Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective of this work was the polyunsaturated fatty acids (PUFAs) production by submerged fermentation from the fungus Mortierella isabellina. A Plackett Burman experimental design was designed to evaluate the best conditions for PUFAs production in shake flasks. Three different components of the culture medium (yeast extract, peptone, and sucrose) and three fermentation parameters (agitation, temperature and pH) were evaluated. Analyzing the results of experimental design new assays were performed with increasing concentration of yeast extract. Fermentations were conducted in Erlenmeyer flasks with 10% (v/v) inoculums for 120h, micronutrients ((NH4)2SO4, FeSO4.7H2O, MnSO4.H2O, MgSO4.7H2O) were fixed. The scale up using STR bioreactor with 2.5 L of culture medium and 10% (v/v) inoculums for 120h was defined through better results of Plackett Burman.. A 2² central composite design was set to evaluate the effect of agitation and aeration in fungal biomass production, lipids content and fatty acids profile. The lipid was extracted from dried biomass and the fatty acids were analyzed by gas chromatography. The results of the fermentation in shake flasks showed that only yeast extract had a significant effect (p <0.1) in PUFAs production and this effect was positive. The highest percentage of PUFAs produced (28.17%) was obtained in higher yeast extract concentration (3.75 g / L). Agitation and aeration did not had a significance effect (p <0.1) in the evaluated range, in bioreactor on PUFAs and lipids production. However, agitation had a significant positive effect on biomass production.The presence of fatty acids of family n-3 (α-linolenic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid) and n-6 families (linoleic acid and γ-linolenic acid) were observed. Nitrogen source is directly related to increased PUFAs production. The variables agitation and aeration, in the evaluated range, did not influence the PUFAs production. The Mortierella isabellina produced fatty acids n-3 and n-6 family, but additional studies are needed to optimize this production. / O objetivo deste trabalho foi produzir ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) por fermentação submersa a partir do fungo Mortierella isabellina. Um planejamento experimental Plackett Burman foi delineado para avaliar as melhores condições para produção de PUFAS em frascos agitados. Foram avaliados três diferentes componentes do meio de cultura (extrato de levedura, peptona e sacarose) e três parâmetros de fermentação (agitação, temperatura e pH). Através dos resultados obtidos no planejamento experimental, novos ensaios foram definidos com o aumento da concentração de extrato de levedura. As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyers com 10% de inoculo (v/v) durante 120h e a composição de micronutrientes ((NH4)2SO4, FeSO4.7H2O, MnSO4.H2O, MgSO4. 7H2O) foi mantida fixa. Na melhor condição definida em frascos agitados foi realizada a ampliação da fermentação para biorreator STR, com 2,5 L de meio de cultura e 10 % de inoculo (v/v) durante 120h. Um delineamento composto central 2² foi definido para avaliar o efeito das variáveis agitação e aeração na produção de biomassa fúngica, lipídeos e no perfil dos ácidos graxos. A fração lipídica foi extraída a partir da biomassa seca da fermentação e os ácidos graxos foram analisados por cromatografia em fase gasosa. Os resultados da fermentação em frascos agitados demonstraram que somente a variável extrato de levedura teve efeito significativo (p<0,1) na produção de PUFAs sendo este efeito positivo. O maior percentual de PUFAs produzidos (28,17%) foi obtido na maior concentração de extrato de levedura (3,75 g/L). Os resultados obtidos na fermentação em biorreator demonstraram que as variáveis agitação e aeração não foram estatisticamente significativas (p<0,1) para o acúmulo de PUFAs e lipídeos dentro das faixas avaliadas. Entretanto a agitação teve efeito significativo positivo na produção de biomassa. Foi observada a presença dos ácidos graxos da família n-3 (ácido α-linolênico, ácido eicosapentaenóico e ácido docosaexaenóico) e da família n-6 (ácido linoléico e o ácido γ-linolênico). Em vista dos resultados obtidos, pode-se concluir que a fonte de nitrogênio esta diretamente relacionada com o aumento da produção de PUFAs. As variáveis agitação e aeração nas faixas avaliadas não influenciaram no acúmulo de PUFAs. A Mortierella isabellina produziu ácidos graxos da família n-3 e n-6, entretanto estudos adicionais devem ser realizados para otimizar esta produção.

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Introduced in the 70s this model, also called biotranformation, has several advantages for their application as low cost, reduction of animals for experimentation and and higher number and range of metabolites produced. 1-(4-((1-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-4-yl)methyl)piperazin-1-yl)ethanone (LQFM030) and 4-((1-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-4-il)methyl)piperazin-1-ethyl carboxylate (LQFM018) compounds were synthesized by molecular simplification of a series of compounds with chronic myeloid leukemia antiproliferative activity already described, the Nutlins prototypes. This study aims to produce a probable human metabolites of LQFM 030 and LQFM 018 by microbial biotranformation with filamentous fungi. To do so, analytical methodologies were developed by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography in order to monitor metabolites production. After perform a screening of tem microorganisms Mortierella isabellina NRRL 1757 strain was selected to obtain metabolites on a larger scale. Incubations were carried out with 100 mL of glucose culture medium in each flask . At the end of incubation (96 h) extraction and purification of possible metabolites was performed . In an independent assay with LQFM 030, ketoconazole (10, 20 and 30 mg) was added to inhibit P450 cytochrome . In another test 1 mL of ethanol was added every 24 hours to induce cytochrome totaling 96 hours of incubation. To evaluate the best time to finalize incubation , an experiment was conducted in 168 hours with different concentrations of the substrate, 0.25 mg / mL and 50 mg / mL. A possible role of CYP 3A was evidenced by the inhibition caused by ketoconazole addition, that can inhibit the formation of N-oxide metabolite in LQFM 030 biotransformation. Ethanol addition does not induce LQFM 030-N-oxide production, but was able to induce other metabolites formation. The best time to end LQFM 030 incubation was defined as 168 hours and 0.25 mg/mL concentration. / O “Modelo Microbiano do Metabolismo Animal”, pode representar uma alternativa ao uso de animais nos estudos de metabolismo de novos candidatos a fármacos. Introduzido nos anos 70, este modelo, também denominado de biotransformação, apresenta várias vantagens para a sua aplicação como o baixo custo, a redução da utilização de animais de experimentação e maior quantidade e variedade de metabólitos produzidos. Os compostos 1-(4-((1-(4-clorofenil)-1H-pirazol-4-il)metil)piperazin-1-il)etanona (LQFM 030) e 4-((1-(4-clorofenil)-1H-pirazol-4-il)metil)piperazin-1-carboxilato de etila (LQFM 018) foram sintetizados a partir da simplificação molecular de uma série de compostos com atividade antiproliferativa frente à leucemia mielóide crônica já descrita, os protótipos Nutlins. O presente estudo objetivou a produção de prováveis metabólitos humanos do LQFM 030 e LQFM 018 através de biotransformação microbiana com fungos filamentosos. Para isso, foram desenvolvidas metodologias analíticas por cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência, a fim de se monitorar a produção dos metabólitos. Após seleção dentre dez microrganismos a cepa Mortierella isabellina NRRL 1757 foi escolhida para obtenção de metabólitos em maior escala. A incubação foi realizada com 100 mL de meio de cultura de glicose, em cada Erlenmeyer. Ao término da incubação (96 horas) foi realizada a extração e purificação dos possíveis metabólitos. Em um ensaio independente foi adicionado cetoconazol (10, 20 e 30 mg) ao meio contendo LQFM 030 com o objetivo de inibir o citocromo P450. Em outra etapa foi adicionado 1 mL de etanol a cada 24 horas para induzir o citocromo, totalizando 96 horas de incubação. Para avaliar a melhor cinética reacional, um experimento foi conduzido em 168 horas, com diferentes concentrações do substrato, 0,25 mg/mL e 50 mg/mL. A biotransformação do LQFM 030 e do LQFM 018 produziu seus respectivos N-óxidos, caracterizados por RMN 1H e 13C e EM. Uma provável participação da CYP 3A foi evidenciada através da inibição causada pela adição de cetoconazol capaz de inibir a formação do metabólito N-óxido na biotransformação do LQFM 030. A adição de etanol não induziu a produção do LQFM 030-N-óxido, contudo foi capaz de induzir a formação de outros metabólitos. O melhor tempo para término da incubação do LQFM 030 foi definido como 168 hrs e 0,25 mg/mL de concentração.