans un gel adhésif et fournir des solutions mieux adaptées aux contraintes cliniques des traitements intrapéritonéaux. / Ovarian carcinoma is the most lethal gynecologic malignancy. The aim of this PhD thesis was to develop new therapeutic approaches based on novel synthetic macromolecular drug delivery systems for intraperitoneal chemotherapy. These objectives were limited by the requirement of reliable tumor models for experimental studies. After a concise review of knowledge published in the literature, the potential interest of the establishment of a collection of tumor grafts derived from samples of human tumors is examined in a second chapter. Data show that the major phenotypic and genotypic features of the original tumors are maintained in the xenografts. They also confirm the importance of this tumor model to test new drugs and to analyze intratumoral heterogeneity and oligoclonality in primary ovarian carcinoma. The collection will be also helpful to study the mechanisms leading to disease recurrences and resistance to chemotherapies. An example of drug delivery system based on the different associations of a model chemotherapeutic drug (doxorubicin) with a bioresorbable macromolecular vector, namely poly(L-lysine citramide), is addressed in a third chapter. Direct amid linkage in the first conjugate was too stable with respect to antitumoral cytotoxicity desired after in vivo administration and different systems were generated subsequently to increase drug release in tumor deposits. The best results were obtained with a hydrazone cleavable spacer containing an ester group. To overcome the complexity of these conjugates, a novel strategy based on doxorubicin entrapment in a synthetic gelatin made of (poly(N-acryloyl glycinamide) is developed. This strategy should allow physical temporary entrapment of different drug molecules in a adhesive gel and could provide new solutions to the therapeutic challenges of intraperitoneal administration.

Le glioblastome (GBM) est une tumeur maligne du cerveau très agressive et actuellement incurable. Après le traitement standard, le GBM récidive toujours à cause de son caractère invasif et de sa résistance aux agents chimiothérapeutiques alkylants. Dans cette thèse, nous avons évalué la faisabilité, l'efficacité et la tolérance de l’hydrogel « nanocapsules lipidiques chargées en Lauroyl-gemcitabine » (GemC12-LNC) pour le traitement local du GBM. GemC12-LNC a été préparé par un procédé d'inversion de phase. Il est injectable, adapté à l'implantation cérébrale et capable de libérer de façon prolongée le médicament in vitro. Chez les souris saines, aucune inflammation, apoptose ou activation de la microglie n’a été observée après exposition à l'hydrogel, ce qui suggère que ce système est bien toléré. L'injection intra-tumorale de GemC12-LNC dans un modèle de GBM U87 sous-cutané et orthotopique a réduit de façon significative la croissance tumorale et a augmenté la survie médiane de l'animal par rapport aux contrôles, respectivement. De plus, en vue d’une meilleure relevance clinique, une technique de résection tumorale reproductible du GBM U87 et du gliosarcome 9L a été mise au point et l'hydrogel GemC12-LNC a réduit les récidives chez les souris et les rats, respectivement. En conclusion, l'efficacité et la tolérance de l’hydrogel GemC12-LNC ont été démontrées in vitro et in vivo. Cette formulation simple peut être injectée directement dans la cavité de résection du GBM, et combine les propriétés avantageuses des nanomédecines et des hydrogels. GemC12-LNC peut donc être considéré comme un système d'administration prometteur et innovant pour le traitement local du GBM. / Glioblastoma (GBM) is an aggressive malignant brain tumor characterized by rapid proliferation and propensity to infiltrate healthy brain tissue. Despite aggressive standard of care therapy GBM always recur, mainly because of its high invasiveness and chemoresistance to alkylating drugs. In this Thesis, we evaluate the feasibility, efficacy and safety of the nanomedicine hydrogel Lauroyl-gemcitabine lipid nanocapsule (GemC12-LNC) for the local treatment of GBM. GemC12-LNC was prepared by a phase-inversion technique process. It is injectable, adapted for brain implantation and able to sustainably release the drug in vitro. In healthy mice brain, no inflammation, apoptosis or microglia activation was observed after exposure to the hydrogel suggesting that this system is well tolerated and suitable for an application in the brain. Intratumoral injection of GemC12-LNC hydrogel in a U87subcutaneous and orthotopic GBM model significantly reduced tumor growth and increased the animal’s median survival compared to the controls, respectively. Moreover, to mimic the clinical setting, a reproducible tumor resection technique of U87 GBM and 9L gliosarcoma was developed and the GemC12-LNC hydrogel slowed down the formation of recurrences in mice and rats brain, respectively. In conclusion, the feasibility efficacy and safety of GemC12-LNC have been shown in vitro and in several preclinical in vivo models showing that this nanomedicine hydrogel is a promising and innovative delivery system for the local treatment of GBM. This gel can be directly injected in the GBM resection cavity, has a very simple formulation and combines the properties of nanomedicines and hydrogels.

En raison du manque d'efficacité et de la toxicité des thérapies conventionnelles contre le cancer, la recherche s'est concentrée sur le développement de nouvelles stratégies. Ces efforts ont été à l'origine de l'essor de l'immunothérapie, dont les acteurs les plus récents sont les anticorps monoclonaux ciblant les points de contrôles immunitaires (PCI). Parmi ces inhibiteurs des PCI, on retrouve les anticorps ciblant la protéine de surface « Programmed Cell Death 1 », les anti-PD1, et ceux ciblant son ligand, « Programmed Cell Death Ligand 1 », les anti-PDL-1. Ces anticorps ont démontré une efficacité spectaculaire dans plusieurs types de cancers, et sont aujourd'hui couramment utilisés en clinique comme thérapies dans le mélanome, le cancer du poumon, de la vessie et du rein. Cependant, ces traitements ne profitent pas à tous les patients atteints de cancer, avec en moyenne 60% de résistance innée, et 25% de résistance acquise après une réponse primaire aux anticorps, variable selon le type de tumeur. Les phénomènes impliqués dans la résistance sont à l'heure actuelle peu connus. Ainsi, l'objectif de mon projet de recherche consistait à établir des modèles in vivo de résistance acquise aux anti-PD1 et anti-PDL 1. Pour ce faire, nous avons utilisé des tumeurs syngéniques de rein (RENCA), de vessie (MB49 et MBT-2) et de colon (MC38) et des souris immunocompétentes, que nous avons rendues résistantes aux traitements en les soumettant à des séries de réimplantation de tumeurs et de traitements, induisant une pression de sélection jusqu'à l'obtention d'un phénotype résistant. Le succès du blocage de l'axe PD1/ PDL-1 étant fortement lié à l'état du microenvironnement tumoral, nous avons mis en place un protocole d'immunophénotypage. Nous avons ainsi pu observer les cellules au profil « anti-tumoral », telles que les cellules T, les Natural Killer, et les macrophages M1, mais également les cellules ayant une fonction immunosuppressive, telles que les macrophages M2, les MDSC, les Treg. Enfin, certaines études ayant identifié une sur-régulation des PCI inhibiteurs alternatifs dans les cas de résistance acquise à l'anti-PD1, nous avons également observé l'expression de LAG3, TIM3 et TIGIT en plus de l'expression de PD1 et PDL-1. Nous avons ainsi pu déterminer que la résistance semble très fortement dépendante du modèle tumoral, même si nous avons pu identifier une diminution des macrophages M1 anti-tumoraux dans l'ensemble des modèles résistants à l'anti- PD1, et une augmentation des Treg dans les modèles résistants à l'anti-PDL-1, suggérant un mécanisme commun de résistance propre respectivement à l'anti-PD1 et à l'anti-PDL-1. Suite à l'identification par Zaretsky et al. de gènes impliqués dans la voie interféron dans des cas de résistance acquise de mélanome traité à l'anti- PD1, nous avons également décidé d'étudier le profil moléculaire des tumeurs résistantes. Cela nous a permis d'identifier 5 gènes communs entre les modèles anti- PD1 et anti-PDL-1 résistants, dont SERPINF1 et FCNA qui semblent prometteurs comme cibles à valider. Enfin, en parallèle de l'établissement et de la caractérisation des modèles de résistance acquise, nous avons testé de nouvelles approches thérapeutiques de potentialisation des anticorps anti-PD1 et anti-PDL-1 en combinaison avec des chimiothérapies de référence pour le cancer étudié. Nous avons ainsi démontré une potentialisation dans les modèles sauvages de cancer du côlon MC38 et de la vessie MB49, aucun effet de la combinaison dans le modèle de cancer du sein métastatique 4T1, et une inhibition de l'effet de l'anti-PDL-1 avec la combinaison dans le modèle de vessie MBT-2. L'immunophénotypage nous a permis de constater ici aussi des différences très importantes entre les modèles tumoraux, au niveau basal et après traitement [etc...] / Because of the limited efficacy and the toxicity of conventional therapies to fight cancer, researchers focused on the new trategies. These efforts lead to the emergence of immunotherapies, whose msot recent actors are the monoclonal antibodies targeting immune checkpoint (ICP). Among those ICP inhibitors, we found antibodies targeting the surface protein « Programmed Cell Death 1 », called anti- PD1, and those targeting its ligand, « Programmed Cell Death Ligand 1 », called anti- PDL-1. Those antibodies shown a great efficacy in a wide diveristy of cancers, and are currently used for clinical practice in the case of melanoma, lung cancer, bladder cancer and renal cell carcinoma. However, those treatments don’t benefit to all tumor bearing patients, with a mean of 60% of innate resistance, and 25% of acquired resistance following a primary response, variable according to tumor type. Phenomena involved in resistance are currently poorly described. In this context, the aim of my project was to establish in vivo preclinical models of acquired resistance to anti-PD1 and anti-PDL-1. To do that, we used syngeneic renal cancer (RENCA), bladder cancer (MB49 and MBT-2), and colorectal cancer (MC38), and immunocompetent mice, that we have made resistant by serial reimplantations of tumors pieces and serial treatments, inducing a selection pressure until we obtained a resistant phenotype. The efficiency of PD1/PDL-1 axis blocking is strongly linked to the microenvironment composition, as a result we realized an immunophenotyping protocol. We observed anti-tumor cells as T cells, Natural Killer cells, and M1 macrophages, but also cells harboring immunosuppressive functions, as M2 macrophages, MDSC, and Treg. Moreover, some studies have identified an upregulation of alternatives ICP in the context of acquired resistance to anti-PD1, so we also observed the expression of LAG3, TIM3 and TIGIT besides PD1 and PDL-1 expression. We shown that resistance is strongly dependant to the tumor model, even if we identified a decrease of anti-tumor M1 macrophages is models resistant to anti-PD1, and an increase of Treg in models resistant to anti-PDL-1, suggesting a common mechanism of resistance specific to respectively anti PD1 and anti-PDL-1. Following Zaretsky and al. identification of genes involved in interferon pathway in the case of acquired resistance to anti-PD1 in melanoma, we decided to study the molecular profile of resistant tumors. We identified 5 common genes differently modulated between anti-PD1 and anti-PDL-1 resistant models, including SERPINF1 and FCNA which seems to be promising as targets to validate. Lastly, in parallel to establishment and characterization of preclinical models of acquired resistance, we tested new therapeutical approches of anti-PD1 and anti- PDL-1 potentiation in combination with reference chemotherapies. We shown a synergy in wild-type colorectal and bladder cancers (MC38 and MB49), no effect of the combination in metastatic breast cancer 4T1, and an inhibition of anti-PDL 1 effect in bladder cancer MBT-2. Immunphenotyping of tumors allowed us to observe here also high differences between tumor models, both at baseline and after treatments initiation. To conclude, even if our results need a validation with patients samples, we demonstrated that different cellular and molecular modifications could be involved in resistance to anti-PD1 and anti-PDL-1, and that resistance could be bypass with chemotherapy combination, according to tumor type

Les glioblastomes (GBs) sont les tumeurs primitives du SNC les plus agressives de l’adulte. Les causes d’échec thérapeutiques sont multiples, comme une résistance des cellules tumorales à l’apoptose, l’existence de cellules souches cancéreuses ou un microenvironnement pro-tumoral. La découverte de molécules thérapeutiques qui pourraient avoir une action pléiotrope est particulièrement attractive. Dans ce contexte nous nous sommes intéressés aux mimétiques de Smac (MS), antagonistes des inhibiteurs de l’apoptose (IAP), qui inhibent le plus souvent cIAP1, cIAP2, XIAP et ML-IAP. Nous avons recherché si les IAP pouvaient être des cibles thérapeutiques dans les GBs humains en étudiant leur expression et leurs valeurs pronostiques éventuelles : les IAP sont exprimés dans les GBs et ML-IAP est associé à un plus mauvais pronostic. Nous avons choisi d’utiliser pour la suite de nos expériences, un MS qui avait une action sur les IAP et en particulier ML-IAP : le GDC-0152. Le GDC-0152 induit l’apoptose in vitro, augmente la survie des souris porteuses de GB et ralentit la croissance tumorale in vivo. Ensuite nous avons recherché si l’effet du GDC-0152 pouvait être différent en fonction du taux d'oxygène. En effet, les GBs sont des tumeurs hypoxiques. Nous avons cultivé en normoxie et en hypoxie, quatre lignées de cellules souches de GBs. En normoxie, le GDC-0152 induit la différenciation des cellules souches (voie NF-κB) et en hypoxie il induit l’apoptose et diminue la prolifération cellulaire (voie ATR).Ces travaux soulignent l’importance du modèle préclinique utilisé dans la caractérisation de l'effet de nouvelles molécules et le potentiel thérapeutique des MS dans les GBs. / Glioblastomas (GBs) are the most aggressive primary brain tumors in adults. The causes of therapeutic failure are unknown and are multiples, such as tumor cell resistance to apoptosis, the presence of cancer stem cells or a pro-tumor microenvironment. Thus, the discovery of therapeutic molecules with pleiotropic action is particularly interesting. In this context, we are interested in smac mimetics (SM), antagonists of inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) and most often antagonize cIAP1, cIAP2, XIAP and ML-IAP.We investigated whether IAPs could be attractive therapeutic targets in human GBs by studying their expression and their possible prognostic values. All IAPs were expressed in various degrees in GBs and ML-IAP was associated with a worse prognosis. Therefore, we chose GDC-0152 for the rest of our experiments because it antagonizes the different IAPs and in particular ML-IAP. We showed that GDC-0152 induces apoptosis in vitro, increases the survival of GB-bearing mice and slows tumor growth in vivo.We investigated whether the effect of GDC-0152 could be different depending on the oxygen level. Indeed, GBs are part of the most hypoxic tumors. For this purpose, four GB stem cell lines were grown in normoxia and hypoxia. We found that GDC-0152 has an anti-tumor effect regardless of oxygen level, but the signaling pathways involved were different. In normoxia, GDC-0152 induces differentiation of GB stem cells (NF-κB pathway) and in hypoxia it induces apoptosis and decreases cell proliferation (ATR pathway).This work highlights the importance of the preclinical model used in the characterization of a new molecule effects and the therapeutic potential of SM in GBs.

L’adénocarcinome épithélial de l’ovaire (CEO) est le cancer gynécologique le plus mortel. La recherche de nouvelles thérapies repose principalement sur des modèles précliniques 2D et in vivo avec des lignées cellulaires (LC) pour générer les évidences nécessaires à l’initiation d’essais cliniques. Ce processus requiert des fonds substantiels en recherche/santé qui est associé à un taux d’attrition élevé laissant supposer des lacunes dans le modèle actuel. Nos publications antérieures suggèrent que la sensibilité in vitro de nos LC du CEO à la chimiothérapie carboplatin varie en 2D ou 3D. Il reste à élucider lequel de ces modèles est le plus représentatif de la réponse in vivo. De ce fait, nous avons émis l’hypothèse que le modèle 3D refléterait plus étroitement la sensibilité in vivo. L’objectif de cette étude était de caractériser la réponse au carboplatin de nos LC du CEO en monocouches et en sphéroïdes (3D), puis de les comparer à leur réponse in vivo (xénogreffes). Un total de 6 LC du CEO a été injecté dans des souris qui ont reçues trois différentes concentrations de carboplatin. Leurs réponses ont été évaluées/classées selon leurs mesures de volume tumoral et l’immunofluorescence. Ces mêmes LC ont été ensemencées dans des plaques à très faible adhérence pour former des sphéroïdes et les traiter. Des analyses de cytométrie en flux ont été effectuées afin de classer les LC selon leur concentration inhibitrice médiane (CI50). Nous avons comparé le tout aux résultats 2D (CI50) précédemment publiés. Nos résultats montrent que le système 3D démontre la meilleure concordance avec le modèle in vivo. Notamment, notre LC ultra-résistance en 2D devient plus sensible en modèle murin ou encore en 3D. Inversement, une LC ultra-sensible en 2D est plus résistante en xénogreffe et en sphéroïde. Les résultats découlant de notre étude sont importants à considérer lors d’investissement de temps et de fonds dans les études de criblage et de prédiction de réponses thérapeutiques. / Epithelial ovarian adenocarcinoma (EOC) is the most lethal gynecological cancer. The drug discovery pipeline is heavily based on preclinical models. Typically, 2D cell line (CL)-based models are used to screen compounds followed by validation in animal models to generate the evidence needed to design clinical trials. This process incurs a high cost to the research pipeline and still results in high drug attrition rates. This may in part reflect the poor translation of preclinical to clinical results and points to deficiencies in modeling. Previous work from our laboratory shows that the sensitivity of our EOC CLs to carboplatin therapy varies between 2D and 3D in vitro models, however it is unclear how these differences align with the in vivo response. We hypothesize that 3D models will more closely reflect therapeutic in vivo response. The objective of this study was to characterize the carboplatin sensitivity of EOC CLs in 2D and 3D-spheroids and compare them to in vivo response using mouse xenografts. We injected mice with 6 different EOC CLs that were treated with 3 different carboplatin concentrations. Tumor volume measurements and immunofluorescence viability stains were used to categorize CLs by their sensitivity. The same CLs were seeded in low attachment plates to form, and thereafter treat, spheroids. Flow cytometry analysis was used to classify CLs by their 50% inhibitory response (IC50). The 2D response (IC50) for these CLs has previously been published. Our results show that therapeutic response changes significantly for a single CL between different systems, and the 3D model was most concordant with the in vivo model. Our ultra-resistant CL in 2D became more sensitive in 3D/mouse models. In contrast, the highly 2D sensitive CL became more resistant in our xenograft/spheroid models. The results are important to consider when investing time/funds in drug screening and therapeutic response prediction studies.

Le rétinoblastome, un cancer pédiatrique de la rétine en développement, est la tumeur intraoculaire la plus fréquente chez l’enfant et représente environ 4 % de tous les cancers infantiles. Bien qu'il s'agisse d'une maladie rare, l'hôpital Curie (centre de référence pour le rétinoblastome en France) accueille environ 50 à 60 nouveaux patients chaque année. Notre groupe a précédemment caractérisé deux sous-types de rétinoblastomes. Les tumeurs de type « cone-like » ou sous-type 1 sont plutôt différenciées et homogènes, présentent une surexpression des gènes liés aux cellules cônes (photorécepteurs) de la rétine, sont diagnostiquées cliniquement plus tôt et regroupent la majorité des formes héréditaires et bilatérales. Les tumeurs « mixed-type » ou sous-type 2, présentent une hétérogénéité intra-tumorale et une surexpression des gènes liés aux cellules des cônes et des cellules ganglionnaires de la rétine, sont enrichies en patients unilatéraux qui sont diagnostiqués cliniquement à des âges plus avancés. Nous avons caractérisé le paysage moléculaire et génomique de 102 rétinoblastomes provenant de trois institutions : l'Institut Curie (France), l'Hôpital Garrahan (Argentine) et l'Hôpital Sant Joan de Déu (Espagne). Le développement d'une signature de méthylation par pyroséquençage pour la classification des échantillons nous a permis d'élargir nos échantillons classés, d'une première série de 72 à notre dernière série de 102 tumeurs. L'analyse du paysage mutationnel de notre série a révélé que les tumeurs du sous-type 2 avaient plus de mutations somatiques par échantillon que les tumeurs du sous-type 1. De plus les gènes BCOR et ARID1A étaient les deux seuls gènes mutés de manière récurrente, et identifiés uniquement dans le sous-type 2. En divisant notre cohorte de tumeurs en sous-type 1 et 2, la distribution des mutations le long de RB1 était significativement différente. Par ailleurs, nous avons identifié une région de la protéine RB1 (dans le Domaine A) enrichie en mutations provenant des tumeurs du sous-type 2, avec très peu de mutations du sous-type 1. En plus, nous avons caractérisé deux événements récurrents de fusion chromosomique perturbant le gène DACH1. Les tumeurs de sous-type 2 sont caractérisées par une surexpression de TFF1, non exprimée dans la rétine normale. L'analyse par immunohistochimie de TFF1 dans des tumeurs localement invasives provenant de l'hôpital Garrahan a révélé la présence de cellules TFF1+ envahissant la région rétrolaminaire du nerf optique. Nous avons exploré un possible rôle oncogène de TFF1 dans le rétinoblastome lié à la survie cellulaire, à la migration cellulaire et à l'invasion cellulaire, qui n'a finalement pas été mis en évidence in vitro. Le sous-type moléculaire 2 regroupe les tumeurs MYCN amplifiées et les tumeurs avec une activation de la voie de signalisation MYC et des gènes cibles de MYC. L'utilisation de JQ1 et OTX015 (inhibiteurs des protéines BET) a fortement réduit la viabilité in vitro de lignées cellulaires de rétinoblastomes représentatives du sous-type 2, avec une régulation négative significative du gène et de la protéine MYC/MYCN. Nos résultats préliminaires suggèrent une nouvelle piste thérapeutique par l'inhibition des protéines BET dans le rétinoblastome. Les modèles précliniques largement utilisés dans la recherche sur le rétinoblastome n'ont pas été caractérisés ou classés au niveau moléculaire. Nous avons utilisé la même approche que pour la classification des tumeurs primaires et avons constaté que la plupart des modèles cellulaires et PDX étudiés étaient classés dans le sous-type moléculaire 2 et partageaient des caractéristiques moléculaires, génomiques et protéiques trouvés dans les tumeurs primaires de ce sous-type moléculaire. En conclusion, nous avons pu caractériser de façon plus approfondie le sous-type 2 des rétinoblastomes, qui semble présenter un phénotype plus agressif et qui est le sous-type représenté dans les modèles précliniques analysés. / Retinoblastoma (RB) is a rare pediatric cancer of the developing retina that represents the most common intraocular tumor in children, and accounts for about 4% of all childhood cancers. Although being a rare disease, the Curie Hospital (the referral center for retinoblastoma in France) treats about 50-60 new patients each year. Our group has previously characterized two retinoblastoma subtypes. The cone-like or subtype 1 tumors rather differentiated and homogenous, presenting an overexpression of genes related to cone photoreceptor retinal cells, clinically diagnosed earlier and grouping the majority of hereditary and bilateral forms. The mixed-type or subtype 2 tumors, displaying an intra-tumoral heterogeneity and showing overexpression of genes related to cone and retinal ganglion cells, are enriched in unilateral patients clinically diagnosed at older ages. The general goal of my thesis was to extend the molecular characterization of these subtype 2 retinoblastomas. We characterized the molecular and genomic landscape of retinoblastoma in a series of 102 primary tumors, integrating samples from three institutions: the Curie Institute (France), the Garrahan Hospital (Argentina) and Sant Joan de Déu Hospital (Spain). The development of a pyrosequencing-based tool for sample classification allowed us to enlarge our classed samples, from an initial series of 72, to our final series of 102 tumors. Analysis of the mutational landscape in our series revealed that tumors from the subtype 2 had significantly more somatic mutations per sample than tumors from the subtype 1. Besides RB1 gene, BCOR and ARID1A where the only two recurrently mutated genes, and identified only in the subtype 2. Distribution of mutations alongside the RB1 gene has so far been analyzed in terms of a single group of retinoblastomas. When splitting our cohort in subtype 1 and subtype 2 tumors, the distribution of mutations was significantly different. Besides, we identified a region of the RB1 protein (in Domain A) enriched in mutations from tumors of the subtype 2, and devoid of mutations of the subtype 1. Besides somatic mutations, we characterized two recurrent chromosomal fusion events disrupting DACH1. Subtype 2 tumors are characterized by an overexpression of TFF1, not expressed in the normal retina. Immunohistochemical analysis of TFF1 in locally invasive tumors coming from the Garrahan Hospital revealed the presence of TFF1+ cells invading the retrolaminar region of the optic nerve. We then explored a possible oncogenic role of TFF1 in retinoblastoma related to cell survival, cell migration and cell invasion, which was not fully uncovered. Molecular subtype 2 regroups the MYCN amplified tumors and tumors with MYC signaling pathway activation and upregulation of hallmark MYC target genes. The use of JQ1 and OTX015 (BET bromodomains inhibitors) strongly reduced the viability in vitro of retinoblastoma cell lines representatives of the subtype 2, together with a significant MYC/MYCN gene and protein downregulation. We provided preliminary results to explore a new therapeutic avenue of BET protein inhibition in retinoblastoma. Preclinical models widely used in retinoblastoma research has not been characterized or classified at the molecular level. We have used the same approach as for primary human tumor’s classification, and found that most cellular and PDX models studied classed in the molecular subtype 2 and shared many of the molecular, genomic and protein characteristics found in primary tumors of this molecular subtype. Taken together, we have performed a deeper characterization of subtype 2 retinoblastomas, which seems to represent a more aggressive phenotype, and is the represented subtype in the preclinical models analyzed.