Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Dulce Helena Ferreira de Souza / Resumo: Este trabalho teve como objetivo identificar fatores de transcrição envolvidos na via metabólica do glicogênio no fungo Neurospora crassa durante o crescimento vegetativo e na condição de choque térmico. Para isso foi utilizado uma coleção de 139 linhagens mutantes do fungo, as quais possuem genes codificadores de fatores de transcrição individualmente nocauteados. O conteúdo de glicogênio de todas as linhagens foi determinado tanto a 30ºC, temperatura fisiológica de crescimento, quanto a 45ºC, situação de choque térmico. Do total das linhagens analisadas, 10 apresentaram um perfil distinto daquele observado na selvagem. Com o objetivo de verificar o envolvimento dos fatores de transcrição identificados na expressão do gene que codifica a enzima glicogênio sintase (gsn), experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram que do total de linhagens analisadas, 3 apresentaram diferenças na transcrição de gsn, sugerindo que os fatores de transcrição nocauteados nestas linhagens atuam diretamente na regulação da transcrição do gene. As linhagens mutantes selecionadas foram avaliadas quanto ao crescimento e comparadas à linhagem selvagem. Todas as linhagens selecionadas apresentaram uma taxa de crescimento bastante semelhante à linhagem selvagem, exceto a linhagem FGSC011062 (ORF NCU09739), a qual apresentou uma taxa de crescimento muito reduzida. Ferramentas de bioinformática disponíveis na internet foram utilizadas para a dedução teórica das características bioquímicas, moleculares e estruturais dos fatores de transcrição selecionados, tais como ponto isoelétrico, massa molecular, sinais de localização nuclear clássicos e a presença de domínios conhecidos. A análise por Blastp revelou que apenas 2 das 10 ORFs selecionadas codificam fatores de transcrição com função conhecida e as demais codificam proteínas hipotéticas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this work was to identify transcription factors involved in the glycogen metabolic pathway of the fungus Neurospora crassa. We used a collection of 139 mutant strains, in which each strain has a gene codifying for transcription factor individually knockedout. The glycogen content was quantified during the vegetative growth (30ºC), and after a stress condition such as heat shock (transfer for 30ºC to 45ºC). Of all analyzed strains, 10 showed a pattern of glycogen accumulation distinct of the one observed for the wild type strain. To verify the involvement of the transcription factors identified in the expression of the gene encoding glycogen synthase (gsn), Northern blot experiments were performed and revealed that 3 strains showed differences in gene transcription, either before or after heat shock. The results suggested that the transcription factors knocked-out in the strains might act directly in the regulation of the gsn gene transcription. The growth of the selected mutant strains was evaluated and compared to the wild type strain. Most of the selected mutant had a growth rate similar to the wild type strain, except the strain FGSC01162 (ORF NCU09739), which showed a reduced growth rate. Online bioinformatics tools were used to predict the biochemical parameters, such as isoeletric point and molecular weight, as well protein domain, such as classic nuclear localization signal (cNLS). Analysis by Blastp revealed that 2 from 10 selected ORFs codify transcription factors having functional roles in public databases: the ORF NCU08000 codifies the cutinase transcription factor 1α that is involved in the induction of the expression of cutinases genes by fatty acids in ascomycetes, and the ORF NCU06971 codifies the protein XlnR a transcription factor responsible for the transcription activation of genes involved in the xylan degradation. The results described... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Richard Garratt / Banca: Jonas Perales / Banca: Humberto D'Muniz / Banca: Marcia Gallaci / Resumo: O envenenamento por picadas de serpentes é um importante problema de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais. Aspectos científicos, médicos e sociais relacionados ao envenenamento por serpentes do gênero Bothrops são especialmente importantes no Brasil já que estes animais são responsáveis por aproximadamente 90% dos acidentes ofídicos relatados em nosso país. Um dos principais problemas relacionados ao acidente botrópico é o proeminente dano tecidual local cuja patogênese é complexa e envolve a ação combinada de uma variedade de componentes do veneno. As fosfolipases A2 (PLA2s) são os componentes mais abundantes no veneno e tem papel fundamental quando se trata do estabelecimento de lesão muscular. O presente trabalho descreve estudos estruturais com miotoxinas que adotam enovelamento de PLA2s (PLA2s homólogas) com o objetivo de melhor entender a relação estrutura - função destas toxinas. Para tanto, estudos estruturais por cristalografia de difração de raios X com Lys49-PLA2s de venenos botrópicos complexadas com os inibidores manganês e ácido rosmarínico (AR) foram realizados. A estrutura cristalográfica de uma miotoxina Asp49-PLA2 homóloga complexada com cálcio também foi elucidada. Adicionalmente, o arranjo quaternário de miotoxinas Asp49-PLA2s homólogas do gênero Bothrops foi revisado e características estruturais relevantes para a expressão da miotoxicidade destas proteínas foram apontadas. A estrutura cristalográfica do complexo formado entre uma Lys49-PLA2 e o inibidor AR evidencia que este inibidor interage com a proteína na entrada de uma dos canais hidrofóbicos do dímero protéico, estabelecendo ligações de hidrogênio com átomos dos resíduos Phe3, Lys7, Leu10, Gln11 e Gly15 do monômero com a qual interage. Já no... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Envenoming resulting from snakebites is an important public health problem in many tropical and subtropical countries. Scientific, medical and social aspects related to envenoming by snakes from Bothrops genus are especially important in Brazil because these animals are responsible for approximately 90 % of all ophidian accidents reported in our country. One of the main problems regarding bothropic accidents is a prominent local tissue damage whose pathogenesis is complex and involves the combined action of a variety of venom components. Phospholipases A2 (PLA2s) are the most abundant muscle-damaging components of these venoms playing a central role in the muscle damage establishment. The present work reports structural studies with myotoxins that adopt a PLA2 fold (PLA2- like myotoxins) aiming a better understanding of their structure-function relationship. For this purpose, X-ray crystallographic studies of Lys49-PLA2s from bothropic snake venoms complexed to the inhibitors manganese and rosmarinic acid (RA) were performed. The crystallographic structure of the complex formed between an Asp49-PLA2-like myotoxin and calcium was also solved. Additionally, the quaternary assembly of Asp49-PLA2-like myotoxins from Bothrops genus was reviewed and relevant structural features for their myotoxicity expression were pointed out. The crystallographic structure of the complex formed between a Lys49-PLA2 and the inhibitor RA demonstrates that the inhibitor interacts with the protein in the entrance of one of its hydrophobic channel, establishing hydrogen bonds with atoms of the residues Phe3, Lys7, Leu10, Gln11 and Gly15 of the monomer with which it interacts. For the complex formed between a Lys49-PLA2 and the inhibitor Mn2+ the manganese ion is coordinated by atoms of the... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Banca: Paulo Sergio Rodrigues Coelho / Resumo: O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e é essencial para a viabilidade celular. Este fator é a única proteína conhecida que sofre uma modificação pós-traducional única e necessária para a função de eIF5A, em que uma lisina específica é convertida em um resíduo de hipusina pela ação das enzimas desoxi-hipusina sintase (Dys1) e desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1). Inicialmente, eIF5A foi relacionada à etapa do início da tradução, porém, dados recentes sugerem a sua atuação na etapa de elongação ao invés de início. No entanto, além do fato de a função específica de eIF5A na célula não ser conhecida, o papel da hipusinação para o funcionamento de eIF5A também não é conhecido. Diante disso, o objetivo deste trabalho é caracterizar mutantes condicionais para o gene da desoxi- hipusina sintase e, dessa forma, contribuir para o entendimento não só da função da hipusinação sobre eIF5A, mas também para o entendimento da função específica de eIF5A na célula. Para isso, foram iniciadas análises de caracterização fenotípica com os alelos dys1Δ1-28 e dys1W75R/T118A/A147T (dys1-1). Inicialmente, foi realizada a subclonagem do alelo dys1Δ1-28 , uma vez que, por ter sido identificado em um rastreamento de duplo-híbrido, este alelo estava em fusão com a região codificadora do domínio de ativação de Gal4. Porém, após realização da subclonagem, ou seja, quando na ausência do domínio de ativação, este alelo não apresentou o fenótipo condicional de crescimento inicialmente observado. Portanto, o mutante se tornou impróprio para a realização dos ensaios subsequentes e foi descartado. Em seguida, foram iniciadas as análises com o alelo dys1-1, nas quais foi observada diminuição nos níveis totais de Dys1 mutada, e consequentemente, diminuição nos níveis de hipusinação. Devido a isso ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archaea to mammals and is essential for cell viability. This factor is the only known protein that undergoes an unique and essential post-translational modification, in which a specific lysine residue is converted into hypusine by the action of the enzymes deoxyhypusine synthase (Dys1) and deoxyhypusine hydroxylase (Lia1). Initially, eIF5A was related to the initiation step of translation, however, recent data suggest a role in the elongation step of translation. However, besides the fact that the specific function of eIF5A in the cell is still obscure, the role of hypusination in eIF5A function is unknown. Thus, the goal of this project is to characterize conditional mutants of the deoxyhypusine synthase gene and thereby contribute to the understanding not only the function of hypusination in eIF5A, but also of the specific role of eIF5A in the cell. We started a phenotypic characterization of two different alleles: dys1Δ1-28 and dys1W75R/T118A/A147T (dys1-1). Initially, we performed a subcloning of the allele dys1Δ1-28 , once the allele was fused with the coding region of GAL4 activation domain, due to the fact that this allele is devived of a two-hybrid screening. However, after performing the subcloning, that is, in the absence of the activation domain, this allele showed no conditional growth phenotype as originally observed. Therefore, this mutant has become improper to carry out the subsequent analysis and was discarted. Then, the analyses with dys1-1 allele were initiated, in which it was observed a decrease in total levels of Dys1 and, consequently, a decrease in the hypusination levels. Because of that, this allele shows a decrease in cell growth rate and growth arrests after 24 hours in medium lacking the osmotic regulator. However, this growth arrest is not followed by cell lysis. Furthermore, the mutant ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Susana Marta Isay Saad / Banca: Claudia Dorta / Banca: Maria de Lourdes Corradi Custodio da Silva / Banca: Ivanise Guilherme Branco / Resumo: Xanthomonas são bactérias que produzem o biopolímero denominado xantana que apresenta grande aplicabilidade em vários setores industriais. Essas bactérias não apresentam grandes exigências nutricionais, mas os nutrientes disponíveis no meio interferem no processo de biossíntese da xantana. Assim, o presente trabalho objetivou estudar a influência da composição do meio de produção sobre a composição química, massa molecular e qualidade da goma produzida por Xanthomonas campestris pv. campestris. Também foram avaliados alguns parâmetros do processo de obtenção desse biopolímero como: modos de extração, temperatura e a comparação entre incubadora orbital e fermentador para produção da xantana. A fermentação foi conduzida em duas etapas, crescimento da biomassa inoculante e produção do biopolímero através de meios formulados por delineamento experimental e citados na literatura. Verificou-se que os nutrientes utilizados no meio de produção interferem na composição química e massa molecular da goma produzida. A ausência da fonte de nitrogênio e a presença de pouco citrato (0,1%) e de lecitina de soja (0,001%) favoreceram a formação da goma xantana mais viscosa que a produzida em meio descrito na literatura. Esta goma de qualidade superior apresentou massa molecular dez vezes maior (1,17 x 106 g/mol), e em sua estrutura havia mais acetil e menos piruvil que a goma produzida no meio já citado. O uso de sais (NaCl e KCl) e formaldeído na etapa de extração da goma permitiu a precipitação de uma maior quantidade de xantana. No entanto, ambos interferiram negativamente em sua viscosidade. A adição de sais durante a solubilização da goma não provocou alterações significativas na viscosidade da mesma. Em relação à temperatura, a produção realizada a 25ºC favoreceu o crescimento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Xanthomonas are producer bacteria of biopolymer denominated xanthan gum that has great applicability in several industrial sections. Those bacteria do not present great nutritional demands, but the available nutrients in the medium interfere in the process of xanthan biosynthesis. The present work aimed to study the influence of the composition of production medium on the chemical structure, molecular mass and quality of the gum produced by Xanthomonas campestris pv. campestris. Other parameters that involve xanthan production also were studied as: extraction, temperature and the use of shaker incubator or reactor. The fermentation was carried out in two stages, biomass growthing and biopolymer production using media formulated by experimental design and media mentioned in the literature. It was verified that the nutrients used in the production medium interfere in the chemical composition and molecular mass of the produced gum. The absence of the nutrient nitrogen and the presence of little citrate (0.1%) and lecithin (0.001%) favored the formation of the xanthan more viscous than the gum produced in medium described by Garcia-Ochoa et al. (1992). This better gum presented molecular mass ten times larger (1.17 x 106 g/mol), and structure with more acetate and less piruvate than the gum produced in the last medium mentioned. The use of salts (NaCl and KCl) and formaldehyde in extraction of the gum allowed the precipitation of a larger amount of xanthan, however, both interfered negatively in her viscosity. The salts addition during the gum solubilization did not provide significant alterations in the viscosity. In relation to the temperature, the production conduced at 25ºC favored the cellular growth and the gum production, but at 30ºC the xanthan of better quality was formed. The comparative study... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Margarete Teresa Gottardo de Almeida / Banca: Gilda Maria Barbaro Del Negro / Banca: Fernando Góngora Rubio / Resumo: As Infecções relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) estão entre as principais causas de morbidade e de mortalidade em ambiente hospitalar. Neste panorama, destacam-se as fungemias, que são estabelecidas quando há um comprometimento da resposta da resposta imune do hospedeiro. Os avanços médicos nas últimas duas décadas melhoraram a sobrevida dos pacientes críticos, o que levou a um aumento de infecções em UTI. O método diagnóstico atualmente utilizado para este tipo de infecção (hemocultura) é lento e apresenta baixa sensibilidade. Demais alternativas de diagnóstico rápido são essenciais por permitir a adoção da terapia antimicrobiana correta e diminuir o tempo de internação, evitando gastos e sobrecarga ao sistema de saúde. Deste modo, métodos moleculares são promissores por serem mais rápidos, precisos e sensíveis. Sendo assim, o objetivo geral deste estudo foi avaliar comparativamente técnicas laboratoriais diagnósticas para fungemia - método molecular (nested PCR) versus cultura - e associar aos aspectos clínicos dos pacientes, tempo de realização e custos. A população foi composta por 89 pacientes, sendo 67 provenientes de UTI Geral e 22 de UTI Neonatal, todos com suspeita de infecção sistêmica. Foram colhidas 118 amostras de sangue no total. Parte deste sangue era enviada ao Hospital, seguindo a rotina de hemocultura. Outra parte era destinada a realização da metodologia molecular. Após padronização, foi obtido como limiar de detecção da técnica, 10 células fúngicas por 4 ml de amostra. Em 46 (51,7%) foi detectada fungemia pelo nested PCR. Correlacionando com os fatores de risco, as doenças de caráter pulmonar, cardíaco e renal foram as doenças de base prevalentes; enquanto que o uso de cateter venoso central, ventilação mecânica e terapia antimicrobiana prévia foram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Health-care associated infections (HAI) are among the leading causes of morbidity and mortality in a hospital environment. Medical advances over the past two decades have improved the survival of critically ill patients, which led to an increase of infections in ICU. In this scenario, stand out the fungemias, which are established when there is an impairment of host immune response. The diagnostic method currently used for this type of infection (blood cultures) is slow and has low sensitivity. A rapid diagnosis is essential to allow the adoption of the correct antimicrobial therapy and reduce hospitalization time, avoiding expenses and a burden the health-care system. Therefore, molecular methods for diagnosis are promising because they are faster, more accurate and more sensitive than conventional methods. Thus, the main objective of this study was to comparatively evaluate laboratory diagnostic techniques for fungemia - molecular method (nested PCR) versus culture - in association with clinical features of patients, performance time and its costs. The population consisted of 89 patients, 67 from General ICU and 22 from Neonatal ICU, all with suspicion of systemic infection. Were collected a total of 118 blood samples. A portion of this blood was sent to hospital, following the normal routine. Another part was destined to realization of the molecular method. After standardization, the detection threshold found was 10 fungal cells per 4 ml of sample. Considering the patients, in 46 (51.7%) fungemia was detected by nested PCR. Correlating with risk factors, pulmonary, cardiac and renal diseases were the most relevant underlying diseases; whereas, the use of central venous catheters, mechanical ventilation and prior antimicrobial therapy were the most important clinical features. In comparison, both methods... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e é essencial para a viabilidade celular. Este fator tem sido associado com o início da tradução, proliferação celular, transporte nucleocitoplasmático e decaimento de mRNA. Estudos recentes associam eIF5A com a elongação, ao invés do inicio da tradução. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado pelas enzimas desoxihipusina sintase e desoxihipusina hidroxilase. O objetivo deste estudo foi a caracterização estrutural e funcional de eIF5A de S. cerevisiae. Primeiramente, a estrutura terciária de eIF5A foi determinada por cristalografia e foi demonstrada a sua dimerização em solução, independentemente do resíduo hipusina. Foram obtidos e caracterizados 40 mutantes novos de eIF5A, dos quais 19 não complementaram o nocaute do gene selvagem, 13 apresentaram fenótipo de termossensibilidade e 8 não apresentaram nenhuma alteração nos fenótipos investigados. A maioria dos mutantes novos tem seus fenótipos resultantes da degradação da proteína eIF5A. Curiosamente, este é o primeiro estudo que sugere que a α-hélice presente no C-terminal de eIF5A é essencial para a manutenção da sua estrutura. Descrevemos também, que a extensão N-terminal de eIF5A, presente apenas em eucariotos, não é essencial para estrutura e função dessa proteína. Além disso, os mutantes contendo substituições na alça onde está localizado o aminoácido hipusina são inviáveis ou termossensíveis. Embora estes mutantes produzam eIF5A, inclusive na temperatura não permissiva, a proteína produzida não é hipusinada. Finalmente, dois mutantes termossensíveis (tif51AK56A e tif51AQ22H/L93F) produzem a proteína eIF5A estável na temperatura não permissiva, no entanto, apresentam... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archae to mammals and is essential for cell viability. This factor has been associated with translation initiation, cell proliferation, nucleocytoplasmatic transport and mRNA decay. Recent studies show eIF5A involved in elongation, rather than translation initiation. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid residue hypusine, generated by the enzymes deoxyhypusine synthase and deoxyhypusine hydroxylase. The main goal of this study was the structural and functional characterization of S. cerevisiae eIF5A. First of all, the tertiary structure of eIF5A was determined by crystallography and this protein was defined as a dimer in solution, independently of the hipusine residue. We obtained and characterized 40 new mutants, which 19 cannot complement tif51A knockout cells, 13 are temperature-sensitive and 8 show no detectable phenotype. The phenotypes of most mutantes are caused by protein folding defects. Interestingly, this is the first study suggesting that the C-terminal -helix present in yeast eIF5A may be an essential structural element. Moreover, we describe that the eIF5A N-terminal extension present only in eukaryotic homologues is not essential in yeast. Furthermore, the mutants containing substitutions surrounding the hypusine modification site showed unviable or temperature-sensitive phenotypes. Although these mutant proteins were stable, they were defective in hypusine modification. Finally, two of the temperature-sensitive mutant strains (tif51AK56A and tif51AQ22H/L93F) produced stable eIF5A protein but showed defects in growth and protein synthesis and these mutants revealed polysome profile defect similar to that described for mutations in factors involved in translation... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Sandro Roberto Valentini / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Paulo Sergio Rodrigues Coelho / Banca: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Banca: Beatriz Amaral de Castilho / Doutor

Orientadora: Sonia Marli Zingaretti Di Mauro / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Renê de Oliveira Beleboni / Resumo: A cultura da cana-de-açúcar é de grande importância econômica nas regiões tropicais e subtropicais, especialmente para alguns países da América, como o Brasil, que é atualmente o maior produtor mundial. Estresses abióticos, como a seca, podem reduzir os rendimentos das lavouras. Sendo assim, a identificação e a compreensão dos mecanismos de tolerância à seca são fundamentais no desenvolvimento de novas cultivares comerciais mais tolerantes ao déficit hídrico. O objetivo deste trabalho foi identificar, através da técnica de macroarranjos de cDNA, o perfil de expressão de genes pertencentes a diferentes vias metabólicas em folhas de duas cultivares de cana-de-açúcar (Saccharum spp), uma tolerante ao estresse por déficit hídrico (SP83-2847) e outra sensível (SP90-1638) submetidas a dois períodos de restrição no fornecimento de água, ocasionando um estresse por déficit hídrico leve (T1) e severo (T2). Por meio das análises dos resultados foi possível identificar, na cultivar tolerante, a indução de ESTs (etiquetas de seqüências expressas) com similaridade a genes de enzimas de síntese de osmoprotetores, tais como prolina, hidroxiprolina e GABA (ácido g-aminobutírico); de hormônios vegetais como o ácido abscísico (ABA) e o ácido jasmônico (JA) e repressão de ESTs similares aos genes das enzimas de biossíntese de amido, de glicina betaína e de algumas enzimas do sistema de defesa antioxidante. Ao passo que, na cultivar sensível foram induzidas ESTs similares aos genes de enzimas de síntese dos osmoprotetores trealose e glicina betaína; do sistema de defesa antioxidante e reprimidas ESTs com similaridade a genes das enzimas de síntese de prolina, hidroxiprolina e GABA e envolvidas na biossíntese de ABA e de jasmonatos. Em ambas as cultivares, ESTs similares a genes de diferentes enzimas fotossintéticas foram reprimidas. / Abstract: Sugarcane crop is of large economic importance in the tropical and subtropical regions, especially in some countries of Central and South America as Brazil, which is actually the major worldwide producer. Abiotic stress, such as drought, can reduce yield of the farmings. Thus, identification and understanding of the drought tolerance mechanisms is crucial to the development of new commercials cultivars more tolerant to water deficit. The aim of this study was to identify, using cDNA macroarrays technique, expression profile of genes involved in distinct metabolic pathways in leaves of two sugarcane (Saccharum spp) cultivars, one water stress tolerant (SP83-2847) and another water stress sensitive (SP90-1638) which were submitted to periods of withhold watering occasioning a mild (T1) and severe (T2) water deficit stress. Through the analysis of the results, it was identified in the tolerant cultivar up-regulated ESTs similar to genes of enzymes involved in the synthesis of osmoprotectants, such as proline, hydroxyproline, GABA (g-amino butyric acid), of synthesis of plant hormones as abscisic acid (ABA) and jasmonic acid (JA); and down-regulated ESTs similar to genes of enzymes of the biosynthesis of starch, glycine betaine and of some enzymes involved antioxidant defense system. In the other hand, ESTs similar to genes of enzymes involved in the biosynthesis of the osmoprotectants as trehalose and glycine betaine and enzymes from the antioxidant defense system were induced as well as were down-regulated ESTs similar to genes of enzymes of synthesis of proline, hydroxyproline and GABA and involved in biosynthesis of ABA and jasmonates, for the sensitive cultivar. In both cultivars, ESTs with similarity to genes of different photosynthetic enzymes were repressed. / Mestre

Resumo: Os vírus pertencentes ao gênero Begomovirus da família Geminiviridae são transmitidos pela mosca-branca Bemisia tabaci Gennadius, atualmente constituem um dos problemas fitossanitários mais sérios em diversas culturas. A mosca-branca encontra-se disseminada em todas as principais regiões produtoras de hortaliças do Brasil. No estado de São Paulo, em 2005, plantas de pimentão mostrando sintomas de deformação dos frutos, folhas e mosaico foliar, apresentaram-se infectadas por begomovírus. Até então, no Brasil, a infecção de pimentão por vírus deste gênero havia sido verificada apenas nos estados de Pernambuco e Bahia, no ano de 1997. Amostras de plantas de pimentão foram coletadas nos campos de produção localizados nos municípios de Paranapanema, Piraju, Alvinlândia, Ubirajara, Elias Fausto, Mogi Guaçu, Paulínia e Botucatu, no período de novembro de 2004 a maio de 2006, com finalidade de detecção e verificar a variabilidade genética dos begomovírus infectando esta cultura. A detecção de begomovírus foi realizada por meio de PCR com oligonucleotídeos universais e seqüenciamento de parte da região codificadora para a proteína capsidial. Do total de 228 plantas coletadas, foram encontradas 30 amostras positivas de begomovírus, sendo que seqüências de 23 isolados apresentaram uma identidade de nucleotídeos de 98 a 100% com o Tomato severe rugose virus (ToSRV) e dois isolados, um proveniente da região de Alvinlândia e outro de Mogi Guaçu, apresentaram maior identidade (98 e 95% respectivamente) com a provável espécie Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). O DNA-A do isolado ToSRV[PJU] coletado de pimentão Lilac da região de Pirajú apresentou identidade de nucleotídeos de 99% com outro isolado de ToSRV (DQ207749) proveniente de pimenta e 97% com um isolado de ToSRV (AY029750) proveniente de tomate... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The viruses belonging to the genus Begomovirus, of the family Geminiviridae, are transmitted by the whitefly Bemisia tabaci Gennadius, and considered one of the most important fitossanitary problems for several crops. The whitefly is disseminated throughout the country. In São Paulo State, 2005, pepper plants showing fruits deformations, and mosaic on the leaves were infected by begomovirus. Until then in Brazil, the infection of begomovirus in pepper was only reported in 1997, in Pernambuco and Bahia States. Pepper plants were collected in Paranapanema, Piraju, Alvinlândia, Ubirajara, Elias Fausto, Mogi Guaçu, Paulínia and Botucatu, in the period of November of 2004 to May of 2006, with the aim to study the genetic variability of the begomovirus infecting this culture. The begomovirus were detected by PCR using universal oligonucleotídeos and the coat protein region was sequenced. On the total of 228 samples, they were found 30 positive samples of begomovírus, and sequences of 23 isolated presented nucleotides identies of 98 to 100% with Tomato severe rugose virus (ToSRV), while two isolates, one of Alvinlândia and another of Mogi Guaçu, showed identity highest nucleotide (98 and 95% respectively) with the tentative species Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). The nucleotide sequence of the DNA-A of ToSRV[PJU] from pepper cv. Lilac of Pirajú has 99% nucleotide identies with other isolate of ToSRV (DQ207749) collected from pepper and 97% with an isolate of ToSRV (AY029750) from tomato. The sequence of the DNA-B revealed identity of 98% with the DNA-B of ToRMV (AF291706) from Triângulo Mineiro, Minas Gerais and 95% with ToSRV (AY029751). Sap-transmission was verified for Nicandra physaloides and pepper ‘Magda' using infected N. benthamiana as source. By whitefly the virus was transmitted to Lycopersicum esculentum... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Marcelo Agenor Pavan / Coorientador: Renate Krause Sakate / Banca: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Murilo Francisco Zerbini Junior / Banca: Romulo Fujito Kobori / Banca: Valdir Atsushi Yuki / Doutor

Orientador: Sandro Roberto Valentini / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Paulo Sérgio Rodrigues Coelho / Banca: Flávio Henrique da Silva / Banca: Iran Malavazi / Banca: Carla Columbano de Oliveira / Resumo: O provável fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial, em que uma lisina específica é convertida em um resíduo de hipusina. Este fator já foi relacionado ao transporte nucleocitoplasmático, à degradação de mRNA e à proliferação celular. Dados recentes restabelecem uma função para eIF5A na tradução e sugerem a sua atuação na etapa de elongação ao invés de início, como originalmente proposto. Uma vez que o envolvimento de eIF5A com o degradação de mRNA ainda não foi elucidado, tornou-se interessante estudar qual a natureza desta relação. O metabolismo de mRNA é um processo complexo que envolve as etapas da tradução (mRNAs nos polissomos), repressão da tradução (mRNAs acumulados em grânulos de estresse) e degradação de mRNA (mRNAs nos P bodies). Os componentes da maquinaria de degradação de mRNA acumulam-se nos P bodies e, neste trabalho, foi verificado que eIF5A não se localiza nestes corpúsculos. Ainda, foi avaliada a formação de P bodies no mutante tif51A-3, na temperatura não permissiva (38ºC), e foi verificada uma inibição na formação de P bodies. Outros mutantes com defeitos na elongação da tradução, como cca1-1 e eft2H699K, também apresentaram defeito na agregação dos P bodies. Foi avaliada a existência de interação genética sintética entre os mutantes tif51A-1 e tif51A-3 e mutantes de fatores envolvidos com a repressão da tradução e/ou degradação de mRNA. Foi revelada uma supressão parcial do fenótipo de termossensibilidade com nocautes dos genes SBP1, DHH1 e PAT1, que codificam fatores ativadores da remoção do capacete e repressores da tradução. Por outro lado, uma interação sintético doente entre os mutantes tif51A-1 e xrn1Δ foi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The putative translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archaea to mammals and undergoes an unique and essential post-translational modification, in which a specific lysine residue is converted into a hypusine residue. This factor has been involved in several cellular processes such as nucleocytoplasmic transport, mRNA decay and cell proliferation. Recent data have re-established a function for eIF5A in translation and suggests a role in elongation rather than initiation as originally proposed. Since the involvement of eIF5A with mRNA decay has not been elucidated it has become interesting to study the aspects of this relationship. mRNA metabolism is a complex process that involves the steps of translation (mRNAs on the polysomes), translation repression (mRNAs accumulated in granules) and mRNA degradation (mRNAs in P bodies). The mRNA degradation machinery accumulates in P bodies and in this study we have verified that eIF5A is not localized inside them. P bodies assembly was evaluated in the tif51A-3 mutant at non-permissive temperature and this aggregation was inhibited. Other mutant strains with defects in translation elongation, such as cca1-1 e eft2H699K, also presented defective P body assembly. The existence of synthetic genetic interactions between the eIF5A mutants, tif51A-1 and tif51A-3, and translation repression and/or mRNA decay mutants was evaluated. A partial suppression of the temperature sensitive phenotype of the eIF5A mutants was revealed when SBP1, DHH1 and PAT1 genes were deleted. Since those proteins are decapping activators and translational repressors these interactions reveal a putative function for eIF5A as an inhibitor of translation repression. However, a synthetic sick phenotype between tif51A-1 and xrn1Δ mutants was observed. Finally, stress granules... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Fernando Bastos / Banca: Silvia Luzia Frateschi Trivelato / Banca: Claudio Bertolli Filho / Banca: Ana Maria de Andrade Caldeira / Banca: Roberto Nardi / Resumo: O trabalho corresponde um estudo de caso (Bogdan & Biklen,1994)em que aulas de biologia de uma turma de alunos do 2 º ano do ensino médio foram sistematicamente observadas com o intuito de verificar de que forma surgem e são trabalhadas questões relativas aos avanços recentes em biologia celular e molecular (organismos transgênicos,clonagem,experiências com células tronco,projeto genoma etc.). Atenção especial foi dada às demandas formativas que esse aspecto do ensino de biologia suscita junto aos professores,tanto em nível de aprofundamento de conhecimentos em biologia celular e molecular,quanto em nível de decisões sobre como organizar abordagem e discussão de temas polêmicos e implicações éticas subjacentes.O referencial teórico para o desenvolvimento da pesquisa e análise de dados foi estruturado com base em literatura especializada sobre formação de professores (Schön &Costa,2000; Perrenoud,2000;Zaballa,A.,1998; Carvalho e Gil-Pérez,1995; entre outros). / Abstract: The work corresponds to study of case (Bogdan &Biklen,1994)in which biology classes in group o students from second year in high school were systematically observed on propose to verify how the questions relating to the recent advances in molecular and cellular biology (transgenic organisms,clonating,experiments with stem- cells,genome project,etc.)appear and worked.A special attention was given formative demands that this spect of the teaching in biology rouse among the teachers,both making deeper in the knowledge in molecular and cellular biology and the decisions about how organize the approach and discussion relating to the polemic subjects and ethic implications underlying.The theoretic reference to the development of the research and data analysis was based on specialized literature about teachers graduation (Schön &Costa,2000;Perrenoud,2000;Zaballa,A.,1998;Carvalho e Gil-Pérez,1995; et al.). / Mestre