Protein-protein interactions (PPIs) are fundamental to a wide array of biological processes, including but not limited to cellular signalling pathways, structural organization within cells, and the mechanisms of various diseases. Decoding these complex systems could pave the way for targeted therapeutic intervention but remains a technical challenge. This dissertation focused on the synergistic integration of high-throughput peptide synthesis with state-of-the- art biophysical methodologies, such as (Microscale Thermophoresis) MST, (Fluorescence Proximity Sensing) FPS, and (Temperature Related Intensity Change) TRIC. Thereby providing a robust platform for both understanding endogenous interactions at a molecular level, and for the rational design of novel effectors and probes. The core of this dissertation is dedicated to the exploration of PPIs that involve intrinsically disordered regions (IDRs), which make up a considerable part of the mammalian proteome. These IDRs often harbour short linear motifs (SLiMs) that are key players in PPIs. Using the µSPOT synthesis, peptides representing these SLiMs are generated in a cost-effective and parallelized manner. These peptides are then used with a variety of biophysical techniques, allowing for both identification of new interactors and thermodynamic and kinetic profiling. Unified by the overarching theme of integrating peptide libraries with quantitative biophysical readouts, I developed both inhibitors and synthetic affinity probes for a range of biological applications. These works collectively leverage the effective display of peptide ligands with detailed proteomic or quantitative read-outs. This was achieved by combining the versatile µSPOT synthesis techniques with mass-spectrometric (MS) and quantitative readouts, namely TRIC, FPS, and MST, thereby enabling the identification of interactors and the precise quantification of protein affinities and binding kinetics at the nanomolar scale. The value of the resulting platform was substantiated by the successful development of small molecule probes as well as multivalent, peptide-based effectors, and fluorescent probes for the specific targeting of selected proteins in various biological contexts. In summary, this dissertation established a versatile and robust biophysical platform for the high-throughput deciphering of PPIs and the development of fluorescent probes and inhibitors for the specific visualisation and modulation of selected target proteins. / Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) sind grundlegend für eine Vielzahl biologischer Prozesse, einschließlich, aber nicht beschränkt auf zelluläre Signalwege, strukturelle Organisation innerhalb von Zellen und die Mechanismen verschiedener Krankheiten. Das Entschlüsseln dieser komplexen Systeme könnte den Weg für gezielte therapeutische Interventionen ebnen, stellt jedoch eine technische Herausforderung dar. Diese Dissertation konzentrierte sich auf die synergetische Integration von hochdurchsatz-Peptidsynthese mit modernsten biophysikalischen Methoden wie Mikroskalen-Thermophorese (MST), Fluoreszenz- Näherungssensorik (FPS) und temperaturabhängiger Intensitätsänderung (TRIC). Dadurch wurde eine robuste Plattform sowohl für das Verständnis endogener Interaktionen auf molekularer Ebene als auch für das rationale Design neuer Effektoren und Sonden bereitgestellt. Der Kern dieser Dissertation widmet sich der Erforschung von PPIs, die intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) involvieren, die einen erheblichen Teil des Säugetierproteoms ausmachen. Diese IDRs beherbergen oft kurze lineare Motive (SLiMs), die eine Schlüsselrolle in PPIs spielen. Mit der µSPOT-Synthese werden Peptide, die diese SLiMs repräsentieren, auf kosteneffiziente und parallele Weise generiert. Diese Peptide werden dann mit verschiedenen biophysikalischen Techniken verwendet, was sowohl die Identifizierung neuer Interaktoren als auch die thermodynamische und kinetische Profilierung ermöglicht. Vereint durch das übergreifende Thema der Integration von Peptidbibliotheken mit quantitativen biophysikalischen Ausleseverfahren habe ich sowohl Inhibitoren als auch synthetische Affinitätssonden für eine Reihe biologischer Anwendungen entwickelt. Diese Arbeiten nutzen kollektiv die effektive Darstellung von Peptidliganden mit detaillierten proteomischen oder quantitativen Ausleseverfahren. Dies wurde erreicht, indem die vielseitigen µSPOT-Synthesetechniken mit massenspektrometrischen (MS) und quantitativen Ausleseverfahren, insbesondere TRIC, FPS und MST, kombiniert wurden, wodurch die Identifizierung von Interaktoren und die präzise Quantifizierung von Protein-Affinitäten und Bindungskinetiken im Nanomolarbereich ermöglicht wurden. Der Wert dieser Plattform wurde durch die erfolgreiche Entwicklung von kleinen Molekülsonden sowie multivalenten, peptidbasierten Effektoren und fluoreszierenden Sonden für das Abzielen auf ausgewählte Proteine in verschiedenen biologischen Kontexten untermauert. Zusammenfassend hat diese Dissertation eine vielseitige und robuste biophysikalische Plattform für das hochdurchsatz-Studium von PPIs und die Entwicklung von fluoreszierenden Sonden und Inhibitoren für die spezifische Visualisierung und Modulation ausgewählter Zielproteine etabliert.