Les processus moléculaires mis en jeu lors de maladies de surcharge lysosomale (MSL) et qui conduisent à des dysfonctions neuronales sont peu connus. Afin de mieux comprendre comment s’opèrent ces dysfonctions neuronales associées à la mucopolysaccharidose de type VII (MPS VII), une MSL causée par la déficience en l’activité enzymatique de la ß-glucuronidase, nous avons généré des neurones humains MPS VII à partir cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Grâce à la reprogrammation des fibroblastes de patients MPS VII, nous avons généré et caractérisé des neuroprécurseurs dérivés d’iPSC (NSC) et des neurones. Les iPSC MPS VII ont été positives pour les tests de pluripotence (activité de la phosphatase alcaline, expression des marqueurs de pluripotence SSEA3, TRA-2-49 et Nanog par immunofluorescence et expression des gènes de pluripotence SOX2, Oct4 et Lin28 par qRT-PCR, formation des corps embryonnaires et génération de cellules dérivées des trois feuillets embryonnaires in vivo par la formation de tératomes) et présentaient un caryotype normal. Les NSC dérivés d’iPSC exprimaient les marqueurs Nestin et SOX2, et ont été utilisés pour générer des neurones. Les neurones MPS VII exprimaient des marqueurs neuronaux comme MAP2, formaient des synapses et présentaient une activité calcium-dépendante.Afin d’identifier les dysfonctions moléculaires présentes dans la MPS VII, nous avons comparé les NSC et les neurones, avec ou sans milieu conditionné contenant l’enzyme recombinante humaine de la ß-glucuronidase (rhGUS), enzyme actuellement utilisée en phase 1/2, de chez Ultragenyx. Cette enzyme est internalisée par les cellules, rejoint leurs lysosomes et corrige les dysfonctions lysosomales de la MPS VII, restaurant ainsi un phénotype cellulaire physiologique (phénomène aussi appelé ‘enzyme replacement therapy’ (ERT)). Ces diverses conditions nous permettent d’éviter la variabilité clonale des iPSC, et de mieux identifier les déficiences neuronales, corrigées par l’ERT, qui sont associées à la MPS VII. / The molecular pathways linking lysosomal storage diseases (LSD) to neuronal dysfunction are poorly understood. To better understand neuronal dysfunction associated with mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII), a LSD due to deficiency in ß-glucuronidase activity, we generated human MPS VII neurons from induced pluripotent stem cells (iPSC). Starting from MPS VII patient fibroblasts, iPSC-derived neural stem cells (NSC) and neurons were generated and characterized. MPS VII iPSC were positive for pluripotency tests (alkaline phosphatase activity, expression of pluripotency markers SSEA3, TRA-2-49 and Nanog by immunostaining and pluripotency gene SOX2, Oct4 and Lin28 expression by qRT-PCR, embryonic bodies formation and generation of cells derivated from the three germ layers in vivo by teratoma formation) and had a normal karyotype. IPSC-derived NSC expressed the markers Nestin and SOX2, and were used to generate neurons. MPS VII neurons expressed mature neuronal markers as MAP2, formed synapses and displayed a calcium-dependent activity. To identify molecular defects in MPS VII, we compared NSC and neurons, with or without conditioned medium containing a recombinant human ß-glucuronidase (rhGUS), enzyme currently used in phase 1/2, from Ultragenyx. This enzyme is taken up by cells, reaches their lysosoms and corrects MPS VII lysosoms dysfunctions, restoring cells to healthy phenotype (phenomena also called enzyme replacement therapy (ERT)). Our assays allow us to circumvent clonal variability associated with iPSC, and to better identify neuronal defects, corrected by ERT, which are associated with MPS VII disease.

La mucopolysaccharidose de type VII (MPS VII) est une maladie génétique de surcharge lysosomale provoquée par une déficience en β-D-glucuronidase (β-glu). β-glu est impliquée dans la cascade de dégradation et de recyclage des glycosaminoglycannes (GAGs). Sa déficience provoque une accumulation vésiculaire de GAGs non dégradés engendrant in fine la mort cellulaire. Notre but est de développer et de tester la pertinence des vecteurs adénoviraux canins helper-dépendant (HD-CAV-2) pour traiter la neurodégénération provoquée par la MPS VII dans le cadre d'une thérapie génique dans le SNC de chien. Parce que les vecteurs CAV-2 transduisent préférentiellement les neurones et qu'ils sont transportés de manière rétrograde le long des axones, leurs distributions dans tout le SNC permettraient de délivrer largement la β-glu dans tout le parenchyme cérébral. Nous avons alors étudié la sureté, la durée d'expression, l'efficacité et la possible réversion du phénotype après injections dans le SNC de chiens MPS VII d'un HD-CAV-2 exprimant le gène humain de la GUSB : HD-RIGIE. Des études préliminaires ont montré la faisabilité du transfert des vecteurs HD-CAV-2 dans le SNC, qu'ils induisaient une réponse immunitaire minimale et qu'ils transduisaient préférentiellement, efficacement et largement les neurones.Nous avons produit un HD-RIGIE de qualité pour les injections intracérébrales et nous avons analysé son efficacité sur l'accumulation de GAGs non dégradés. Les injections de HD-RIGIE montrent une augmentation générale de l'activité β-glu dans tout le SNC des chiens MPS VII (sites d'injections et structures éloignées comme le cortex) et ce 1 mois ou 4 mois après les injections. L'analyse de la GFP confirme une distribution globale de HD-RIGIE dans le SNC d'animaux de grande taille. De plus, grâce aux propriétés intrinsèques de la β-glu (transport rétrograde et phénomène de libération/recapture), nous avons observé une diminution générale de l'accumulation vésiculaire neuronale des GAGs non dégradés dans tout le parenchyme cérébral. D'autre part grâce à la stratégie d'isolement et de non vaccination des chiens MPS VII, nous n'observons ni de réponse immunitaire humorale, ni d'aggravation de l'inflammation du parenchyme. / Mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) is a rare inherited lysosomal storage disease caused by β-D-glucuronidase (β-glu) deficiency. β-glu is involved in the physiological turnover of glycosaminoglycans (GAGs). Its deficiency causes accumulation of undegraded GAGs inside vesicles leading to cell death. Our goals are to develop and test the clinical relevance of helper-dependant (HD) canine adenovirus type 2 (CAV-2) vectors to treat neural degeneration caused by MPS VII in a dog model. Because CAV-2 targets preferentially neurons and traffics via axons, the distribution of the transgene throughout the CNS will allow widespread delivery of the missing lysosomal enzyme in these disorders with a minimum number of injections. We tested a HD-CAV-2 vector expressing the human GUS gene in the canine model of MPS VII for their safety, efficacy, duration of expression and possible reversion of the MPS VII induced symptoms.A previous study based on HD-CAV-EGFP vector injections in MPS VII-/- and healthy dogs showed that we are now able to inject HD-CAV-2 in the dog brain, have a minimal induction of the immune response, an efficient transduction of the neurons and an efficient biodistribution of transduced cells. After the production of a suitable vector (HD-RIGIE) for injections in the CNS of MPS VII dogs we analysed its efficiency on GAGS storage in neurons.Injections of HD-RIGIE showed after 1 month or 4 months post injections a widespread increase in general level of β-glu activity, in the sites of injections and in distant areas such as cortex. Analysis of GFP, also permit to observe a widespread biodistribution of the vector. Because of β-glu property of cross-correction we observed a global decreased in GAGs storage in the entire MPS VII brains. Finally, the dogs did not present humoral immune response and no aggravation of inflammation