Introdução: A cardiomiopatia hipertrófica (CH) é uma doença cardíaca estrutural primária, caracterizada por hipertrofia do ventrículo esquerdo, sem dilatação, geralmente assimétrica e predominantemente septal. Na população geral a prevalência estimada da CH é de 0,2% (1:500), correspondendo a 0,5% de todas as cardiopatias. Atualmente estão descritas mais de 1400 mutações associadas à CH em 20 genes relacionados com os miofilamentos do sarcômero, o disco-Z e o transporte de cálcio, sendo que os três mais associados são os genes MYH7, MYBPC3 e TNNT2, responsáveis por 50% do casos com diagnóstico molecular positivo no Brasil. Dessa forma, o advento de novas tecnologias de sequenciamento de DNA de alta performance promete revolucionar o diagnóstico molecular, tornando mais rápida e barata a identificação de alterações genéticas, impactando positivamente na custo-efetividade do manejo diagnóstico e terapêutico de pacientes e famílias com o diagnóstico de CH. Materiais e Métodos: Noventa e uma amostras de uma casuística de pacientes não relacionados, portadores de CH com diagnóstico molecular prévio para os 3 genes mais associados (19 positivas e 72 negativas) foram utilizadas juntamente com uma amostra referência do HapMap (NA12878) na validação de um pipeline proposto para a identificação de alterações genéticas em um painel com 74 genes associados à cardiomiopatias hereditárias, utilizando a plataforma Ion Torrent PGM. A etapa de chamada de variantes foi testada em dois limiares diferentes de cobertura de sequenciamento (30x e 10x) e três limiares de frequência de alelo variante (35%, 25% e 20%). A amostra NA12878 foi utilizada na aferição de valores de reprodutibilidade intra e inter-ensaio. As amostras da casuística de CH com diagnóstico molecular prévio negativo foram utilizadas na análise de ganho diagnóstico. Eram consideradas alterações potencialmente patogênicas aquelas que apresentassem associação prévia com CH ou classificação deletéria em dois de três algoritmos de predição de impacto funcional (PROVEAN, SIFT, PolyPhen2) e MAF<0,01, se disponível. Resultados: A plataforma de sequenciamento utilizada apresentou desempenho aceitável, gerando em média 165,9 ±13,1 Mb, com um valor médio de 146,9 ± 11,54 Mb acima de PhredQ>=20, por amostra. O valor médio de cobertura de sequenciamento por amostra foi de 250 ± 23,94x, com 95,2% das regiões alvo cobertas pelo menos 10x. A sensibilidade máxima observada para SNVs foi de 96,7% enquanto que para InDels foi 28,5%. Os valores de reprodutibilidade inter e intra-ensaio de 89,5% e 87,3%, respectivamente. Das 72 amostras negativas, 35 puderam ser reclassificadas como positivas, sendo que os dois genes com mais ocorrências de alterações genéticas foram FLNC e TRIM63, ambos já relacionados com CH. Vinte e duas amostras foram reclassificadas como inconclusivas e 15 permaneceram negativas. O ganho diagnóstico foi de 21,5%. Conclusões: A plataforma Ion Torrent PGM apresenta potencial no sequenciamento de genes relacionados à cardiomiopatias hereditárias e o pipeline validado mostrou valores analíticos praticáveis em uma rotina diagnóstica. A utilização do painel genético ampliado se mostrou viável na detecção de alterações genéticas, propiciando uma boa margem de ganho diagnóstico em comparação com o sequenciamento apenas dos três genes mais associados à CH / Introduction: Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a primary cardiac disease, mainly characterized by unexplained left ventricle hypertrophy, in the absence of dilatation, usually asymmetric and predominantly septal. The estimated prevalence is 1:500 individuals in the general population, corresponding for 0.5% of all cardiac diseases. Up to now, more than 1400 mutations are associated with HCM in 20 genes related with sarcomeric myofibrils, Z-disc and calcium homeostasis, wherein the 3 most associated genes are MYH7, MYBPC3 and TNNT2, accounting for 50% of cases with positive molecular diagnostics in Brazil. Thus, the advent of new high throughput DNA sequencing technologies promise to revolutionize the use of molecular diagnostics, turning the identification of genetic mutations in a fast and cheap practice, increasing the cost-effectiveness of diagnostic and treatment of patients and families with HCM. Materials and Methods: Ninety one samples from an HCM casuistic of unrelated individuals with previous molecular diagnostics for the three most HCM-associated genes (19 positives and 72 negatives) were processed along with a reference HapMap sample (NA12878) in the validation process of a pipeline proposed for the detection of genetic alterations in a genetic panel composed of 74 genes associated with inherited cardiomyopathies, using Ion Torrent PGM platform. The variant call step was tested for two cutoffs of sequencing coverage (30x and 10x) and three cutoffs of variant allele frequency (35%, 25% and 20%). The sample NA12878 was used in the assessment of intra and inter-assay reproducibility. Negative samples from the HCM casuistic were used in the assessment of diagnostic yield. Variants were considered potentially pathogenic if previously described as associated with HCM or if presenting a deleterious score in at least two of three impact prediction algorithms tested (PROVEAN, SIFT and PolyPhen-2) and MAF < 0.01, if available. Results: The chosen next-generation sequencing platform presented an acceptable performance, with a mean throughput of 165,9 ±13,1 Mb, with a mean value of 146,9 ± 11,54 Mb above PhredQ >= 20. Mean sequencing coverage was 250 ± 23,94x, wherein 95.2% of target bases were covered at least 10x. Maximum achieved sensitivity for SNVs was 96.7% while for InDels was 28.5%. Both values of inter and intra-assay reproducibility were 89.5% and 87.3%, respectively. Of all 72 negative samples, 35 were reclassified as positive with the two most frequently mutated genes being FLNC and TRIM63, both already associated with HCM. Twenty two samples were reclassified as inconclusive and 15 remained negatives. Diagnostic yield was 21.5%. Conclusions: Ion Torrent PGM platform presented a feasible potential for the sequencing of inherited cardiomyopathies-associated genes and the designed pipeline presented reliable analytical values for diagnostic use. The expanded panel proved to be a good strategy for the detection of genetic alteration providing a good value of diagnostic yield in comparison with the sequencing of the three most HCM-associated genes alone

Introdução: A cardiomiopatia hipertrófica (CH) é uma doença cardíaca estrutural primária, caracterizada por hipertrofia do ventrículo esquerdo, sem dilatação, geralmente assimétrica e predominantemente septal. Na população geral a prevalência estimada da CH é de 0,2% (1:500), correspondendo a 0,5% de todas as cardiopatias. Atualmente estão descritas mais de 1400 mutações associadas à CH em 20 genes relacionados com os miofilamentos do sarcômero, o disco-Z e o transporte de cálcio, sendo que os três mais associados são os genes MYH7, MYBPC3 e TNNT2, responsáveis por 50% do casos com diagnóstico molecular positivo no Brasil. Dessa forma, o advento de novas tecnologias de sequenciamento de DNA de alta performance promete revolucionar o diagnóstico molecular, tornando mais rápida e barata a identificação de alterações genéticas, impactando positivamente na custo-efetividade do manejo diagnóstico e terapêutico de pacientes e famílias com o diagnóstico de CH. Materiais e Métodos: Noventa e uma amostras de uma casuística de pacientes não relacionados, portadores de CH com diagnóstico molecular prévio para os 3 genes mais associados (19 positivas e 72 negativas) foram utilizadas juntamente com uma amostra referência do HapMap (NA12878) na validação de um pipeline proposto para a identificação de alterações genéticas em um painel com 74 genes associados à cardiomiopatias hereditárias, utilizando a plataforma Ion Torrent PGM. A etapa de chamada de variantes foi testada em dois limiares diferentes de cobertura de sequenciamento (30x e 10x) e três limiares de frequência de alelo variante (35%, 25% e 20%). A amostra NA12878 foi utilizada na aferição de valores de reprodutibilidade intra e inter-ensaio. As amostras da casuística de CH com diagnóstico molecular prévio negativo foram utilizadas na análise de ganho diagnóstico. Eram consideradas alterações potencialmente patogênicas aquelas que apresentassem associação prévia com CH ou classificação deletéria em dois de três algoritmos de predição de impacto funcional (PROVEAN, SIFT, PolyPhen2) e MAF<0,01, se disponível. Resultados: A plataforma de sequenciamento utilizada apresentou desempenho aceitável, gerando em média 165,9 ±13,1 Mb, com um valor médio de 146,9 ± 11,54 Mb acima de PhredQ>=20, por amostra. O valor médio de cobertura de sequenciamento por amostra foi de 250 ± 23,94x, com 95,2% das regiões alvo cobertas pelo menos 10x. A sensibilidade máxima observada para SNVs foi de 96,7% enquanto que para InDels foi 28,5%. Os valores de reprodutibilidade inter e intra-ensaio de 89,5% e 87,3%, respectivamente. Das 72 amostras negativas, 35 puderam ser reclassificadas como positivas, sendo que os dois genes com mais ocorrências de alterações genéticas foram FLNC e TRIM63, ambos já relacionados com CH. Vinte e duas amostras foram reclassificadas como inconclusivas e 15 permaneceram negativas. O ganho diagnóstico foi de 21,5%. Conclusões: A plataforma Ion Torrent PGM apresenta potencial no sequenciamento de genes relacionados à cardiomiopatias hereditárias e o pipeline validado mostrou valores analíticos praticáveis em uma rotina diagnóstica. A utilização do painel genético ampliado se mostrou viável na detecção de alterações genéticas, propiciando uma boa margem de ganho diagnóstico em comparação com o sequenciamento apenas dos três genes mais associados à CH / Introduction: Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a primary cardiac disease, mainly characterized by unexplained left ventricle hypertrophy, in the absence of dilatation, usually asymmetric and predominantly septal. The estimated prevalence is 1:500 individuals in the general population, corresponding for 0.5% of all cardiac diseases. Up to now, more than 1400 mutations are associated with HCM in 20 genes related with sarcomeric myofibrils, Z-disc and calcium homeostasis, wherein the 3 most associated genes are MYH7, MYBPC3 and TNNT2, accounting for 50% of cases with positive molecular diagnostics in Brazil. Thus, the advent of new high throughput DNA sequencing technologies promise to revolutionize the use of molecular diagnostics, turning the identification of genetic mutations in a fast and cheap practice, increasing the cost-effectiveness of diagnostic and treatment of patients and families with HCM. Materials and Methods: Ninety one samples from an HCM casuistic of unrelated individuals with previous molecular diagnostics for the three most HCM-associated genes (19 positives and 72 negatives) were processed along with a reference HapMap sample (NA12878) in the validation process of a pipeline proposed for the detection of genetic alterations in a genetic panel composed of 74 genes associated with inherited cardiomyopathies, using Ion Torrent PGM platform. The variant call step was tested for two cutoffs of sequencing coverage (30x and 10x) and three cutoffs of variant allele frequency (35%, 25% and 20%). The sample NA12878 was used in the assessment of intra and inter-assay reproducibility. Negative samples from the HCM casuistic were used in the assessment of diagnostic yield. Variants were considered potentially pathogenic if previously described as associated with HCM or if presenting a deleterious score in at least two of three impact prediction algorithms tested (PROVEAN, SIFT and PolyPhen-2) and MAF < 0.01, if available. Results: The chosen next-generation sequencing platform presented an acceptable performance, with a mean throughput of 165,9 ±13,1 Mb, with a mean value of 146,9 ± 11,54 Mb above PhredQ >= 20. Mean sequencing coverage was 250 ± 23,94x, wherein 95.2% of target bases were covered at least 10x. Maximum achieved sensitivity for SNVs was 96.7% while for InDels was 28.5%. Both values of inter and intra-assay reproducibility were 89.5% and 87.3%, respectively. Of all 72 negative samples, 35 were reclassified as positive with the two most frequently mutated genes being FLNC and TRIM63, both already associated with HCM. Twenty two samples were reclassified as inconclusive and 15 remained negatives. Diagnostic yield was 21.5%. Conclusions: Ion Torrent PGM platform presented a feasible potential for the sequencing of inherited cardiomyopathies-associated genes and the designed pipeline presented reliable analytical values for diagnostic use. The expanded panel proved to be a good strategy for the detection of genetic alteration providing a good value of diagnostic yield in comparison with the sequencing of the three most HCM-associated genes alone